RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

サマリー

ここで、合成またはインビトロ転写RNA上のメチルトランスフェラーゼ活性の直接分析のための抗体フリーインインビトロアッセイが記載されている。

要約

RNAには100以上の化学的に異なる修飾があり、そのうちの3分の2はメチル化からなる。RNA修飾、特にメチル化への関心は、疾患や癌に関連する生物学的プロセスでそれらを書き、消去する酵素が果たしている重要な役割のために再浮上しました。ここで、合成またはインビトロ転写RNA上のRNAメチル化ライタ活性の正確な分析のためのインビトロアッセイに敏感なアッセイが提供される。このアッセイは、S-アデノシルメチオニンのトリチレートされた形態を使用し、トリチウムを用いてメチル化RNAを直接標識する。トリチウム放射線の低エネルギーは、この方法を安全にし、トリチウム信号増幅の既存の方法により、一般的に人工物になりやすい抗体を使用せずにメチル化RNAを定量化および可視化することを可能にします。この方法はRNAメチル化のために書かれていますが、14CアセチルコエンザイムA.を用いたRNAアセチル化など、放射性標識が可能な他のRNA修飾の研究に適用可能な調整はほとんどありません。メチル化条件、低分子阻害剤による阻害、またはRNAまたは酵素変異体の効果、および細胞で得られた結果を検証し、拡大するための強力なツールを提供する。

概要

DNA、RNAおよびタンパク質は、遺伝子発現1を厳密に調節する修飾の対象となる。これらの修飾の中で、メチル化は3つの生体高分子すべてに起こる。DNAとタンパク質のメチル化は、過去30年間に非常によく研究されています。対照的に、RNAメチル化への関心は、RNAメチル化を書き込み、消去、または結合するタンパク質が発達および^疾患2において果たす重要な役割に照らして、最近再燃したばかりである。豊富なリボソームおよび転写RNAにおけるよりよく知られた機能に加えて、RNAメチル化経路は、特異的メッセンジャーRNA安定性3、4、スプライシング5および翻訳6、7^を調節する。miRNA処理8、9および転写休止および放出10、11.

ここで、分子生物学研究室の設定におけるRNAメチルトランス....

プロトコル

1. 標的RNAのインビトロ転写およびゲル精製

1. 確立された分子クローニング^技術12またはキットを使用してT7および/またはSP6プロモーターを含むプラスミドに目的の配列をクローンする。
2. インビトロ転写のためのDNAテンプレートの線形化
   1. プラスミドのPCRによる関心の配列を、インサートを介してT7プロモーター領域を含むように設計されたプライマーで増幅し、前述^の13と同様に上流+20〜30bpアップストリームと下流である。
   2. あるいは、制限酵素(RE)切断部位を用いてプラスミドのダイジェスト5μgを、REのサプライヤーの指示に従って下流にインサートで利用可能とする。
      注: 選択した RE によって挿入がカットされていないことを再確認してください。このステップで使用されるREの選択は、転写物の収率に劇的に影響を与える可能性があります。優先的には、反対側のDNA^鎖14上のT7 RNAポリメラーゼのテンプレート切り替えを避けるためにREを製造する鈍いまたは5'-オーバーハングエンドで線形化する。初期歩留まりが不十分な場合は、別の RE を試してください。
3. DNAアガロースゲル抽出とクリーンアップのためのキットを使用して得られたDNAを浄化....

結果

インビトロ転写反応
図 2Aは、比較的短い(331 nt)および高度に構造化されたRNAである7SK snRNAのT7 RNAポリメラーゼとのインビトロ転写反応からの典型的な実行を表す。その生の画像に示すように、7SKより短く、長い両方の複数の望ましくないバンドがあり、おそらくランダム転写開始または終了イベントから生じる。このため、インビトロ転写反応に続くゲル精製は、図2Bに示すようにクリーンなRNA試料を得ることが重要である。この時点で、目的のRNAは、はしごに対するその位置によって識別され、ゲル精製によって精製することができる。

前述したように、ゲル精製工程の前に転写反応の長さを最適化する必要がある場合がある。あまりにも長く実行される転写反応は、非常に大量のRNA産生をもたらし、正しい転写物の下流の同定を困難にする。また、特定のプライマーを使用して、逆転.......

ディスカッション

ここで、特定の転写物に向けたRNAメチルトランスフェラーゼ活性のインビトロ検証のための簡素かつ堅牢な方法が報告されている。このアッセイは、S-アデノシルメチオニンをメチル基ドナー(図1)でトリチレートできるという事実を利用して、メチル化RNAを抗体を使用せずに正確に検出することができます。しかし、このアッセイは、どの残基または化学基が酵素によってメチル化されるかを示すことができないことに注意することが重要です。特定の残基がメチル化されていることを特定または検証するために、変異解析、逆転転写ブロックまたはRNA基質の質量分析分析などの他の方法を、RNAメチルトランスフェラーゼアッセイと組み合わせて使用することができる。

RNAの選択とその合成モードは、RNAのサイズによって異なります。18と120 ntの間のサイズの特定のRNAは、多くの評判の高い核酸プロバイダーから便利にカスタム合成することができます。しかし、最も一般的には、様々なサイズの特定のRNAはインビトロ転写される。インビトロ転写のためのDNAテンプレートは、様々.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 bp DNA Ladder	Invitrogen	10821-015	10 bp DNA ラダーキット。
10%過硫酸アンモニウム(APS)	N/A	N/A	尿素変性ポリアクリルアミドゲルの場合(10 mLの場合、1 gを8 mLのmilliQ水に溶解し、容量を10 mLに調整し、0.45 µm フィルター)。
10X TBE Buffer	N/A	N/A	尿素変性ポリアクリルアミドゲル用(1Lの場合、108 gのトリスベース、55 gのホウ酸を攪拌子付きのシリンダーに加え、800 mLの蒸留水を加えて溶解させ、40mLの0.5 M Na2EDTA(pH 8.0)を加え、milliQ水で容量を1Lに調整し、0.22µを使用して溶液をろ過します。m フィルター)。
10X TBS	N/A	N/A	1Lの場合、攪拌子付きのシリンダーに60.5 gのTris Base、87.6 gのNaClを加えます。800 mLの蒸留水を加えて溶解させます。濃縮HClでpHを7.5に調整します。milliQ水で容量を1Lに調整します。0.22 & microを使用して溶液をろ過します。mフィルター。
アクリルアミド:ビスアクリルアミド29:1(40%溶液/電気泳動)、フィッシャーバイオ試薬	フィ	ッシャーBP1408-1	尿素変性ポリアクリルアミドゲル用。
アデノシル-L-メチオニン、S-[メチル-3H];(サム[3H])	Perkin Elmer	NET155V250UC	RNAのin vitroメチル化用。濃度 = 1.0 mCi/mL;比活性= 17.1 Ci / mmol;モル濃度= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM.  凍結した3H-SAMチューブを受け取ったら、4°Cで解凍します。C、20 µ を作ります。アリコートをLし、-30°Cで凍結します。部分的に使用したアリコートを再凍結して再利用しないでください。
アマシャム ハイパーカセット オートラジオグラフィー カセット	GE ヘルスケア	RPN11649	オートラジオグラム ゲル曝露用。
Amersham Hyperfilm MP	GE Healthcare	28906846	オートラジオグラムゲル曝露用。
ベックマンシンチレーションカウンター	ベックマン	LS6500	液体シンチレーションカウント用。
Biorad Mini 水平電気泳動システム	Biorad	1704466	Mini 水平電気泳動システム。
cOmplete Mini EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠	Roche Applied Science	4693159001	20倍溶液の場合、1錠を0.525mLのヌクレアーゼフリー水に溶解します。
Criterion Cell	Biorad	345-9902	ポリアクリルアミドゲル用のRNaseフリー空カセット。
Criterion empty Cassettes	Biorad	1656001	縦型ミディフォーマット電気泳動セル。
DeNovix DS-11 マイクロボリューム分光光度計	DeNovix	DS-11-S	DNAおよびRNA濃度を測定するためのマイクロボリューム分光光度計。
Ecoscint Original	National Diagnostics	LS-271	液体シンチレーションカウント用。
フィッシャーブランド 7mL HDPE シンチレーションバイアル	フィッシャー	03-337-1	液体シンチレーションカウント用。
Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer	RPI CORP	112600	オートラジオグラムゲルの前処理用。
ゲルドライヤー	Biorad	1651745	ゲルの乾燥用。
ゲルローディングバッファーII	Ambion	AM8547	変性ポリアクリルアミド尿素ゲル(組成:95%ホルムアミド、18mM EDTA、0.025%SDS、キシレンシアノール、ブロモフェノールブルー)にRNAをローディングします。
GeneCatcher使い捨てゲル切除のヒント	ゲル会社	NC9431993	アガロースおよびポリアクリルアミドゲルからバンドを除去するため。
Megascript Kit	Ambion	AM1333	T7 RNAポリメラーゼによるin vitro転写用
パーフェクトウェスタン エクストララージコンテナ	ゲンハンターコーポレーション	NC9226382(クリア)/NC9965364(ブラック)	ジェル染色ボックスです。
pRZ	Addgene	#27663	均質末端を持つin vitro転写産物を産生するためのプラスミド
Qiagen RNeasy MinElute Cleanup	Qiagen	74204	RNAクリーンアップには、プロトコルで提供されている修正されたプロトコルを使用してください。
QIAquick ゲル抽出キット (50)	Qiagen	28704	in vitro転写に使用されるdsDNA断片のゲル抽出とクリーンアップのためのキットです。
サランプレミアムプラスチックラップ	サランラップ	アマゾン	乾燥ジェル用。
SYBR Gold	Invitrogen	S11494	超高感度核酸ゲル染色剤。
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	核酸ゲル染色剤。
TE	Sigma	93283-100ML	10 mM Tris-HCl、1 mM 二ナトリウム EDTA、pH 8.0
TEMED	Fisher	110-18-9	尿素変性ポリアクリルアミドゲル用。
SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES付きサーモミキサー	eppendorf	5382000023/5361000038	1.5mLチューブの温度制御インキュベーション用。
TOPO TA Cloning Kit	Life Technologies		Tackポリメラーゼの高速クローニング用キット。PCR産物を増幅して、in vitro RNA転写用のT7および/またはSP6プロモーターを含むベクターにします。
TURBO DNase (2 U⁄&マイクロ;L)	Ambion	AM2238	in vitro転写反応からのDNA除去用。
尿素	シグマ	51456-500G	尿素変性ポリアクリルアミドゲル用。
Whatman 3MMペーパー	GE Healthcare	3030-154	ゲル乾燥用クロマトグラフィーペーパー。