方法論記事

カエノルハブ炎エレガンスにおける2-アラチドノイルグリセロールの定量のための過熱基準の合成

DOI：

10.3791/59882

⸱

2019年9月21日

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1Instituto de Química Rosario (IQUIR-CONICET), Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 2Laboratorio de Fisiología Microbiana, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 3Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario

この記事について

サマリー

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本研究では、C.エレガンスにおけるエンドカンナビノイド2-アラキドノイルグリセロール(2-AG)を検出し、定量する堅牢でわかりやすい方法について述べている。同位体希釈および液体クロマトグラフィー-エレクトロプレーメントイオン化タンデム質量分析法(LC-ESI-MS/MS)による2-AGの定量に使用した分析的過熱規格です。

要約

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本研究では、液体クロマトグラフィー・エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法(LC-ESI-MS/MS)により、2-アラキドノールグリセロール(2-AG)を定性的かつ定量的に分析する分析基準を作成する方法を提示する。エンドカンナビノイドは、様々な生物の複数の生物学的プロセスを調節する保存脂質メディエーターです。C.エレガンスでは、2-AGは、ダウアー形成およびコレステロール代謝の変調を含む異なる役割を有することが見出されている。本報告では、2-AG定量に必要な過量規格のコストと安定性に関連する困難を克服する方法について説明する。標準の合成のためのプロシージャは簡単で、有機合成の専門知識または特別な装置の必要性なしであらゆる実験室で行うことができる。さらに、C.エレガンス培養から過熱基準を抽出するフォルチ法の改変について説明する。最後に、安定な同位体標識アナログ1-AG-d5を用いて2-AGを検出する定量的および分析的方法について説明し、高速クロマトグラフィー実行で信頼性の高い結果を提供する。この手順は、異なる生物における代謝産物の他の研究にも適用可能である一方で、C.エレガンスにおける2-AGの複数の役割を研究するのに有用である。

概要

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エンドカンナビノイドは、様々な生物の中で複数の生物学的プロセスを調節し、脂質メディエーター1を保存している。最初に発見され、最もよく特徴付けられたエンドカンナビノイドは、アナンダミド(アラキドノエレタノールアミド、AEA)および2-アラキドノイルグリセロール(2-AG)である。エンドカンナビノイドは、脳報酬システムだけでなく、薬物中毒、記憶、気分、代謝プロセス2に関与するものを含む多くの重要な役割を果たしています。AEAおよび2-AGは必要なときだけ合成され、短い寿命を持ち、輸送タンパク質の再取り込みおよび加水分解3によって分解される。

カエノルハブ炎エレガンス(C.エレガンス)のような動物モデルの使用は、アポトーシス、細胞シグナル伝達、細胞周期、細胞極性、遺伝子調節、代謝、老化を含む多種多様な生物学的プロセスを研究することが重要になっています。と性決定4,5.さらに、C.エレガンスは多価不飽和脂肪酸(PUFA)の生理的役割を研究するための優れたモデルです。AEAはC.エレガンスで同定され、食事制限6....

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プロトコル

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1. 1-AG-d5調製

注:定量アッセイの定量内部標準として1-AG-d5を取得する場合は、以下に説明するようにプロトコルに従ってください。

  1. 差動保護
    1. 一次アルコールのみを保護するために、まずパスツールピペットを使用して10 mL反応管にグリセロールd8の38mgを追加し、磁気攪拌機を追加します。
    2. 5 mLハミルトンシリンジを使用して無水ジクロロメタン(DCM)の5 mLを追加し、不活性な雰囲気を得るために乾燥N2でチューブを充填します。
    3. 蒸留酢酸エチルで満たされた浅いデュワーフラスコを使用してお風呂を準備します。
    4. 気密に閉じた反応管を浴中に入れ、溶媒が凍るまで酢酸エチルに液体N2をゆっくりと加えて冷却する。
      注意:液体は室温(RT)で激しく沸騰し、目や皮膚に接触すると重度の火傷を引き起こす可能性があります。
    5. ハミルトン注射器を使用して54mgの無水コリジンを添加します。
      注意:コリジンは揮発性であり、非常に強く、不快な香りを持っています。
    6. 塩化テルトブチルジメチルシルを70mg加え、磁気攪拌機で-78°Cで3時間全体をかき混ぜます。
    7. 3時間後、RTで温めるために反応を残し、さらに12時間....

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結果

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同位体標識されたアナログを、3段階合成法を用いて市販のd8-グリセロールおよびアラキドン酸から合成することに成功した(図2、図3)。これらのステップは簡単で、洗練された装置、特別に制御された条件、または高価な試薬を必要としない。したがって、この方法は堅牢であり、異なる脂肪酸を含むモノアシルグリセリドを合成するために正常に拡張されてもよい。

1-AG-d5は、核磁気分光法を用いて構造的に特徴付けられた。1H NMRは、アラキドノイル鎖の8つのビニル陽子と2.40ppmのトリプレットを統合する5.44ppm〜4.93 ppmの特徴的な多重を示し、カルボニル基に対するα位置の2つの陽子に相当する。2DNMRでは、グリセロール部の5重水素に割り当て可能な2.......

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ディスカッション

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エンドカンナビノイドは、C.エレガンス7におけるダウアー形成の調節に関与している脂質のクラスである。より具体的には、多価不飽和脂肪酸(PUFA)の合成は、コレステロールの密売およびワームの生殖発達にとって重要である。2-AG、エンドカンナビノイドを含むアラキドン酸は、コレステロール代謝を損なったワームの通常のサイクルにダウアー幼虫を回復させる責任があることがここで明らかにされた7.

最近発見されたコレステロールの人身売買および他の生物学的プロセスの増強における2-AGの重要性と、脂質がこのプロセスにどのように影響するかについてほとんど知られていないことを考えると、この内因性カンナビノイドの信頼性の高い検出方法が必要である。この単純で堅牢な合成法の開発に成功し、このプロトコルでは、低級アナログ1-AG-d5を得ることが重要なステップです。

モノアシルグリセロールを定量化する報告された方法のほとん.......

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開示事項

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著者は利益相反を宣言しない。

謝辞

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この研究は、アジェンシア・ナシオナル・デ・プロモシオン・シエンティフィカ・イ・テクノロジカ(ANPCyT, PICT 2014-3693)からの研究助成金によって支援されました。J.F.d.L.、G.P.、B.H.C.はコニストの仲間です。D.d.M.とG.R.L.は、コニストのリサーチキャリアのメンバーです。私たちは、LC-MS/MS分析と有益な議論のためのゴンサロ・ランベルト(INMET)に感謝しています。ビデオ撮影と編集は、ラミロ・オルテガとマリア・ソレダ・カサソラによって行われました ディレクシオン・デ・コムニカシオン・デ・ラ・シエンシア、ファカルタ・デ・シエンシア・ポリティカ・イ・レラシオネス・インターナショナル、ロサリオのナシオナル・デ・ロサリオ大学。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4-ジメチルアミノピリジンSigma-Aldrich107700試薬グレード、99%
抗酸化剤 BHTSigma-AldrichW21805
アラキドン酸Sigma-Aldrich10931
グリセロール-d8Sigma-Aldrich447498
質量検出器 トリプル四重極Thermo ScientificTSQ Quantum Access Max
N,N'-ジイソプロピルカルボジイミドSigma-AldrichD125407
NMR 分光計BrukerAvance II 300 MHz
逆相 HPLC カラムThermo Fisher25003-052130C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl ChlorideSigma-Aldrich190500試薬グレード、97%
フッ化テトラブチルアンモニウムSigma-Aldrich2161431.0M in THF
UHPLC システムThermo ScientificUltimate 3000 RSLC Dionex
ワーム N2 ブリストルCaenorhabditis 遺伝学センター (CGC)

参考文献

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  1. McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. Evolutionary origins of the endocannabinoid system. Gene. 370, 64-74 (2006).
  2. Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence.

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