超音波増強原発性成人線維芽細胞分離

サマリー

我々は、初心者(例えば、学生)が実行可能な、簡単で迅速かつ信頼性の高い方法で原発性成人線維芽細胞を分離するためのプロトコルを提示する。この手順は、酵素組織の消化と機械的撹拌を超音波と組み合わせて、一次線維芽細胞を得ます。プロトコルは、特定の実験要件(例えば、ヒト組織)に容易に適合させることができる。

要約

原発性成人線維芽細胞は、すべての体組織における線維症、線維芽細胞相互作用および炎症を研究するための重要なツールとなっている。一次線維芽細胞は筋線維芽細胞分化または老化誘導のために無期限に分裂することができないため、新しい培養物を定期的に確立する必要があります。しかし、信頼性の高い分離プロトコルと一次線維芽細胞分離自体を開発する過程で克服すべきいくつかの障害があります:方法の難易度(特に初心者向け)、細菌汚染のリスク、一次線維芽細胞が実験に使用されるまでに必要な時間、およびその後の細胞品質と生存率。本研究では、酵素消化と超音波攪拌を組み合わせた、マウス心臓、肺、肝臓および腎臓から原発性成人線維芽細胞を分離および培養するための、迅速で信頼性が高く、学習しやすいプロトコルが提供される。

概要

線維芽細胞は、複数のステラプロセスと広範な大まかな小平性網膜1、2を持つ平らな、紡錘形の細胞である。平均線維芽細胞は30 - 100 μmを測定し、57 ±3日1、3の寿命を有する。ヒト線維芽細胞の平均細胞周期持続時間は、培養条件4に応じて16〜48時間の範囲である。培養された原発性線維芽細胞の複製能力と機能的品質がドナー年齢と否定的に相関するという証拠があり、可能であれば若いドナー(動物または患者)が好ましいことを示唆している5、6.

線維芽細胞は、ほとんどの哺乳類の体組織の主要な細胞型を構成する。彼らのユビキタスな存在にもかかわらず、線維芽細胞の分子同定はまだ挑戦7である。線維芽細胞は、胚発生時に異なるソースから組織や臓器を開発するために移行^{します 8}.このため、線維芽細胞に見られるマーカータンパク質は多数存在しますが、すべての線維芽細胞集団に存在し、線維芽細胞に排他的なユニークなマ....

プロトコル

以下のプロトコルは、ドイツのテクニッシュ大学ドレスデン(ファイル番号:T 2014/4)および国際的に受け入れられている動物ケアガイドライン(FELASA)17の制度的な動物ケアガイドラインに従っています。図 1は、セルの分離プロセスを視覚化します。

1. セットアップ、マテリアル、メディアの準備

1. 細胞培養培地、PBS溶液、コラゲナーゼブレンドストック溶液(無菌超純水の12mLで凍結乾燥コラゲナーゼブレンドの50mgを再構成)、および0.25%トリプシン溶液を調出す。
2. 培地、PBS及びトリプシン溶液を37°Cに温める。
3. 超音波水浴を37°Cに予熱します。
4. 鉗子、ステンレス鋼のへら、メス(器官あたり2xメス)および70%のエタノールが付いている2つのガラスビーカーを消毒し、細胞培養フードの下にこれらの材料を置く。
5. 1つのビーカーに70%のエタノールを入れ、もう一方を滅菌水またはPBS溶液で満たします。これらのビーカーは、各臓器の行列の後に器具を消毒し、洗浄するために必要とされます。
6. 湿った氷の上に冷たいPBSを含む無菌の15 mLプラスチック管を置く。チューブの数は、線維芽細胞を分離したい器官の数によって異なります。

結果

固体マウス組織から成体線維芽細胞を分離するこのプロトコルの能力が実証された。免疫蛍光染色や増殖実験などの後続の実験に用いることができる生細胞芽細胞が得られた(図2D-F、図5A)。

成体線維芽細胞は、通常単層12、18で成長する複数の細胞プロセスを持つ平らな紡錘形細胞である。得られた結果は、これらの形態学的特徴を反映し、異なる器官からの線維芽細胞集団における明確な形態学的差を示す(図2)。腎線維芽細胞は特に小さく、心臓、肺または肝線維芽細胞よりも高密度で成長した(図2)。

ディスカッション

不死線維芽細胞株と比較して、一次線維芽細胞はいくつかの利点を提供する。それらは高品質および量で費用を効果的に隔離することができる。さらに、一次培養は、複数の個体から細胞を研究する可能性を提供し、得られた結果の信頼性を高め、単に細胞培養アーティファクトを研究する可能性を減少させる。新しい一次培養の連続的な生成は、一般的に繰り返し通過後に発生する遺伝的変化を防ぎます^21.さらに、細胞老化22、23^または増加した筋線維芽細胞分化は、高い^通路20における培養においてより頻繁に起こる。低い通過路(2-3)では、基底筋線維芽細胞数は約20〜30%(図示せず)であり、β-ガラクトーシダーゼ発現に基づいて老化と考えられていたのはわずか2.89%であった(図5B)。このため、最大5回まで培養物を通過し、以下に置き換えることをお勧めします。これにより、実.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% トリプシン-EDTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	T4049-100ML
Antibiotics	Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA	Gibco LS15140148	ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000 U/mL)
細胞培養フード	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51023608	HeraSafe KSP15
細胞培養インキュベーター	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	50049176	BBD 6220
細胞培養プレート	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	容器によって異なります	6、12、24ウェル Nunclon 表面
細胞培養吸引	VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany	20727400	BVCプロフェッショナル吸引
セルストレーナー(メッシュ)	コーニング、テュークスベリー、米国	431750	40 µm ナイロン
遠心分離機	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	75007213	メガフュージ8R
コードレスピペッティングコントローラー	ヒルシュマン、エバーシュタット、ドイツ	9907200	ピペタス
使い捨てピペットチップ	シグマ・アルドリッチ、セントルイス、米国	容量によります	ピペット用のSafeSealチップ(10 & micro;L、20 µL、100 µL、200 µL、1000 µL)
使い捨てプラスチックピペット	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	vary on volume	5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel	Myco Medical, Cary, USA	n.a.Techno	cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	41965-062	High glucose
Eppendorf tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	ボリューム	50µに依存します。L、500 µL、1.500µL、2.000 µL
子牛胎児血清 (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	F2442-50ML
コラゲナーゼブレンド	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	5401020001	Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D8537-500ML	500 mL
老化検出キット	Abcam, Cambridge, UK	ab65351
Shaker/ Vortex	IKA, Staufen im Breisgau, Germany	n.a.MS2	Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
滅菌プラスチックチューブ	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Falcon 352095	BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany	312	Sonorex RK100H
手術用ハサミ (非外傷性)	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	NR 82
手術用ハサミ	Aesculap AG、Tuttlingen、ドイツ	eq 1060.09
外科用鉗子	Aesculap AG、Tuttlingen、ドイツ	BD577