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方法論記事

成人人間の脳からの短期自由浮遊スライス培養

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DOI:

10.3791/59845

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2019年11月5日

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1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

この記事について

サマリー

成人の人間の脳から自由に浮遊するスライス培養を準備するプロトコルが提示される。このプロトコルは、膜挿入物を用いた広く用いられているスライス培養法のバリエーションである。これは、シンプルで費用対効果が高く、年齢に関連する脳疾患の背後にある神経変性のメカニズムを解明することを目的とした短期アッセイを実行するために推奨されます。

要約

オルガオティピック、またはスライス培養物は、インビトロで機能する中枢神経系の側面をモデル化するために広く採用されている。神経科学におけるスライス培養の可能性にもかかわらず、成人の神経組織を用いた研究は、特にヒトの被験者からのもので、そのような培養物を調製する研究はまだ少ない。スライス培養を調製するための成人ヒト組織の使用は、げっ歯類(通常新生児)から産生されるスライスに欠ける成熟したヒト脳の典型的な特性を保持するので、ヒト神経病理学の理解を高めるために特に魅力的である神経組織。このプロトコルは、切除脳外科手術に提出された生きているヒトドナーから採取された脳組織を使用して、短期的な自由浮遊スライス培養を準備する方法を記述する。これらの培養物を用いた生化学的および細胞生物学アッセイを維持・実行する手順も提示される。代表的な結果は、典型的なヒト皮質積層がインビトロ(DIV4)で4日後にスライスに保存され、主要な神経細胞型の存在が予想されることを示す。さらに、DIV4のスライスは、有毒刺激(H2O2)に挑戦すると堅牢な細胞死を受け、このモデルが細胞死アッセイのプラットフォームとして機能する可能性を示します。この方法は、膜挿入物を使用して広く使用されているプロトコルに代わる、よりシンプルで費用対効果の高い代替手段であり、主に年齢に関連する脳疾患の背後にある神経変性のメカニズムを解明することを目的とした短期アッセイを実行するために推奨される。最後に、プロトコルは、薬剤耐性側頭葉てんかんの外科的治療に提出された患者から採取された皮質組織を使用することに専念しているが、他の脳領域/状態から採取された組織もすべきであると主張されている。同様のフリーフローティングスライスカルチャーを生成するためのソースとみなされます。

概要

研究におけるヒトサンプルの使用は、人間の脳の病理を研究するための素晴らしい選択肢であり、現代の技術は、患者由来の組織を使用して堅牢かつ倫理的な実験のための新しい方法を開きました。成人の人間の脳から調製されたオルガノチピック/スライス培養のような方法は、光遺伝学1、電気生理学2、3、4、5、可塑性などのパラダイムでますます使用されている6,7,8,9, 神経毒性/神経保護10,11,12,13, 細胞療法14,薬物スクリーニング15,16,17, 遺伝学と遺伝子編集12,18,19,20, とりわけ、 より良い戦略として成人期の神経疾患を理解する。

ヒト脳病理の根底にあるメカニズムの理解は、多数の被験者を必要とする実験戦略に依存する。逆に、スライス培養の場合、ヒトサンプルへのアクセスは依然として困難であるが、単一の皮質サンプルから最大50個のスライスを生成する可能性は、複数のボランティアを募集する必要性を部分的に回避する。収集された組織21当たりの複製および実行アッセイの数。

脳の組織学的/スライス培養のためのいくつかのプロトコルが記載されています,古典的なオキュロドラフト22,23,ローラーチューブ24,25,26, 半透過性膜インターフェイス 27、28、29、30、およびフリーフローティングスライス31、32。実験計画の特異性に応じて、各手法には独自の長所と短所があります。成人ヒト脳からの短期、自由浮遊スライス培養は、Stoppiniら27で使用される方法よりも有利な場合もあるが、インビトロでの長期細胞生存は通常、評価する際に大きな関心事であるという事実を考慮すると培養方法では、多くの実験において、培養中の短期間のみが必要である12、31、32、33、34、35。これらの条件下で、自由浮遊培養物の使用は、よりシンプルで費用対効果が高いという利点を提示するだけでなく、2〜3週間にわたって培養中に保持されるスライスよりも、元のヒト組織の状態に正確に似ています。

スライス培養が神経科学に及む可能性があるにもかかわらず、成人の神経組織を用いてこのような培養物を調製する研究は、特にヒトの被験者からはまだ不足している。この記事では、切除脳手術に提出された生きているヒトドナーから収集した脳組織を使用して、自由浮遊スライス培養を準備するプロトコルについて説明する。これらの培養物を用いた生化学的および細胞生物学アッセイを維持・実行する手順を詳しく説明する。このプロトコルは、成人期に関連する神経病理学のメカニズムに関する研究において、生存率および神経機能を分析するために貴重であることが証明されている。

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プロトコル

生きた成人脳組織は、薬剤耐性側頭葉てんかんの治療のために切除神経外科手術を受けている患者から得られた(図1A)。すべての手続きは、リベイラン・プレト医科大学(17578/2015)の診療所病院の倫理委員会によって承認され、患者(またはその法的責任者)は、インフォームド・コンセント条項に同意し、署名しました。組織の収集は、てんかん手術センター(CIREP - ブラジルのサンパウロ大学リベイランプレト医科大学のクリニック病院)の脳神経外科チームによって行われました。

1. 材料の殺菌

メモ:すべての材料および溶液は、使用前に殺菌する必要があります。

  1. すべての手術ツールとビブラートムスライス材料(ナイフホルダー、試料ディスク、バッファトレイ)を180°Cで4時間の乾燥殺菌オーブンで殺菌します。
  2. UVまたはガンマ照射によって温度感受性材料または装置を殺菌する。
  3. 0.22μmの細孔膜を介してオートクレーブレーションまたは濾過によってメディアおよび溶液を殺菌します。

2. ソリューションの作成

  1. 輸送溶液の15-20 mLを準備する:50%v/vハンクスのバランス塩溶液(HBSS)pH 7.4、50%v/v基底培地は、出生後および成人の脳ニューロンの維持のための(材料の表)、10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジネエタンスルホン酸(ヘペス)、3mg/mLグルコース、および33μg/mLゲンタマイシン。
    注:輸送溶液は、サンプル収集の前に少なくとも20分間冷蔵し、酸素化(カルボゲンガスでバブリング)する必要があります。
  2. 300 mL のスライス液 (10 mM HEPES と 3 mg/mL グルコースを補充した HBSS) を準備し、初期結晶形成のポイントまで冷凍庫で冷却します。
  3. 培養培地の20mLを調製する:出生後および成人脳ニューロンの維持のための基底培地(材料表)1%L-グルタミン誘導体(材料表)を補う、神経培養のための2%のサプリメント(表)材料)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および0.25 μg/mLアンホテリシンB。

3. スライス装置の設定

注:このプロトコルは、手術室でのサンプル収集のロジスティクスのために同僚の助けを借りて理想的に実行されます。

  1. 塩加え氷のバケツで、スライス液を使用前に少なくとも20分間、カルボゲン混合物バブリング(95%O2、5%CO2)の下で休ませます。
  2. 3%アガロース(約2cm×2cm×2cm)のブロックを準備し、ビブラートメ検体ディスクにスーパー接着して、スライス中に組織サンプルに追加の機械的支持を作成します(図1E)。
  3. スライス用のビブラートムを設定します:セクション厚さ200μm、振動周波数100Hz、スライス速度0.5~1.0mm/s。
  4. ビブラート当バッファートレイをビブラートベースにロックし、スライス液とサンプルを受け取る前に氷を冷蔵し、スライス手順全体を通して氷を加えます。

4. サンプルコレクション

注:このプロトコルでは、ヒト新皮組織を手術室で採取し、実験室に搬送した。

注意:人間のサンプルを扱う場合は、教育機関が定める適切な安全プロトコルに従ってください。

  1. ガス出力を輸送に接続するシリコンチューブに接続されたガス出力を制御する圧力/フラックスバルブに接続されたカルボゲン混合物を備えたポータブルガスボンベ(図1C)を設定します。容器;輸送容器、通常、輸送溶液を含むガス入力用の穿刺蓋付き50 mL円錐形遠心管。輸送中のサンプル冷却のための氷。
  2. 試料(図1B)を直ちに収集し、ラボに搬送します。冷間輸送溶液に試料を浸漬する(常にカルボゲン混合物で泡立つ)。

5. スライス

  1. スライス液を含むペトリ皿(100mm x 20mm)に試料を移し、細かい手術用具を用いて、試料中の残りの髄質をできるだけ慎重に取り除く(図1D)。
  2. 実験計画の特定の特性を持つスライスを製造するための最良の標本の向きを選択し、No.24メスブレードで、試料ディスクに接着されたベースとなる平らな表面をトリムします。
  3. 使い捨てプラスチックスプーンと繊細なペイントブラシを使用して、ペトリ皿から断片を収集し、濾紙を使用して乾燥過剰溶液(毛細血管によって乾燥し、紙で組織の断片に触れないように)。
  4. スーパーグルーを用いて、組織をディスクにしっかりと付着し、アガロースブロックに接触するまで、組織をビブラートメ検体ディスクに取り付けます(図1E)。
  5. ビブラートム標本ディスク(組織が正しく取り付けられたもの)を、プロセス全体の間にバブリングしなければならないスライス液で満たされたビブラートムバッファートレイに入れます。
  6. かみそりの刃をしっかりと固定した状態でナイフホルダーを固定します。
  7. スライス液は、標本とブレードの両方を覆い、スライスを開始する必要があります(図1F)。
  8. 試料を200μmのスライスに切ります。
    注:一部の振動は標本を自動的に切断しますが、プロセス中のスライス速度の近い観察とわずかな調整は、より良いスライスを生成するのに役立ちます。最初の不規則なスライスを破棄します。
  9. スライス液でバッファトレイからペトリ皿にスライスを転送し、約70%の皮質/30%白質の割合に緩いエッジと余分な白い母校をトリムします。

6. 文化

メモ:滅菌環境下の層流キャビネットでこのステップを実行します。

  1. ウェルあたり600μLの培養培地(24ウェルプレート)を加え、スライスをめっきする前に36°Cで少なくとも20分間インキュベートし、5%CO2を入れます。
  2. ペイントブラシを使用して井戸ごとに 1 つのスライスをプレートします (図 1G)。
  3. プレートに未使用の井戸がある場合は、400 μLの滅菌水で満たしてください。
  4. プレートを36°Cでインキュベートし、5%CO2.
    メモ:最初の媒体の交換は、スライスのサイズに応じてめっき後8-16時間の間で行う必要があります。
  5. 50 ng/mL脳由来神経栄養因子(BDNF)を有する、以前に調製した培養培地の10mLを補う。
    注:最初の8-16時間の間に、この段階の媒体消費が加速されるため、スライスは栄養の剥奪および酸性化を避けるために600°Lの培地でインキュベートされる。次のステップから、ウェル当たりの媒体の体積は400°Lに調整される。
  6. 各ウェルから333°Lの調整済み培地を取り出し、新鮮なBDNF補充培地を133°L添加します。
  7. 条件付き培地の3分の1を新鮮なBDNF補充培地に置き換えて、24時間ごとに培地交換のプロセスを繰り返します。

7. 培養スライスにおける健康、形態、機能の評価

注:代表的な結果において例示を目的とした細胞死を誘導するために、いくつかのスライスを酸化ストレス誘導剤H2O2で24時間処理に提出した。ステップ7.1.2および7.1.3は、細胞死を誘導するためにH2O2の使用について説明する。

  1. 細胞生存率
    注:挑戦的なスライス培養における神経毒性/神経保護を評価する簡単で簡単な方法は、代謝活性細胞の割合を測定する3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム(MTT)アッセイ36です。処理されたサンプルと比較される通常の条件の下で。
    1. 層流キャビネットで、培地の3分の1を新鮮な媒体に置き換えます。
    2. 30%H2O2原液から、ウェル当たりH2O2の体積を加え、意図した最終濃度(30mMまたは300mM)に達する。
      注:H2O2は、挑戦の前に新鮮な栄養素の適切な供給を保証するために、培地の毎日の変更後に追加されました。
    3. プレートを36°Cで24時間インキュベートし、5%CO2.
      注:H2O2処理(または目的とする他の有毒刺激)の後、以下のステップはMTTアッセイによる細胞生存率決定を記述する。
    4. 40 μLのMTT溶液をプレート内の各ウェルに0.5mg/mLの最終濃度に加えます。
    5. プレートを36°Cでインキュベートし、5%CO2を3時間インキュベートします。
    6. リン酸緩衝生理食塩分(PBS)でスライスを洗浄し、マイクロチューブに移します。
    7. ピペットを使用して、残りの溶液を慎重に取り除きます。
    8. スライスを含むマイクロチューブを計量して各スライスの質量を決定します(これは得られた吸光度の測定値を正規化するための鍵です)。
      メモ:必要に応じて、サンプルをこの段階で凍結し(-20°C)、後で処理することができます。
    9. 電動害虫を使用して、イソプロパノール/HClの200°Lでスライスを均質化します。
    10. 室温(RT)で遠心分離機 2600 x gで 2 分間.
    11. 上清を採取し、540nmで吸光度を測定する。
  2. KCl誘発性神経脱分極
    注:マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)シグナル伝達カスケードタンパク質ERKのリン酸化は、続いてウェスタンブロッティング、KCl誘導脱分極37に対する神経応答の定量に使用することができる。
    1. フローキャビネットで、培養培地を300°LのHBSSで交換し、36°Cに平衡化しました。
    2. HBSSを300°Lの新鮮なHBSSに交換してください。
    3. プレートを36°Cでインキュベートし、5%CO2を15分間インキュベートします。
    4. HBSSを新鮮なHBSSまたは80 mM KCl脱分極溶液(いずれも36°C)に交換し、36°Cで5%CO2を15分間インキュベートします。
    5. プレートからマイクロチューブにスライスを転送します。このステップでは、スライスを-20°Cで保存して後で処理できます。
    6. 放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファー(50 mM Tris-HCl;150 mM NaCl;1 mM EDTA;1%非イオン性界面活性剤;0.1%ドデシル硫酸ナトリウム;pH7.5)で組織抽出物を調製します。遠心分離剤は、16000 x gで10分間4°Cで抽出し、上清を収集し、ブラッドフォード法を用いて総タンパク質濃度を決定する。
    7. 全タンパク質の30μgを12%ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)にロードします。
    8. 電気泳動後、ゲル含有量をニトロセルロース膜に移す。
    9. TBSに5%の非脂肪乾燥乳乳と0.1%ツイーンで膜を遮断した後、マウス抗pERK(1:1,000)でインキュベートし、4°Cで16時間インキュベートします。洗浄後、ウサギ抗ERK1/2(1:1,000)でRTで2時間インキュベートします。
    10. RTで適切なHRP共役二次抗体を1時間インキュベートする。
    11. 好ましいHRP基板で明らかにする。
  3. 形態学的評価
    注:細胞の生存と機能評価に加えて、組織形態を分析することが重要です。培養スライスの切除は、形態学的解析のためにできるだけ高品質の材料を生産するための重要なステップです。
    1. スライスの固定、凍結保護、切除
      1. 培養培地を含む井戸からPBSを含む新しい24ウェルプレートにスライスを移します。
      2. PBSを取り外し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)の1 mLを加えます。PFA を追加する前に、スライスをフラットにしておくことが重要です。4°Cで一晩インキュベートする。
      3. PFA溶液を慎重に取り除き、30%スクロース溶液を1mL加えます。4°Cで48時間インキュベートする。
      4. 凍結ミクロトームを-40°Cに設定します。
      5. スライスを配置するミクロトームステージにスクロースベースを用意します(図2A)。それは完全に凍結し、慎重にスライスが配置される平らな表面を生成するために、凍結スクロースの一部をカットしてみましょう。
      6. 各スライスを伸ばしたプラスチックフィルムの上に置き、ペイントブラシを使用して組織を平らにします。
      7. ストレッチドスライスを1回の移動で凍結スクロースベースに転送します。
        注: 凍結したスクロースベースの上にスライスを移動することはできません。この転送手順を慎重に実行します。
      8. スライスを適切な凍結のために5〜10分間休ませます。
      9. スライスを30μmのセクションに切ります。
      10. 30μmのセクションをPBSを含むペトリ皿に移します。
      11. 実験計画により適切なヒストロジープロトコルに進みます。
        注:30μmのセクションは、自由浮遊免疫ヒストケミストリーに容易に使用することができ、さらにヒストロジーのために顕微鏡スライドに取り付けたり、-20°Cで不凍液に保存することができます。
    2. 免疫ヒストケミストリー
      注:免疫ヒストケミストリーと免疫蛍光標準プロトコルは、研究室によって異なります。ここで使用するプロトコルの詳細については、Horta et al.38を参照してください。図2に提示される免疫染色に使用される一次抗体は、ニューロン核(NeuN)、健康成熟ニューロンマーカー、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、アストリンサイトマーカー、イオン化カルシウム結合アダプター(Iba-1)、およびミクログリアを含むマーカー。
      1. ブロッキング溶液中のスライス(例えば、PBS中の2%正常ロバ血清)を40分間インキュベートする。
      2. 4°Cの軽度の攪拌下で一次抗体で一晩インキュベートする。
      3. PBSで洗浄した後、RTで軽度の攪拌下でビオチン化二次抗体で120分間インキュベートする。
      4. PBSで洗浄した後、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲート(材料表)で120分間RTでインキュベートする。
      5. DAB + 0.04% ニッケルアンモニウムで明らかにします。
      6. ゼラチンコーティングされた顕微鏡検査スライドに染色されたセクションを取り付け、空気乾燥させます。エタノールで脱水し、キシレンでジアファニゼーションし、取り付け媒体(材料表)で仕上げ、カバースリップで覆い、画像を作成します。

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結果

培養スライスの品質と健康を評価する重要な側面は、予想される神経細胞型、ニューロン、およびグリア細胞の存在と典型的な形態である。ヒト皮質積層の典型的なアーキテクチャはDIV4のスライスで観察され、神経免疫標識によって明らかになった(図2D)。また、ミクログリアおよびアストログリア(図2B,C)の存在も認められなかった。これらの結果は、組織アーキテクチャが外科的処置/サンプル処理またはインビトロの短期期間のいずれかによって有意に影響されないことを示す。これまでの知見に従って、NeuN免疫反応性はDIV0とDIV432の間で変化しないことが示された。これらの結果に基づいて、スライスの厚みを200μmに減少させたフリーフローティング培養形式(膜挿入物を使用する場合に広く使用されている300〜400μmと比較して)は、内細胞層への酸素および栄養素のより良い拡散に寄与した以前に培養スライスの健康に重要であることが実証...

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ディスカッション

自由浮遊、短期スライス培養物を製造するためのこのプロトコルは、成人ヒトネオコルチカルスライスを培養するための代替方法である。スライス培養のためのこのようなプロトコルは、光遺伝学1、44、45、電気生理学2、3、4、5に関する研究に適している可能性があります。, 短期可塑性46,47, 長期可塑性48,49, 神経毒性/神経保護10<...

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開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

この作品は、FAPESP(グラント25681-3/2017からAS)、CAPES(ポストドクターフェローシップPNPD/INCT-HSMからA.F.、博士前フェローシップからN.D.M.)、FAEPAによってサポートされています。G.M.A.はFAPESP(MS 2018/06614-4)から修士号を取得しています。N.G.C.はCNPqリサーチフェローシップを開催しています。我々は、この研究のために切除された組織を寄付してくれた患者とその家族に感謝する。サンパウロ大学リベイラン・プレト医科大学臨床病院の住民、看護師、技術者、CIREPチームの支援を受け付けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-プロパノールメルク1096341000
アクリルアミド/ビスアクリルアミド、30%溶液シグマアルドリッチA3449 
アガローシグマ アルドリッチA9539
過硫酸アンモニウムシグマA3678-25G
アムホテリシン BGibco15290-018
抗体抗 ERK 2 (ウサギ)サンタクルーズ バイオテクノロジーsc-154希釈 1:1,000 in BSA 2.5%
抗体抗 pERK (マウス)サンタクルーズ バイオテクノロジーsc-7383希釈1:1,000 in BSA 2.5%
B27Gibco17504-044
BDNFSigma AldrichSRP3014
ウシ血清アルブミンSigma AldrichA7906
Bradford 1x Dye ReagentBioRad500-0205
EDTASigmaT3924RIPA バッファー
グルコースメルクで使用 108337
GlutamaxGibco35050-061
Hank's Balanced SaltsSigma AldrichH1387-10X1L
HepesSigma AldrichH4034
塩酸Merck1003171000
過酸化水素 (H2O2)Vetec194
マウス IgG、HRP 結合全 Ab (抗マウス)GENA931-1ML
NaClメルク1064041000RIPA バッファー
ニューロベース AGibco10888-022
脱脂粉乳 (Molico)Nestlé膜ブロッキングに使用
PBSバッファー pH 7,2ラボクリン590338
ペニシリン/ストレプトマイシンシグマ アルドリッチP4333
塩化カリウムメルク1049361000
プライムウェスタンブロッティング検出試薬GERPN2232
Rabbit IgG, HRP結合全Ab (抗ウサギ)GENA934-1ML
SDSSigmaL5750RIPAバッファーに使用
TEMEDGE17-1312-01
チアゾリルブルーテトラゾリウムブロマイド(MTT)Sigma AldrichM5655
TrisSigmaT-1378RIPAバッファーに使用
Triton x-100SigmaX100RIPAバッファーに使用
超純水ミリポアMiliQ 純<水製造装置
ストロング>イクイップメントおよびマテリアル
24ウェルプレートコーニングCL S3526フラットボトム、蓋付き
マシャムポトランプレミアム(ニトロセルロースメンブレン)由来の滅菌水 GE29047575
カルボゲン混合物ホワイト マーティン95% O2、5% CO2
インキュベーターニューブランズウィック サイエンティフィックCO-24スライスのインキュベーション 5% CO2、36ºC
マイクロプレートリーダー分子デバイス
マイクロチューブグライナー0016081,5mLマイクロチューブ
電動乳棒キンブルチェイス
プラスチックスプーンデザートスプーンのサイズ
カミソリの刃ビッククロムプラチナ、ビブラトームでスライスに使用
メスの刃ベクトン・ディッキンソン(BD)番号24組織のスライスに使用;推奨サイズまたはそれより小さい
瞬間接着剤(ロックタイト・スーパー・ボンダー)ヘンケル組成:エチルシアノアクリラート;2-プロペン酸;6,6'-ジ-テルク-ブチル-2,2'-メチレノジ-p-クレゾール;ホモポリマー
・ビブラートーム ライカ14047235612 - VT1000S
免疫組織化学用材料名/装置
抗体抗NeuN(マウス)ミリポア MAB377希釈 1:1,000 in Phosphate Buffer
抗体 anti-GFAP (mouse)MerckMAB360Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-Iba1 (rabbit)AbcamEPR16588 - ab178846希釈 1:2,000 in Phosphate Buffer
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L)VectorBA-9200
DABSigma AldrichD-9015
EntellanMerck107960
エタノールMerck1.00983.1000
ゼラチンシンセ00G1002.02.AEスライド
ミクロトームライカSM2010R凍結ステージ (BFS-10MP, Physiotemp) を装備し、-40º に設定。C
ノーマル ロバ 血清ジャクソン イムノ リサーチ017-000-121
パラホルムアルデヒドシグマ アルドリッチ158127
ウサギ IgG, HRP リンク全 Ab (抗ウサギ)GENA934-1ML
スライド (スターフロスト)ニット グレイザーゼラチンコーティングスライド
ショ糖ベテック60REAVET017050
ベクタステイン ABC HRP キット (ペルオキシダーゼ、標準)VectorPK-4000, キット標準
キシレンシンセ01X1001.01.BJ
スア

参考文献

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