この方法の目的は、哺乳類腫瘍細胞を蛍光標識血管を有するゼブラフィッシュ胚に異種移植することにより、腫瘍血管新生の生体内モデルを生成することである。異種移植片および関連する血管をイメージングすることにより、血管新生応答の定量的測定が得られる。
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この記事について
サマリー
要約
腫瘍血管新生は抗癌治療の主要な標的であり、この方法は、生体内でこのプロセスを研究するための新しいモデルを提供するために開発されました。ゼブラフィッシュ異種移植片は、哺乳類の腫瘍細胞を2日後受精後ゼブラフィッシュ胚の周食空間に移植し、続いて実験エンドポイントで観察された血管新生応答の程度を2日まで測定することによって作成される。移植後。この方法の主な利点は、ジッタフィッシュ宿主血管新生応答を移植片に正確に定量する能力である。これにより、血管新生応答に対する宿主対腫瘍の寄与と同様に、分子機構の詳細な検査が可能になります。異種移植胚は、腫瘍血管新生を阻害する戦略を調べるために、潜在的な抗血管新生薬によるインキュベーションなどの様々な治療を受けることができる。血管新生応答はまた、より動的な細胞プロセスを調べるために生画像化することができる。比較的要求の厳しい実験技術、ゼブラフィッシュの安価なメンテナンスコスト、短い実験タイムラインにより、このモデルは腫瘍血管新生を操作する戦略の開発に特に役立ちます。
概要
血管新生は、癌の古典的な特徴の一つであり、抗癌治療1、2の標的を表す。このプロセスを研究するために、癌の異種移植片モデルは、マウス3などの動物に哺乳類腫瘍細胞を移植することによって作成された。ゼブラフィッシュ異種移植片モデルも開発されており、これは、ゼブラフィッシュ血管の異種移植片4への急速な成長をもたらす2日後受精(dpi)ゼブラフィッシュに腫瘍細胞を移植することを含む。
このプロトコルは、血管新生応答が異種移植片全体にわたって正確に定量することができる生体内ゼブラフィッシュ胚異種移植片モデルについて説明する。この方法により、研究者は、腫瘍血管新生応答を支える分子機構を生体内で調べることができます。ゼブラフィッシュの遺伝的管分性は、宿主の寄与を尋問することを可能にするが、異なる腫瘍細胞株の選択は血管新生に対する腫瘍寄与も5、6、7を調べることができる。さらに、ゼブラフィッシュ幼虫が小分子に透過性であるとして、特異的経路阻害剤を用いることができるか、または薬物ライブラリーをスクリーニングして腫瘍血管新生8、9、10、腫瘍血管新生の新規阻害剤を同定することができる。 11.
ゼブラフィッシュ胚異種移植片モデルは、他の哺乳類異種移植片モデルと比較してユニークな利点を提示します。ゼブラフィッシュ異種移植片は、より安価で実行しやすく、多数の動物を検査することができ、生細胞イメージングは、細胞行動の詳細な検査を可能にする4。顕著な血管の成長を観察するために数週間を必要とする他の生体内モデルとは異なり、ゼブラフィッシュ異種移植片の血管新生は、移植3、4の後24時間以内に観察することができる。しかしながら、胚性ゼブラフィッシュにおける適応免疫系の欠如は、異種移植片を維持するのに有益である一方で、適応免疫応答および腫瘍血管新生に対するその寄与を調べることができないことを意味する。加えて、腫瘍間質細胞の欠如、腫瘍を矯東的に移植できないこと、およびゼブラフィッシュと哺乳動物細胞間の維持温度の差がこの方法の潜在的な弱点である。それにもかかわらず、ライブイメージングのためのこのモデルのアメニティと血管新生応答を正確に定量する能力は、生体内で腫瘍血管新生を調節する細胞プロセスを研究するために独特に有益になります。
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プロトコル
1. マイクロインジェクション針の調製
- マイクロピペットプーラーをオンにし、次のパラメータを設定します(材料の表に記載されているマイクロピペットプーラーモデルのために校正):熱、680;プル, 75;速度, 40;時間, 55;圧力: 530.
- マイクロピペットプーラーにホウケイ酸塩ガラスキャピラリーを固定し、毛細血管を引っ張って2本の針を作ります。必要な数の針に対して繰り返します。
2. 移植のための細胞培養
注:このプロトコルを使用する場合、任意の哺乳動物癌細胞株は、異種移植片としてゼブラフィッシュ胚への移植に使用することができる。しかしながら、異なる細胞株5、11、12間で誘導される血管新生応答には多くのばらつきがある。B16-F1マウス黒色腫細胞はゼブラフィッシュ胚11において強い血管新生応答を誘導することが示されており、したがって、このプロトコルでの使用に適している。
- 胎児ウシ血清(FBS)を補充したMEM-α培体を用いて75cm2フラスコで37°CでB16-F1細胞を成長させ、最終的な濃度は10%(v/v)、ペニシリン/ストレプトマイシンは100μg/mLの最終濃度で行う。
- B16-F1細胞の95-100%コンフルエント75 cm2フラスコから培地を取り出し、室温リン酸緩衝生理食生(PBS)の5 mLで細胞を洗浄します。
- 5 mL PBS を取り出し、室温 0.25% トリプシン/エチレンディアミンテトラセチン酸 (EDTA) の 2 mL を追加し、60 秒の 37 °C でインキュベートします。
- フラスコの側面をタップして、セルがフラスコの底部への付着を失い始めているかどうかを確認します。
- フラスコに10%FBSを含む室温MEM-αの8mLを追加し、フラスコの内側にピペットを付け、フラスコの底部に付着した細胞を懸濁液に入れ、セル懸濁液を15mLチューブにピペットします。
- 800 x g、4-8 °Cで細胞懸濁液を5分間遠心分離し、培剤を吸引し、色素で細胞に標識を付け続ける。
3. 蛍光色素を用いるB16-F1細胞の標識
注:移植された腫瘍細胞と胚の他の細胞を区別するためには、腫瘍細胞を移植前に適切な蛍光色素で標識する必要があります。細胞が既に蛍光レポーターを発現している場合、このステップはスキップできます。
- 37°Cで無血清無血性MEM-α培体の2mLをインキュベートする。
- 選択した色素のストック溶液を調製し、無血清無血性MEM-α培地の2mLを予めインキュベートして、作業可能な濃度を作る(B16 F1細胞に適した染料および濃度の例は、材料の表に記載されている)。
- 色素溶液のピペット1mLを細胞ペレット(ステップ2.6から)に入れ、ピペッティングで十分に混合し、その後、他の1mLの色素溶液を加えて混合する。
- 細胞と色素混合物を37°Cで40分間インキュベートし、20分で穏やかに振って混合する。
- 800 x g、4-8 °Cで5分間セル懸濁液を遠心分離します。
- 上清を吸引し、PBSの5 mLでピペッティングして標識細胞を洗浄します。
- 800 x g、4-8 °Cで再び800 x gで細胞懸濁液を遠心分離し、上清を吸引し、移植の準備ができるまで氷の上に細胞を置きます。
注:最終的な腫瘍細胞ペレットは、20〜40 μLの体積を有する必要があります。
4. 移植用胚の調製
注:蛍光標識血管を有するトランスジェニックゼブラフィッシュラインを選択してください(例えばkdrl:RFP、fli1a:EGFPなど)13歳,14.
- 移植の2日前に、前述したようにゼブラフィッシュを産卵し、胚15を収集する。
注:我々は早期にこれらの魚を注入していないので、彼らはRosen et al.15によって説明されているように産卵の20分以内に収集する必要はありませんが、交配の数時間後に収集してもよいです。 - 胚を100mm培養皿に入れ、約100個の胚/皿の密度にします。
- E316の50 mL(汚染を防ぐためにメチレンブルーの水性ストック溶液の5μLを補充)を各皿に追加し、死んだ胚や破片をきれいにし、注射の準備ができるまで28°Cの暗いインキュベーターで皿を保ちます。
- 1日後受精(dpf)で、各皿に1フェニル-2-チオレア(PTU)を加え、E3で30mg/L PTUの最終濃度を生成する。PTUは、腫瘍細胞および血管を見る能力を妨げる可能性のある色素沈着を防ぐ。
- 2 dpf で、針またはピンセットを使用して、ハッチングされていない胚を手動で減衰します。蛍光顕微鏡を用いて、異種移植に必要な数のトランスジェニック胚を選択する(50-200)。
- 移植の前に、注射手順中の動きを防ぐためにE3の300 μg/mLトリカインの溶液で選択した胚を麻酔する。
- 35mmの皿にE3溶液に2%のメチルセルロースを入れ、皿のボリュームの四分の一にします。
- 転写ピペットを使用して、約50個の胚(E3溶液の体積も最小化)をメチルセルロース上に置きます。
- マイクロローダーピペットチップを使用して、胚がすべて垂直方向に向き、頭を上に、左側を上向きに配置します。
注:ステップ4.7-4.9はまた、前述の17としてアガロースブロック上に胚を配置することによって行うことができますが、私たちの経験では、胚はメチルセルロースに配列されたときにより簡単に配置されます。
5. 2 dpf胚への哺乳類癌細胞のペリビテルリン注射
注:移植時に細胞が移植片として一緒に集まるようにするために、細胞は細胞外マトリックス混合物(ECM)と一緒に混合されなければならない。材料表で参照されるECM混合物を使用する場合、このようなセル/ECM混合物を作る手順について説明しました。代替行列を使用する場合は、それに応じてステップを調整する必要があります。
- ECMのストックを500μLチューブで100μLアリコートに分割し、必要になるまで-20°Cで保存します。
- ECMのアリコートを解凍し、100 μLのPBSを加えて混合物を50%(v/v)に希釈します。
注:希釈された50%ECMは、最大1ヶ月間4°Cで保存することができます。 - 50%ECMをB16-F1細胞ペレット(ステップ3.7から)とよく混合し、ピペッティングと撹拌を行い、2:1比で細胞/ECMの混合物を生成し、氷の上に混合物を保存します。
- 微小キャピラリーピペットを使用して、細胞の3-10 μLを取ります。
- 慎重に針にピペットの先端を挿入し、針の端にB16-F1/マトリックス混合物を排出します。
- 針を針ホルダーに挿入し、皿に45°の角度で傾けます。
- ピンセットを使用して針の先端を折り、細胞を絞らずに針から排出するのに十分な大きさの穴を作ります。
- 注入装置に取り付けられた加圧空気ボンベをオンにし、インジェクタを「連続」モードで一時的に回して、細胞を針先まで押し込みます。
- 皿から針を取り出し、ヘモサイトメーターに置き換えます。
- ヘモサイトメーターに油滴を置き、この滴に一度針を注入します。
- ヘモサイトメーターを使用して単一のパルスで排出される細胞の数をカウントし、パルス持続時間を調整することにより、パルスあたり約150セルを排出するために針を較正します。
注:パルス当たりの細胞のこの量を排出することは、成功した異種移植片を移植するためにいくつかのパルスを必要とします。これにより、パルスの数/位置を適度に調整して、各異種移植片を大きくまたは小さくすることで、腫瘍異種移植片の最終的なサイズをより細かく制御できます。 - 胚の黄嚢に向かって針を指し、針の先端が黄嚢から出てきて、胚の腹部側の胚表皮を心臓に押し出すまで、卵嚢を通してそれを押し出す。
注:胚性黄身嚢の前に入るように針を位置付けし、細胞が排出される最終的な位置に入ります。これにより、細胞が心臓から離れた方向に排出され、一般的な枢機卿静脈に細胞を注入する可能性が減少します。 - 針の先端を、表皮と黄身嚢膜の間に空間(ペリビテルリン空間)を作り出すまで慎重に前方に押し出し、インジェクターをパルスして細胞混合物の一部をペリビテルリン空間に排出します。
- 500-800細胞が精存後膜空間に注入されるまでパルスを繰り返し、卵嚢の底部に沿って少なくとも半分に伸びる目に見える膨らみを作成し、胚から針を取り除く。
注:細胞が針をブロックするか、注射中に損傷を受けた場合は、一時的に「連続」モードに切り替えて針をパージし、その後「パルス」に戻します。これは、針のブロックを解除し、細胞が自由に排出され、損傷を受けずにできるようにする必要があります。 - 皿内のすべての胚についても同じことを続け、必要に応じて腫瘍細胞を持つ新しい針をロードします。
- すべての胚を注入した後、針を取り出し、マイクロキャピラリーピペットチップを使用してすべての胚を一緒に押し出し、可能な限り少ないメチルセルロースでピペットアウトできるようにします。
- 胚をE3(PTUとメチレンブルー)を含む回収皿に移し、胚の周りにE3を優しくピペッティングして洗います。
注:この時点で、異種移植胚は、それらを異なる皿に分離し、一方の皿に薬物溶液と制御溶液(薬物車両など)を他の皿に加えることによって薬物で治療することができる。 - 胚を34°Cでインキュベートし、1日2回チェックを行い、死んだ胚または食後の胚を皿から取り除きます。
注:34°Cは異種移植片血管化に最適な温度であることが判明し、ゼブラフィッシュ胚異種異形成異形成モデル18を用いた他の研究でも用いられてきた。異種移植片は48 hpiまでいつでもイメージすることができる(移植後の時間)。
6. ライブイメージング
- 48 hpiで、食腫なしで3-5の健康な胚を同定する。150 μg/mLトリカインでそれらを麻酔し、前述の19として1%低融点(LMP)アガロースで横に取付けます。
注:アガロースが固化しているように、微小キャピラリーピペットチップを使用して、胚を横に配置します。 - 共焦点顕微鏡、顕微鏡コントローラ、レーザー、顕微鏡を制御するためのコンピュータソフトウェアをオンにします。
- 皿を共焦点顕微鏡の上に置きます。20倍の倍率を使用して、水浸漬対物レンズを使用して、ブライトフィールドイメージングを使用して異種移植片をフィールドの中心に配置します。
- 腫瘍細胞の標識に使用される色素とゼブラフィッシュ血管の標識に使用される蛍光色素を検出するのに適した励起レーザーを選択します。
- 各レーザーのゲインを、腫瘍細胞と血管の両方を検出できるレベルに調整します。
注:共焦点設定が確立されたら、異種移植片間で比較を行うことができるように、実験を通じてこれらを変更しないようにしてください。 - 腫瘍細胞に適したレーザーチャネルを用いて、異種移植片の全容積を含む画像化される体積を決定し、移植片の両側に少なくとも1つまたは2つの光学切片を可能にする。約 5 μm 離れた断面間隔を使用して Z スタックを作成します。
注:Zスタックには異種移植片の全容積を含むことが不可欠です。 - 2つのチャネルイメージングを用いて、腫瘍異種移植片および血管の両方を画像化する。画像化する幼虫ごとに6.6~6.7の手順を繰り返します。
7. タイムラプスイメージング
注:このモデルは、その透明性と異なる細胞タイプを蛍光的に標識するゼブラフィッシュトランスジェニックの利用可能性に起因する動的な細胞プロセスのイメージングに非常に適しています。これにより、タイムラプスイメージングは、このモデルの主要なアプリケーションになります。
- 環境チャンバをオンにし、イメージングの前に少なくとも2時間34°Cに設定します。部屋が加湿されていない場合は、水の皿を追加します。
- 3-5胚を麻酔する(2 dpfで120 μg/mLトリカインを使用し、3 dpfで100 μg/mLトリカインを使用)、前述のプロトコル19に従ってタイムラプスイメージングのために0.8%LMPアガロースに横に取り付けます。
注:アガロースが固化しているように、微小キャピラリーピペットチップを使用して、胚を横に配置します。 - ステップ6.2〜6.7に記載されている異種移植片を装置と画像を設定し、10分間隔で異種移植片のZスタックを取得する。
注:胚は、それが画像化されているように34 °Cで維持されなければならず、寒天の幼虫の上のE3は、それが乾燥していないことを確認し、時折補充する必要があります。
8. ゼブラフィッシュ異種移植片に対する血管新生応答の定量
注: 次の手順では、3D 画像解析ソフトウェアを使用します。具体的な手順は、使用するソフトウェアによって異なります。
- 腫瘍異種移植片のZスタック共焦点画像ファイルを3D画像解析ソフトウェアの新しいフォルダに転送します。
注:腫瘍血管のレベルを定量するためには、すべての異種移植片の腫瘍体積または血管容積を測定するために使用できるように、測定プロトコルを校正した設定で作成する必要があります。 - 腫瘍異種移植片の体積を測定するための「腫瘍体積」プロトコルを作成するには、トップメニューの「測定」タブに移動し、ウィンドウの左側に表示されるプロトコルのリストから「オブジェクトを探す」というプロトコルをスペースにドラッグします。タイトルは「ここでタスクをドラッグして測定を行う」です。
- このプロトコルが腫瘍チャネル内のオブジェクトを測定するように設定されていることを確認し、プロトコルのリストから「クリップからROIを作成する」という名前のプロトコルを「測定を行うためにここにタスクをドラッグする」スペースにドラッグします。これらの 2 つのコマンドが、"オブジェクトの検索" で識別されるオブジェクトに適用されていることを確認します。
- このプロトコルの設定を調整する前に、ウィンドウの左上にある「モード」ラベルの上にあるドロップダウンメニューに移動し、「拡張フォーカス」ビューを選択します。
- 各チャンネル見出しの下にある黒い円をクリックして、右端のペインの非腫瘍チャネルの選択を解除し、腫瘍チャネルのみが見られるようにします。ウィンドウ上部の「フリーハンド」ツールを使用して、すべての腫瘍容積の周りに「対象領域」(ROI)を描画します。
注:腫瘍がROIから取り除かれないように注意してください。これにより、設定を調整する際にプロトコルを実行するリージョンが提供されます。 - 画像の下のパネルで「概要」ラベルを選択し、「表示」オプションを設定して「人口2」を表示します。キャリブレーションするには、[オブジェクトの検索] タスクのアスタリスクをクリックして、設定ウィンドウを開きます。「強度」を使用して「しきい値」を調整し、バックグラウンド蛍光ではなく腫瘍細胞のみが選択されるまで「低い」閾値を決定します。
注:これは、選択したROI内の腫瘍細胞からの蛍光(8.5で描かれた)のみが検出され、背景蛍光のいずれも測定されないように重要です。 - 「最小オブジェクトサイズ」を決定し、セルデブリの小さな項目とは対照的に、無傷のセルのみが測定されるようにします(例えば、「最小オブジェクトサイズ」を100 μm3に設定します)。トップメニューの[測定]タブをクリックして「プロトコルを保存」をクリックし、すべての異種移植片を測定するために同じ設定を使用して、このプロトコルを「腫瘍量」として保存します。
- 異種移植片関連血管の体積を測定するには、新しいプロトコルを作成する必要があります。トップメニューに移動し、[測定値]タブをクリックし、「プロトコルをクリア」をクリックします。「オブジェクトを検索」タスクと「ROI にクリップ」タスクを、このプロトコルの「ここでタスクをドラッグして測定する」というタイトルのスペースにドラッグします。
- 最初のコマンドが血管チャネル内のオブジェクトを測定するように設定され、次のコマンドが最初のコマンドで識別されるオブジェクトに適用されるように設定されていることを確認します。次に、血管のみが見られるように、右端のペインの非血管チャネルの選択を解除します。
- 「腫瘍容積」プロトコルと同様の方法で「血管容積」の設定を決定し、このプロトコルを「血管容積」として保存します(8.6-8.7を参照)。
- プロトコルをクリアし、異種移植片の周りにROIを引き出し、非腫瘍の自己蛍光を含めないように注意してください。このROI内の腫瘍チャネル内のオブジェクトの体積の合計を測定するには、[測定値]タブをクリックし、「プロトコルの復元」コマンドを選択し、「腫瘍ボリューム」プロトコルを選択します。
- 「腫瘍体積」プロトコルによって作られた新しいROIを使用して、「容器容積」プロトコルを使用して、測定タブをクリックし、「復元プロトコル」コマンドを選択し、「容器」を選択して、このROI内の容器チャネル内のオブジェクトの総体積を測定します。ボリューム"プロトコル。
- 血管容積を腫瘍体積で割り、答えを100で乗算して移植片血管形成のパーセンテージ値を得る。
- 他のすべての異種移植片については、手順 8.11 から 8.13 を繰り返します。
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結果
6、24および48 hpiで個々の異種移植片をイメージングすることにより、異なる時点での血管新生応答を図1A-Cに示すように計算することができる。最大の血管新生応答は、24〜48時間の移植後の間に観察され、移植片血管の最大レベルは2 dpiの周りに見られる(図1A-C)。補足ムービー1で見られる20.75馬力から46馬力までのB16-F1異種移植片に対する典型的な血管新生反応のタイムラプスムービー。このムービーは、このプロトコルに続いて移植された異種移植片を2dpf kdrl:EGFP胚にイメージングすることによって生成された。異種移植片を介して成長する血管は、哺乳類腫瘍20に見られる異常な血管ネットワークの典型的な不規則なサイズおよび形態の血管との激しいネットワークを形成する。我々のモデ...
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ディスカッション
プロトコルの最初の重要なステップは、腫瘍細胞の移植です。細胞を胚を脳に付着させることなく、異種移植片が胚に正常に移植できる場所に注入することが不可欠である。あまりにも前の注射は、細胞が心臓に向かって移動することを可能にし、血流を遮断し、子宮内腫につながる一方で、後部である注射は、不十分な移植異種移植片をもたらす。前部注射は、注入時に心臓から離れるように、前方向に黄身嚢を通して針を挿入することによって最も避けられる。後部注射は、黄身嚢の丸い部分の前半分の位置に細胞を注入することによって最もよく避けられる。さらに、横の位置が見えにくく、その後の画像が見えにくいため、細胞は黄嚢に腹部を注入する必要があり、横向きではない。研究者がこのプロセスに合理的に熟達したら、約200〜300個の胚を毎日異種移植片で移植することができる。血管新生応答のイメージングは、異種移植片をマウントし、画像化するのにかかる時間のために時間がかかります。標準的なレーザー走査共焦点顕微鏡を使用して15-20異種移植片を画像化するのに約1時間かかります。
第2の重要なステップは、3D画像解析ソフトウェアを使用した移植片血...
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
オークランド大学ゼブラフィッシュ施設とオークランド大学医学部生物医学イメージング研究ユニットを管理してくださったアルハド・マハガオンカー氏に感謝します。この研究は、ニュージーランドプロジェクト助成金の健康研究評議会(14/105)、ニュージーランド王立協会マースデン基金プロジェクト助成金(UOA1602)、オークランド医学研究財団プロジェクト助成金(1116012)によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| エアシリンダー | BOC | 011G | 異種移植 |
| B16-F1 細胞 | ATCC | 細胞培養 | |
| BD マトリゲル LDEV-フリー (細胞外マトリックス混合物) | コーニング | 356235 異種移植 | |
| ホウケイ酸ガラス 毛細血管 | ワーナーインスツルメンツ | G100T-4 | OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, 長さ = 10 cm 細胞注入 |
| 細胞培養ディッシュ 直径35 mm | サーモフィッシャー NZ | NUN153066 | 魚の飼育 |
| 細胞培養ディッシュ 直径100 mm | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | 魚の飼育 |
| 細胞培養フラスコ 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | 細胞培養 |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | 細胞標識、ストック濃度(DMSO中10 mM)、使用濃度(0.2 μM、無血清培地) |
| ジメチルスルホキシ | Sigma-Aldrich | D8418 | 薬物治療、細胞標識 |
| E3 培地 (2 L の水に 60x) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2OはNaOHでpH 7.2に調整 | 社内 [1] | 魚の飼育 | |
| エチル-3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸(トリカイン) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, イメージング |
| フィルターチップ 1,000 μL | VWR | 732-1491 | 複数のステップで使用 |
| フィルター チップ 200 μL | VWR | 732-1489 | 複数のステップで使用 |
| フィルターチップ 10 μL | VWR | 732-1487 | マルチステップで使用 |
| 蛍光顕微鏡 | ライカ | MZ16FA | 胚の準備 |
| FBS(NZ起源) | モフィッシャー サイエンティフィック | 10091148 | 細胞培養 |
| グローブ | 任意の市販ブランド | マルチステップで使用 | |
| 血球計算盤 細胞計数チャンバー 改良されたノイバウアー | ホークスレー獣医 | AC1000 | 異種移植 |
| ヘレウス マルチフュージ X3R 遠心分離機 | サーモフィッシャー サイエンティフィック | 75004500 | 細胞培養、細胞標識 |
| ヘキスト 33342 | サーモフィッシャー サイエンティフィック | 62249 | 細胞標識、ストック濃度 (DMSO 中 1 mg/mL)、使用濃度 (6 μg/ml 無血清培地中) |
| 低融点、超高純度 アガロー | ス サーモフィッシャー サイエンティフィ | 16520050 | イメージング |
| メチセルロース | Sigma-Aldrich | 9004-67-5 | 異種移植 |
| メチレンブルー | Sigma-Aldrich | M9140 | 魚類飼育 |
| マイクロローダー 0.5-20 μマイクロキャピラリーをロードするためのLピペットチップ | エッペンドルフ | 5242956003 | 異種移植 |
| 用マイクロピペット | 任意の商用ブランド | 複数のステップで使用される | |
| マイクロピペットプーラー P 87 | サッター機器 | 異種移植 | |
| 顕微鏡 ケージインキュベーター | Okolab | タイムラプスイメージング | |
| マイクロ波 | 任意の商用ブランド | イメージング | |
| 鉱物油 | Sigma-Aldrich | M3516 | 異種移植 |
| 最小限の必須培地 (MEM) - α | サーモフィッシャー サイエントフィック 12561056 | 細胞培養 | |
| MPPI-2 圧力注入器 | 応用科学機器 | 異種移植 | |
| ナリシゲ マイクロマニピュレーター | ナリシゲグループ | 異種移植 | |
| ニコン D エクリプス C1 共焦点顕微鏡 | ニコン | イメージング | |
| N-フェニルチオ尿素 (PTU) | シグマ・アルドリッチ | P7629 | 魚の飼育 |
| PBS | ギブコ | 10010023 | 細胞培養 |
| ペニシリン ストレプトマイシン | ライフテクノロジー | ズ 15140122 | 細胞培養 |
| S1 ピペットフィラー | サーモサイエンティフィ | 9501 | 細胞培養 |
| 血清学的ストリペット 10 mL | コーニング | 4488 | 細胞培養 |
| 血清学的ストリペット 25 mL | コーニング | 4489 | 細胞培養 |
| 血清学的ストリペット 5 mL | コーニング | 4485 | 細胞培養 |
| 血清学的ストリペット 2 mL | コーニング | 4486 | 細胞培養 |
| テルモ針 22 G | アムテック | SH 182 | 魚の飼育 |
| 組織培養インキュベーター | サーモフィッシャー サイエントフィック | ヘラセル 150i | 細胞培養 |
| チボザニブ (AV951) | AVEO ファーマシューティカル | 薬物治療 | |
| トランスファーピペット 3mL | メディレイ | RL200C | 魚の飼育 |
| トリプシン/EDTA (0.25%) | ライフテクノロジー | T4049 | 細胞培養 |
| ピンセット | ファインサイエンスツール | 11295-10 | 魚の飼育 |
| Volocityソフトウェア(v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | 画像分析 |
参考文献
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