胃癌患者由来異種移植片モデルおよび原発細胞株の確立

サマリー

現在のプロトコルは、外科的胃癌サンプルから患者由来異種移植片(PDX)モデルおよび原発癌細胞株を確立する方法を説明する。この方法は、創薬やがん生物学の研究に役立つツールです。

要約

腫瘍生物学の理解を深め、治療薬の有効性を調べる前臨床モデルの使用は、がん研究の鍵です。前臨床研究のための多くの確立された胃癌細胞株および多くの従来のトランスジェニックマウスモデルがあるが、インビトロおよびインビボモデルの欠点は、その適用を制限する。これらのモデルの特性は培養において変化したため、腫瘍の不均一性をモデル化することはなくなり、その応答はヒトの応答を予測することができませんでした。したがって、腫瘍の不均一性をよりよく表す代替モデルが開発されている。患者由来異種移植片(PDX)モデルは、癌細胞の組織学的外観を維持し、腫瘍内不均一性を保持し、腫瘍微小環境の関連するヒト成分をよりよく反映する。しかし、通常、多くの胃患者の予想生存期間よりも長いPDXモデルの開発には4~8ヶ月かかります。このため、原発性癌細胞株の確立は、薬物応答研究のための効果的な補完的な方法である可能性がある。現在のプロトコルは、外科的胃癌サンプルからPDXモデルおよび原発癌細胞株を確立する方法を説明する。これらの方法は、創薬やがん生物学の研究に有用なツールを提供します。

概要

胃癌は、世界で5番目に一般的な癌であり、癌死の第3の主要な原因である。2018年には、世界的に100万人以上の新しい胃癌症例が診断され、推定783,000人がこの疾患1によって死亡した。胃癌の発生率と死亡率は、北東アジア諸国2、3で非常に高いままです。がん治療の分野で大きな進歩を遂げたにもかかわらず、進行性胃癌患者の予後は依然として乏しく、5年生存率は約25%4,5,6, ^7,.したがって、胃癌に対する新たな治療戦略の開発が急務である。

胃癌の治療は、その高い不均一性8、9のために困難です。このように、精密医療を実現するために腫瘍の不均一性の課題にどう取り組むかという問題は、がん研究の中心です。インビトロおよびインビボモデルは、胃癌の異種メカニズムおよび生物学を解明する上で重要な役割を果たす。しかし、前臨床研究のための多数の胃癌細胞株および多くの従来のトランスジェニックマウスモデルがあるが、これらのモデルの欠点は、その用途^{を制限する10.}これらのモデルの特性は培養において変化したため、腫瘍の不均一性をモデル化することはなくなり、その応答は^ヒト11における応答を予測できなかった。これらの問題は、標的薬に反応するがん患者のサブグループを特定する可能性を著しく制限する。原発性腫瘍の短期的な培養は、抗癌薬理学的特性を調査するための比較的迅速かつパーソナライズされた方法を提供し、これはおそらくパーソナライズされた癌治療の特徴となるでしょう。

患者由来異種移植片(PDX)は、薬物応答^{プロファイリング12}の代替前臨床モデルとして好ましい。さらに、PDXモデルは癌13、14の開始および進行を研究するための強力な用具を提供する。PDXモデルは、癌細胞の組織学的外観を維持し、腫瘍内不均一性を保持し、腫瘍微小環境15、16の関連するヒト成分をよりよく反映する。しかし、広く使用されているPDXモデルの限界は、ヒト固形腫瘍を確立し、連続的に伝播するための低い成功率である。本研究では、PDXモデルおよび一次細胞株を確立するためのまともに成功した方法について述べる。

プロトコル

この人間の研究は、Sun Yatsen大学癌センター(SYSUCC、広州、中国)の機関倫理審査委員会によって承認されました。動物研究は、Sun Yatsen大学の機関動物ケア・使用委員会によって承認されました。注:すべての実験は、血液媒介性病原体に対する職業暴露保護ガイドラインを含む、関連する法律および制度ガイドラインに従って行われました。

1. サンプル調製

1. 手術から直接胃癌組織(P0=通路0)を得る。腫瘍標本は0.5 cm³より大きくする必要があります。
2. ストック溶液の3-4 mLを調製する:例えば、10%の胎児ウシ血清(FBS)、100 U/mLペニシリンおよび0.1mg/mLストレプトマイシンを補充したRPMI-1640培地(1x)。
3. 新鮮な腫瘍標本を4°Cのストック溶液に4時間以下入れます。

2. PDXモデルの確立 (図1)

1. 滅菌手術領域を確保するために、動物実験室に移る前に30分以上紫外線ですべての材料を消毒する。
   注:手術室は、ジクロロイソシアヌリ酸坐剤消毒剤で机をきれいにする前に、30分間紫外線で消毒する必要があります。その後、ポビドネヨウ素は、皮膚を消毒するために使用されます。
2. 鉗子とはさみを使用して、慎重に腫瘍組織を解剖し、無菌条件下でいくつかの小片(約1mm³キューブ)にそれらをトリミングします。
3. 麻酔機で1-1.5%イソルランに曝露することにより、女性の5〜7週齢のNOD-SCID-IL2rg(NSG)マウスを麻酔する。
   1. それは苦労を停止するが、呼吸さえ維持するまで、マウスを麻酔します。
      注:50 mLの管は麻酔機械と同様に機能する簡単な装置である。手術時間が短いため、乾燥を防ぐための獣医眼の目の欠損の使用は不要です。
4. 無菌はさみを使用して両方の背中の側面に1 cmの切開を行い、マウスの各側面に1つの腫瘍片を移植する。
   1. 腫瘍片が抜けないようにするには、生殖不能鉗子を使用して皮下組織を破壊する。次に、腫瘍組織の一部をクリップし、深部位に配置します。
5. 外科縫合針で皮下縫合によってインプラント領域を閉じ、ラベル付きの耳のタグでマウスの耳をマークする
6. ヨウ素で創傷を殺菌する。
7. 手術後は、胸骨の再発を維持しながら、マウスを空のケージに静かに置きます。マウスの状態に細心の注意を払う;彼らは目を覚ますと、約3-4分後に歩き始めます。手術を受けたマウスを別の新しいケージに置き、手術を受けていないマウスを分離します。
8. 移植部位の触診によって腫瘍サイズを評価する。週に2回、バーニエキャリパーで腫瘍を測定する。
9. 腫瘍が直径10mmに達すると、動物の状態が悪化するか、腫瘍が潰瘍化し、IRB承認法でマウスを安楽死させる。再インプラントは、通過のために2つの新しいマウスに新鮮な腫瘍断片を採取し、または一次細胞株の単離のために氷上のPBSに試料を一時的に保存する。

3. 組織凍結保存

注: この部分では、主にライブティッシュキットクライオキットの方法を参照しています。主なキットと機器は、材料の表に記載されています。

1. 腫瘍の直径が直径が10mmを超える場合は、IRB承認法でマウスを安楽死させる。
2. 無菌鉗子およびはさみを用いて、マウスから腫瘍をゆっくりと単離する。
3. 腫瘍組織をDPBSで10cmの皿で洗います。壊死領域、脂肪組織、血栓、鉗子およびはさみで結合組織を解剖し、除去する。
4. 腫瘍組織を金型で最大1mmの厚さに切る。
5. DPBSでスライスを10cmの皿で洗います。
   注:ガラス化プロセスでは、ステップ3.6-3.8でV1/V2/V3とラベル付けされたチューブを使用します。主な成分はDMSOとショ糖です。
6. スライスを鉗子でチューブV1に移し、チューブを4°Cで4分間インキュベートし、チューブを短時間反転させ、さらに4分間4°Cに置きます。
7. V1溶液を注ぎ、10cmの皿にスライスします。スライスを鉗子でチューブV2に移し、チューブV2を4°Cで4分間インキュベートし、チューブを短時間反転させ、さらに4分間4°Cに置きます。
8. V2溶液を注ぎ、10cmの皿にスライスします。スライスを鉗子でチューブV3に移し、チューブを4°Cで5分間インキュベートし、チューブを短時間反転させ、少なくとも5分間4°Cに置きます。
   1. 複数のスライスが浮遊したままの場合は、チューブを一時的に転がして反転させ、すべてのスライスが完全に沈むまでチューブを再び4°Cに置きます。必要に応じて、フローティング スライスを破棄します。
9. V3溶液を注ぎ、10cmの皿にスライスします。
10. 組織ホルダーを適切な長さに切り、滅菌ガーゼの上に置きます。スライスをホルダーに移します。ホルダーをガーゼで包み、鉗子を使って液体窒素に入れ、その後5分間インキュベーションを行います。
11. 低温バイアルに組織情報をラベル付けします。
12. 組織スライスを持つホルダーを液体窒素に貯蔵された低温バイアルに移します。

4. 一次細胞の分離 (図2)

1. 121 °Cで高圧蒸気で鉗子およびはさみを殺菌する30分間。
2. 切除標本または収穫されたPDX組織からの切除胃癌サンプル。氷の上にティッシュを置き、その後、10センチメートルの無菌培養皿に組織を転送します。
3. 壊死領域、脂肪組織、血栓、鉗子およびはさみで結合組織を解剖し、除去する。
4. 100 U/mLペニシリンと0.1 mg/mLストレプトマイシンを含むDPBSで腫瘍組織を10cm皿に1回洗浄します。
5. 皿の蓋に腫瘍組織を1mm³に切ります。各部分の最大厚さは1ミリメートルでなければなりません。
6. 1型コラゲナーゼおよびトリプシン(1:14)溶液の約7 mLを用いて50 mL遠心チューブに組織を移します。混合物を短時間渦にする。
7. 37°Cの水浴でチューブを30〜40分間インキュベートし、5分ごとに混合物を渦します。
8. チューブに10%FBSを補充したRPMI-1640培地(1x)を同量に加えます。混合物を徹底的に渦。
9. 40 μm フィルターを通してろ過を遅くすることにより、混合物を新しい 50 mL 遠心分離管に移します。
   注:40 μm フィルターを使用して、がん細胞の比率を高くします。必要に応じて、100 μm フィルターを使用して、免疫細胞などのより多くの種類の細胞を保存できます。
10. RTで5-7分間113-163 x gで濾液を遠心分離します。
11. 5mLのPBSでペレットを洗浄し、上清を慎重に取り除きます。
12. ペレットが赤色の場合、多くの赤血球が含まれています。500 μLの赤血球リシスバッファーでペレットをゆっくりと再中断します。5分のインキュベーションの後、PBSの5 mLを追加し、慎重に上清を除去します。
13. 培養培地でペレットを再懸濁し、無菌10cm皿に混合物を移す。
14. 2~3日ごとに培地を血清含有培地に置き換えます。
15. トリプシン/EDTAを用いて一次細胞を50%合流に達すると通過する。

結果

ここで、手術からの腫瘍組織は、次のステップまでストック溶液中に保存した。4時間以内に、腫瘍組織を小片に切断し、イソフルラン浸綿を用いて麻酔を行ったNSGマウスの後部側面に移植した。1cm3より大きい腫瘍は、新しいマウスへの移植のために切除することができる(図1)または慎重にスライスし、プロトコルに従って液体窒素中に保存することができる。この研究では、第一世代の腫瘍は後の世代の腫瘍よりもゆっくりと成長し、適切なサイズに達するまでに3週間以上をかかえた。第一世代皮下腫瘍形成の成功率は80%を超えた。顕微鏡下でH&E染色によりPDXモデルから癌細胞の同一性を確認した(図3C)。最後に、凍結保存された腫瘍組織からの腫瘍形成の成功率は約95%であった。

原発癌細胞は、個々の腫瘍を調べるための別の方法として単離された。細胞は、手術標本またはPDXモデルのいずれかから単離された。腫瘍組織をDPBSで洗浄し、断片的に切断した。組織断片を1型コラーゲナ...

ディスカッション

胃癌は、限られた治療選択肢を持つ積極的な疾患です。したがって、胃癌のモデルは、クリニック4、8、17への直接翻訳で機能的研究を可能にする重要なリソースとなっています。ここでは、胃癌PDXモデル及び一次細胞株を確立する方法及びプロトコルについて述べた。重要なことに、胃癌標本の形態学的および生物学的特性の両方がPDXモデルにほとんど保持された。

PDX モデルを確立するためのプロトコルには、エングラフメント速度を高めるために強調する必要がある重要な点がいくつかあります。NSG(NOD-SCID-IL2rg)マウスは、これらのマウスがより重度の免疫抑制であり、T、BおよびNK細胞18、19、20、21において欠乏であるので、

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
40 μm Cell Strainer	Biologix, Shandong, China	15-1040
生物顕微鏡	OLYMPUS, Tokyo, Japan	OLYMPUS CKX41
Centrifuge	Eppendorf, Mittelsachsen, Germany.	5427R
CO2インキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック、カールスバッド、カリフォルニア州、米国	HERACELL 150i
DPBS	Basalmedia Technology、上海、中国	L40601
電気サーモスタット水キャビネット	Yiheng、上海、中国	DK-8AXX
ウシ胎児血清	Wisent Biotechnology、バンクーバー、カナダ	86150040
イソフルラン	バクスター、中国	CN2L9100
ライブティッシュキット クライオキット	Celliver Biotechnology、上海、中国	LT2601
ライブティッシュ解凍キット	Celliver Biotechnology、上海、中国	LT2602
NSG	Biocytogen、北京、中国	B-CM-002-4-5W
ペニシリン&ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック、カールスバッド、カリフォルニア州、米国	15140122
赤血球溶解バッファー	Solarbio、北京、中国	R1010
RPMI-1640 中	サーモフィッシャーサイエンティフィック、カールスバッド、カリフォルニア、米国	8118367
Surgical Suture Needles with Thread	LingQiao, Ningbo, China	3/8 arc 4×10
組織処理された型と補助ブレード	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2603
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	2003779
Type 1 collagenase	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	17100017