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方法論記事

癌における広範な非遺伝的転写伸長欠損(TE)を研究する慢性CDK9阻害のマウス細胞株ベースモデル

5.3K 閲覧数

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DOI：

10.3791/59910

⸱

2019年9月26日

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cancer and Blood Diseases Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC)

この記事について

サマリー

このプロトコルは、非遺伝的欠陥転写伸びのインビトロマウス癌モデルを詳述する。ここで、CDK9の慢性阻害は、全癌型の約20%に存在する臨床的に過剰なTE間違いなく現象を模倣し、研究するために、炎症反応遺伝子に沿ったRNA Pol IIの生産的な伸びを抑制するために使用される。

要約

我々は以前に、癌のサブセットは、mRNA転写伸長(TE)の広範な欠陥を伴う世界的な転写規制緩和によって定義されていると報告しました- 我々は間違いなくTEとしてそのような癌を呼び出します。特に、TE間違いなく癌は、インターフェロン/JAK/STATおよびTNF/NF-B経路などの大きな遺伝子群における偽の転写および欠陥のあるmRNA処理によって特徴付けられ、その抑制につながる。腎細胞癌および転移性黒色腫患者における腫瘍のTEは間違いなく免疫療法における不十分な応答および結果と相関する。TEの間違いなく癌を調査することの重要性を考えると、免疫療法に対する重大な障害を引き起こすので、このプロトコルの目的は、これらの広範な非遺伝的研究を研究するために、インビトロTE間違いなくマウスモデルを確立することです。癌の転写異常と新しい洞察を得る, 既存の薬剤のための新しい用途, またはそのような癌に対する新しい戦略を見つける.RNAポリメラーゼII(RNA Pol II)のC末端反復ドメイン(CTD)上のセリン2残基のリン酸化を損分化する慢性フラボピリドール媒介CDK9阻害の使用を詳述し、RNA Pol IIの放出を生産的な転写に抑制する。伸長。TEは間違いなく特定の体細胞変異に分類されていないことを考えると、薬理学的モデルは有利であり、それらに観察される広範な転写およびエピジェネティックな欠陥を最もよく模倣する。フラボピリドールの最適化された亜致死量の使用は、転写伸長およびmRNA処理欠陥における非遺伝的広範な破壊の一般化可能なモデルを作成する唯一の有効な戦略であり、臨床的に観察されたTEを密接に模倣する間違いなく特性。したがって、TEのこのモデルは間違いなく、免疫媒介細胞攻撃に抵抗するそれらを可能にする、細胞自律的な因子を解剖するために利用することができる。

概要

ほぼすべての活性遺伝子の発現における重要な速度制限ステップは、プロモーター近位休止から生産的な伸び1、2へのRNAポリメラーゼII(RNA Pol II)の遷移である。転写伸びのエピジェネティックな調節がTEと定義された複数のヒト悪性腫瘍の進行を確実に助長することを考えると、反応不良に相当する炎症性反応経路における最適でないシグナル伝達を引き起こす免疫療法3への結果は、このプロトコルの包括的な目標は、癌におけるこれらの広範な非遺伝的転写異常を研究するために有用なインビトロモデルを確立することです。この点において、CDK9の慢性薬理学的阻害の使用は、転写伸長およびmRNA処理欠陥における非遺伝的広範な破壊の全身化可能なモデルを作成するための有効な戦略である。慢性CDK9阻害を用いた根拠は、RNA Pol IIのC末端反復ドメイン(CTD)上のセリン2残基のリン酸化を緩和し、したがって、生産的な転写伸びへのRNA Pol IIの放出を抑制する。また、TEは、我々のグループ3によって前述した、間違いなく癌は、任意の特定の体細胞変異下に分類されない。したがって、非遺伝的(薬理学的)モデルは有利であり、それらに観察される広範な転写およびエピジェネティックな欠陥を最もよく模倣する。本明細行の方法は、マウス癌細胞の慢性フラボピリドール治療モデルの生成および特徴付けについて詳述する。この方法は、TNF/NF-κBおよびインターフェロン/STATシグナル伝達のような、より長いゲノム長さによって特徴付けられた遺伝子に沿った転写伸長を実証的に破壊し、そのレベルで深く制御される。転写伸長3,4,5.全体的に、転写伸び欠陥のこの最適化されたマウス細胞ラインモデルは、新たに記述されたTE間違いなく腫瘍を研究する我々の知識に対する唯一のモデルであり、抗腫瘍免疫攻撃に対する耐性を駆動し、悪用する有用なシステムをレンダリングし、がんにおけるコア転写機械における非遺伝的欠陥の脆弱性を調べる。

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プロトコル

シンシナティ小児研究財団の動物保護・使用委員会と施設バイオセーフティ委員会は、すべての動物実験手順(IACUCプロトコル#2017-0061およびIBCプロトコル#IBC2016-0016)を承認しました。実験は、実験動物のケアと使用に関するNIHガイドに記載されている基準に従って行われました。

1. フラボピリドール治療によるRNA Pol IIの慢性阻害-基本戦略

  1. 種子B16/F10マウス黒色腫細胞の低密度(0.2 x 106)を対応する培地中の10cm培養プレート(DMEM)、10%のウシ血清[FBS]、1%ペニシリンおよびストレプトマイシン[ペン/ストレップ])およびインキュベート37 °Cで、5%CO2加湿インキュベーター。
  2. 翌日、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄し、RNA Pol II伸長因子p-TEFb(サイクリンT/CDK9)の阻害剤であるフラボピリドールの亜致死用量(推定25nM)を用いて培養培地の新しいバッチを追加し、それ以上の1週間を過ごさない。サブカルチャ。
  3. フラボピリドール治療の1週間後、TEで見られる転写伸び欠陥の様々な属性を要約するモデルの能力を評価するために確認アッセイを行い、間違いなく癌である。

2. 生成マウスTEにおけるインターフェロン(IFN)経路および腫瘍壊死因子(TNF)経路シグナル伝達の欠陥RNA Pol II機能および障害を評価するための確認免疫ブロットアッセイ

  1. フラボピリドールの培養等数(105)は、B16/F10マウス黒色腫細胞および親B16/F10マウス黒色腫細胞を12ウェルプレートの2つの異なるセットで処理した(RNA Pol IIの機能特性特性化のための1セットとサイトカイン用の他のセット)刺激)5%CO2加湿インキュベーターで一晩37°Cで。
  2. 翌日、マウスIFN-γ、IFN-α(5ng/mL)、またはTNF-α(5ng/mL)を37°Cで45分間用するサイトカイン刺激セットで細胞を処理する。
  3. さて、放射性免疫沈殿アッセイ(RIPA)リシスバッファーを用いて、サイトカインとRNA Pol IIの両方の機能特性特性セットの細胞からタンパク質を抽出します。
    1. 1x PBSで細胞を洗浄し、ウェルあたり50 μLのリシスバッファーで細胞をlyseします。スクレープ、次いで4°C、21,130 x gで細胞をペレットする。
    2. 洗剤可溶化後のタンパク質濃度に対する標準的な色分法アッセイ(ブラッドフォードまたは同様のアッセイ)を用いて、細胞溶解上清中のタンパク質を測定する。
  4. 各サンプルから測定されたタンパク質(15 μg)を同量にロードし、4%−18%ナトリウムドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲルで実行し、それらをポリビニリジンジフッ化物(PVDF)膜に移します。
  5. トリスバッファー付き生理生理生理生殖器20(TBST)で5%ドライミルクでPVDF膜をブロックし、その後一次抗体で4°Cで一晩インキュベーションを行う(RNA Pol II 1:1000;p-SER2 RNA Pol II 1:1000;p-SER5 RNA Pol II 1:1000;H3K36me3 1:2000;合計 H3 1:2000;STAT1 1:1000;p-STAT1 1:1000;NFκB 1:1000;p-NFκB 1:1000;β-アクチン1:5000)5%ウシ血清アルブミン中。
  6. 翌日、室温(RT)で1x TBSTでPVDF膜を1x TBSTで洗浄し、適切な二次抗体(RNA Pol II、p-SER2 RNA Pol II、p-SER5 RNA Pol II、およびp-SER5 RNA Pol II;抗ウサギ(1:5000)をH3K3333でインキュベートします。STAT1、p-STAT1、NFκB、およびp-NFκB)をRTで50分間検出し、市販のワサビペルオキシダーゼ(HRP)基板を用いてタンパク質シグナルを検出し、化学発光を強化した。
    注:β-アクチン一次使用はHRP結合であり、従って二次的ななしで開発することができる。

3. 生成されたマウスTEのmRNA処理欠陥を評価するための確認アッセイ

  1. フラボピリドールの種子等数(0.2 x 106)は、B16/F10マウス黒色腫細胞および親用B16/F10マウス黒色腫細胞を37°Cで6ウェルプレートで一晩5%CO2加湿インキュベーターで処理した。
  2. RNA抽出試薬またはキット(材料の表)を用いて60%の合流性で培養細胞から総RNAを抽出する。
  3. 以下の方法で抽出された総RNAからrRNAを枯渇させる:
    注:低入力プロトコルは、市販のキットからrRNAを枯渇させるために共同で選択されました
    1. 1つの水浴またはヒートブロックを70~75°Cに、別の水浴またはヒートブロックを37°Cに設定します。
    2. 選択的rRNA枯渇プローブの1μLとマイクロ遠心管内のハイブリダイゼーションバッファーの30 μLを用いて総RNA(ヌクレアーゼフリー水の2μLで100−500ng)を加え、ボルテックスによって穏やかに混合し、5分間70−75°Cでインキュベートします。
    3. 次に、チューブを37°Cの水浴/ヒートブロックに移し、サンプルを30分の期間にわたって37°Cに冷却します。
    4. 渦によって選択的rRNA枯渇プローブ磁気ビーズを再中断し、1.5 mL RNaseフリーマイクロ遠心管内のビーズのアリコート75 μLを再停止する。
    5. ビーズ懸濁液を磁気セパレータに1分間置き、ビーズを落ち着かせるようにします。優しく吸引し、上清を廃棄します。75 μLのヌクレアーゼフリー水を加え、磁気分離後に上清を廃棄してビーズをもう一度洗い直します。
    6. ハイブリダイゼーションバッファーの75 μLで洗浄されたビーズを再中断し、アリコート25 μLを別のチューブに再濁させ、後で使用するために37°Cで維持します。
    7. 残りの50μLビーズを磁気セパレータに1分間置き、上清を捨てます。ハイブリダイゼーションバッファーの20 μLでビーズを再中断し、後で使用するために37 °Cでそれを維持します。
    8. RNA/選択的rRNA枯渇プローブ混合物を30分間37°Cに冷却した後、チューブを短時間遠心分離し、チューブの底部にサンプルを収集する。
    9. RNA/選択的rRNA枯渇プローブ混合物の33 μLをステップ3.3.7から調製された磁気ビーズに移します。低速渦で混ぜます。
    10. チューブを37°Cで15分間インキュベートします。インキュベーション中は、時折内容物を優しく混ぜます。チューブの底部にサンプルを収集するための短い遠心分離が続きます。
    11. チューブを磁気セパレータに1分間置き、rRNAプローブ複合体をペレットします。この時間は上清を捨てない。上清にはrRNA枯渇RNAが含まれています。
    12. ステップ3.3.6からビーズの25 μLのチューブを磁気セパレータに1分間置き、上清を廃棄します。ステップ 3.3.11 からビーズの新しいチューブに上清を追加します。低速渦で混ぜます。
    13. チューブを37°Cで15分間インキュベートします。インキュベーション中は、時折内容物を優しく混ぜます。簡単にチューブを遠心分離し、チューブの底部にサンプルを収集します。
    14. チューブを磁気セパレータに1分間置き、rRNAプローブ複合体をペレットします。上清を捨てないようにしてください。rRNA枯渇RNAを含む上清(約53μL)を新しいチューブに移します。
    15. 分光光度計によるRNA収率の濃度を測定する。
  4. オリゴ(dT)25を含む磁気ビーズへの入力としてrRNA枯渇サンプルの半分を使用して、ポリA+RNAを以下の方法で抽出します。
    注:磁気ビーズの表面に結合されたオリゴdT配列を使用してポリAテールメッセンジャーRNAを単離するこのプロトコルは、市販のキット(材料の表)から共同で選ばれた。
    1. >30 s の短い渦を使用してバイアル内のオリゴ dT ビーズを再中断し、200 μL のオリゴ dT ビーズをチューブに転送します。同じボリューム (200 μL) のバインディング バッファーを追加し、再サスペンドします。
    2. チューブを磁石に1分間入れ、上清を捨てます。次に、磁石からチューブを取り出し、洗浄したオリゴdTビーズを100μLの結合バッファーで再中断します。
    3. 入力rRNA枯渇総RNAサンプルの体積を10mMトリス-HCl pH 7.5で100 μLに調整します。次に、100 μL のバインディング バッファーを追加します。
    4. 2分間65°Cに熱し、二次RNA構造を破壊する。さあ、すぐに氷の上に置きます。
    5. 100 μL 洗浄ビーズに総RNAの200 μLを追加します。完全に混合し、RTで5分間ローターで連続的に回転させることによって結合を可能にする。
    6. 1-2分間磁石の上にチューブを置き、慎重にすべての上清を削除し、慎重にすべての上清を削除します。
    7. 磁石からチューブを取り出し、洗浄バッファーの200 μLを追加します。
  5. 分光光度計により抽出されたポリA+RNAの純度と濃度を測定します。
    注: 260/280 の比率は 1.90−2.00、すべての RNA サンプルに対して 2.00−2.20 の 260/230 の比率は許容できると見なされます。
  6. セクション3.3からのrRNA枯渇サンプルの残りの半分をタンパク質Aカラムへの入力として使用する(RNA免疫沈殿[RIP]キット、材料の表に記載)は、モノクローナル7-メチルグアノシンを使用して5素位キャップRNAを免疫沈殿させる以下の方法で抗体:
    注:市販のRNA免疫沈殿キットを用いてm7GキャップメッセンジャーRNAを分離するこのプロトコルは、共同で選択され、さらに改変されました。
    1. 製造元のプロトコルに従ってRIPキットから得られたタンパク質A磁気ビーズを洗浄し、抗体をビーズに事前に結合する。
    2. 7-メチルグアノシン抗体の3μg(キットに設けられているウサギIgGは陰性制御を用いることができる)をキットから100μL洗浄バッファーに懸濁したマイクロ遠心管内のビーズに移す。
    3. RT. 遠心分離管で30分間低速回転でインキュベートし、その後、磁気セパレータにチューブを置き、上清を取り除き、廃棄します。
    4. チューブを取り外し、キットと渦から500μLの洗浄バッファーを簡単に追加します。チューブを短時間遠心分離し、その後もう一度磁気分離を行い、上清を取り除いて廃棄します。
    5. 手順 3.6.4 をもう一度繰り返します。
    6. (セクション3.3から)枯渇したrRNAの約120 ngを、予め洗浄された7-メチルグアノシン抗体結合ビーズに加える。RNase阻害剤の1 μLを追加します。軽度の撹拌で1-1.5hのRTでインキュベートします。
    7. ビーズを300x gで10秒でスピンダウンし、上限のないmRNA(非7-メチルグアノシン)mRNAを含む上清を新しいマイクロ遠心管に取り除きます。
    8. 100 μLの洗浄バッファーを追加し、同様に2回洗浄します。集めた上清を、非キャッピング(非7-メチルグアノシン)mRNAと同じマイクロ遠心管にプールする。氷の上に保管してください。
    9. 7M尿素、2%SDS、0.35M NaCl、10 mM EDTAおよび10 mMトリスを含む尿素リシスバッファー(ULB)の300 μLを有するビーズからキャップされた(7-メチルグアノシン)mRNAを溶出し、pH 7.5を65°Cで加熱して2mにする。
    10. 300 μLの熱化サンプル(キャップおよび上限なしmRNA)とフェノールの300 μLを混ぜ合わせて:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1;市販)(4°Cで保存)。反転してよく混ぜ、約10分間放置し、もう一度穏やかに混ぜます。
    11. 18,928 x gで2分間遠心分離機を使用し、最上層を慎重に新鮮なチューブにピプトし、下層を廃棄します。
    12. 300 μL のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1;4°Cで保存)をサンプルに加えます。反転してよく混ぜ、18,928 x gで1分間遠心分離機を慎重に、トップ層を新鮮なチューブにピプトし、下層を捨てます。
    13. 2-ポルパノールの300 μLと3M酢酸ナトリウム(pH 5.2)の30μLをキャップおよび上限なしのRNAに加えます。サンプルを数回反転し、20時間-20°Cに置きます。
    14. さて、4°Cで10分間18,928 x gでサンプルを遠心分離します。上清を慎重に取り出し、70%エタノールの500μLを加えます。
    15. 4 °Cで10分間18,928 x gで再び遠心分離機。上清を慎重に廃棄し、RTでペレットを5分未満乾燥させ、核リースフリー水でペレットを再懸濁します。
  7. 分光光度計でRNA収量の純度と濃度を測定します。260/280 比は、すべての RNA サンプルに対して 1.90−2.00 の範囲、および 2.00−2.20 の範囲の 260/230 の比率である必要があります。

4. マウスTEの応答を評価する確認アッセイは、間違いなくFasL媒介細胞死に対するモデルである

  1. フラボピリドールの種子等数(30,000細胞)は、対応する培地(DMEM)中の96ウェル培養プレート中のB16/F10マウス黒色腫細胞および親性B16/F10マウス黒色腫細胞を処理し、37°C、5%CO2加湿で一晩インキュベートするインキュベーター。
  2. 10 μg/mL抗His抗体の存在下でhの6FasL(0.1−1000 ng/mL)の異なる濃度の培養フード内の細胞を処理し、37°C、5%CO2加湿インキュベーターで24時間インキュベートします。
  3. 1x PBSバッファーで洗浄することにより、死んだ細胞を除去します。付属細胞を4%パラホルムアルデヒドで20分間RTで20分間固定し、4%のパラホルムアルデヒド(洗浄不要)を廃棄し、結晶バイオレット溶液(20%メタノール、1x PBSで0.5%結晶バイオレット)で30分間染色します。
  4. 水道水でプレートを軽くすすいで余分な汚れを取り除きます。RTで乾燥させるためにプレートを保ちます。
  5. 1x PBSに溶解した1xニオニオニック界面活性剤の100μLで結晶バイオレットを再溶解し、マイクロプレートリーダー内の570nmで吸光度を測定して細胞密度を測定する。

5. 抗原特異的細胞傷害性T細胞攻撃に対するマウスTEの反応を評価する探索的アッセイ

  1. OT-I CD8+細胞傷害性T細胞攻撃(CTL)の単離と活性化
    1. マウスCD8 T細胞分離キットを用いて磁気細胞分離によりOT-I TCR Tg RAG-1−/−マウスの脾臓からCD8+細胞を精製する:
      1. 完全なRPMI媒体の2つのOT-I TCR Tg Tg RAG-1−−−−およびマウスから2つの脾臓を収穫する。
      2. 70 μmフィルターで脾臓をつぶし、20 mLのRPMIで満たされた50 mLチューブに保持し、脂肪だけがフィルターに残るまで注射器の背面を使用します。
      3. 4 °Cで5分間220 x gで流れを遠心分離します。上清を捨てます。
      4. 前の遠心分離工程から脾臓ペレットに赤血球(RBC)リシスバッファーの1 mLを加え、混合物を1分間ピペットにする。
      5. RPMIの最大10 mLを加えることによって解決を中和する。
      6. 4 °Cで5分間220 x gの遠心分離機。上清を廃棄し、RPMIの10mLで再懸濁します。
      7. カウントするための小さなアリコートを取ります。残りを220xgで4°Cで5分間遠心分離する。
      8. カウントされた100万個毎の細胞について、市販の磁気分離システムバッファ(Mojoバッファーまたは同様のバッファ)の1mLでペレットを再中断する。
      9. ステップ5.1.1.8でペレット細胞の1mL毎に体積100μLの抗体カクテルを調出します。抗体カクテルには、ビオチン抗CD4、CD105、CD45R/B220、CD11c、CD49b、TER-119、CD19、CD11b、TCR γ/δ、およびCD44が含まれる。
      10. このカクテルを1mLペレット化した細胞に加え、氷の上に15分間置きます。
      11. 1mL再懸濁したペレット脾臓細胞に添加した抗体カクテルの100μLごとに100μLの磁気(ストレプトアビジン)ビーズを添加する。15分間氷の上に置いてください。
      12. 市販の磁気分離システムバッファの7 mLを追加します。さて、アリコートは、混合物の約3−4mLを新鮮なチューブにする。よく混ぜ、磁石に5分間固定します。
      13. 液体(CD8+細胞を含む)を氷上の新鮮なチューブにデカントします。さて、ステップ5.1.1.12からチューブに混合物の残りの3−4 mLをアリコートし、5分間磁石に固定し、液体(CD8+細胞の第2バッチを単離したCD8+細胞の第2バッチ)を氷上に保持したCD8+細胞の第1バッチを含む同じチューブに固定します。
    2. 種子設計付着線維芽細胞APC-(MEC.B7SigOVA)ラインは、特異的オブアルブミン(OVA)由来、H-2Kb制限ペプチドエピトープOVA257-264(SIINFEKL)、共刺激分子B7.1と共刺激分子B7.1と共刺激分子B7.1と共刺激分子B7.1で、24ウェルプレートでウェル当たり75,000細胞で、37°C、5%CO2加湿した。
      注:使用される付着線維芽細胞は、CCHMCのエディス・ヤンセン博士の研究室からの贈り物です。ラインはもともとアレルギーと免疫学のためのラホヤ研究所のスティーブン・P・シェーンバーガー博士の研究室で作成されました6.
    3. 24時間後、HEPESバッファー、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミンおよび高グルコースで市販されているイコーブの改変ダルベッコ培地(IMDM)でAPCの単層を一度洗浄し、0.5 x 106ナイーブOT-I CD8+細胞を2Mの2Mに加えます( ステップ5.1.1.1.13から)50 mM β-ME、2 mL EDTA、4 mM L-グルタミンおよびHEPESおよび10%FBSを補充する。
    4. 20時間後、非付着性OT-I細胞を穏やかに収穫し(浮遊OT-I細胞を用いて培養皿に培養物を集め、細胞を191 x gで2分間ペレット化し、生細胞を数え、共培養のためにそれらを移す)。
  2. B16/F10-OVA細胞とのCD8+細胞の共培養
    1. 種子OT-I由来CD8+細胞は、B16/F10(抗オブアルブミンを欠いている)との共培養における1:1(各300,000細胞)の割合で、未処理のB16/F10-OVA、およびB16/F10-OVA細胞をフラボピリドール(25nM)で前処理し、1週間で完全な6Mで処理した。5%CO 2加湿インキュベーターで37°Cで20hの培温。
    2. 20時間後、OT-I由来CD8+細胞を取り出します(浮遊OT-I由来CD8+細胞を含む培養皿に培養皿に培養物を集めることによって)。付着したB16/F10-OVA細胞を1x PBSで洗浄します。
    3. トリプシンを含む0.05%EDTAで接続されたB16/F10-OVA細胞の3つの群を5分間191xgでトリプシン化した細胞を5分間試用する。
    4. 収穫したB16/F10-OVA細胞を冷たいPBS(0.5%FBSおよび0.05%のアジドナトリウムを含む)で、生存性染色剤および関連する標識抗体(固定可能な生存率染色剤e780、AF647-共役マウスCD8およびBV421-conjugatedマウス)でインキュベートすることによって染色する).
    5. フローサイトメトリーによりB16/F10-OVA細胞の3群の生存率を解析する。

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結果

ここでは、25nMでフラボピリドールを使用した慢性サブ致死(図2)治療により得られたTE確実細胞モデルを確立するための詳細なスキーム(図1)を提供する。図3では、フラボピリドールによる3日間の治療において、B16 OVA細胞はTEの部分特性を明らかにしたが、治療の1週間後、B16/F10 OVA細胞はRNA Pol IIのCTD上のセリン2位置におけるリン酸化の重大な損失を示す。H3K36me3の有意な減少を伴う-エキソン境界の定義に関与するヒストン修飾と逃げ出す不可解な転写の阻害剤。その結果、TEは間違いなく細胞モデルが不適切にキャップされ、非ポリアデニル化mRNAの比が明らかに増加した重要なmRNA処理欠陥を示す(図4A、B)。また、...

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ディスカッション

RNA Pol II伸長制御は、悪性細胞5、7、8の利益に対する刺激応答性遺伝子発現を調節するための決定的なレバーとして出現した。伸びに対するプロモーター近位休止を克服し、その後のmRNA産生は、P-TEFb9、10、11のキナーゼ活性を必要とする。我々のモデルは、本質的なサイクリン依存性キナーゼCDK9の阻害剤であるフラボピリドール(25 nM)を利用して、TEのPol II伸長中に観察された欠陥を模倣する間違いなく癌(我々のグループによって発見された癌の未知の表現型)を模倣する。以前の3.

CDK9キナーゼ活性は、長い間、Pol IIの大サ...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

この作品は、NCI(CA193549)とCCHMCリサーチイノベーションパイロット賞のカカジャン・コムロフ賞、国防総省(BC150484)がナヴニー・シンに授与されました。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立がん研究所または国防総省の公式見解を表すものではありません。資金提供者は、研究の設計、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に何の役割も持ちはありませんでした。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
hhis6FasLCell Signaling5452
10X TBSBio-Rad170-6435
12 well platesFalcon353043
20% methanolFisher ChemicalA412-4
24-well platesFalcon351147
4–18% SDS ポリアクリルアミドゲルBio-Rad4561086
4% パラホルムアルデヒドサーモフィッシャーサイエンティフィックAAJ19943K2
5% 粉ミルクBio-Rad170-6404
7-メチルグアノシン抗体BioVision6655-30T
96 ウェルプレートCellstar655180
AF647-標識マウス CD8Biolegend
100727 抗生物質および抗真菌薬Gibco15240-062
抗 His 抗体細胞シグナル伝達2366 P
抗ラビット細胞シグナル伝達7074希釈 1:5000
抗ラット細胞シグナル伝達7077S希釈 1:5000
ブラッドフォードアッセイキットバイオ・ラッド5000121
BSAACROS Organics24040-0100
BV421標識マウス CD45バイオレジェンド109831
クリスタルバイオレットシグマC3886-100G
DMEMギブコ11965-092
ダイナビーズ オリゴ (dT)25アンビオン61002
FBSギブコ45015
固定可能なライブ/デッド染色色素 e780eBioscience65-0865-14
フラボピリドールセレッケムS1230
H3K36ME3アブカムab9050希釈 1:2000
IFN-αR&Dシステム12100-1
IFN-&ガンマ;R&D systems485-MI-100
IMDMGibco12440053
Immobilon Western Chemiluminescent HRP SubstrateMilliporeWBKLS0500
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation KitBiolegend480007
NF-κB細胞シグナル伝達8242s希釈 1:1000
PBSGibco14190-144
p-NF-κB細胞シグナル伝達3033s希釈率 1:1000
p-Ser2-RNAPII活性モチーフ61083希釈率 1:500
p-Ser5-RNAPII活性モチーフ61085希釈率 1:1000
p-STAT1細胞シグナル伝達7649s希釈率 1:1000
RiboMinu 真核生物キットAmbionA10837-08
RIPA バッファーSanta Cruzバイオテクノロジーsc-24948
RNAPIIアクティブ モチーフ61667希釈 1:1000
STAT1細胞シグナル伝達9175s希釈 1:1000
TNF-αR&D systems410-MT-010
total H3Cell Signaling4499Dilution 1:2000
Tri reagentSigmaT9424
TritonSigmaT8787-50ML
Tween 20AA Hoefer9005-64-5
β-ActinCell Signaling12620SDilution 1:5000
β-MEGバイオサイエンスBC98

参考文献

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