Method Article

手動多重蛍光免疫組織化学における最適化、設計、および落とし穴の回避

DOI:

10.3791/59915

⸱

July 26th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, University of Michigan, 3Department of Pathology, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多重蛍光免疫組織化学は、無傷のホルマリン固定、パラフィン埋め込み(FFPE)組織内の複数の細胞タイプの可視化を可能にする新しい技術です。抗体と試薬を最適化し、スライドを準備し、一般的な問題を回避するためのヒントを準備するための指示を持つ7色多重を成功させるためのガイドラインを提示します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞浸潤および空間組織の分析のための無傷の組織の微小環境評価は、疾患プロセスの複雑さを理解する上で不可欠である。過去に使用された原理技術には、免疫組織化学(IHC)と免疫蛍光(IF)が含まれており、1~4マーカーを用いて時間内に細胞をスナップショットとして可視化することができます。いずれの技術も、抗原性の低い標的を染色するのが難しい、種間反応性に関する制限を含む欠点を有する。IHCは信頼性が高く再現可能ですが、可視光スペクトルに対する化学の性質と依存性により、少数のマーカーしか使用できず、共ローカリゼーションが困難になります。IFの使用は潜在的なマーカーを広げるが、通常、ホルマリン固定後の広範な組織自己蛍光による凍結組織に依存する。フローサイトメトリーは、複数のエピトープの同時標識を可能にする技術であり、IFおよびIHCの欠陥の多くを損なうが、単一細胞懸濁液として細胞を調べる必要性は、重要な生物学的生物学的を廃棄する細胞の空間的文脈を失う関係。多重蛍光免疫組織化学(mfIHC)は、これらの技術を橋渡しし、全体的な微小環境アーキテクチャと空間を維持しながら、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織におけるマルチエピトープ細胞表現を可能にします。無傷の組織内の細胞の関係。組織エピトープに共有結合する高蛍光強度蛍光蛍光ホルは、二次抗体による種特異的交差反応性を心配することなく、一次抗体の複数の応用を可能にする。この技術は、疾患の研究のための信頼性と正確な画像を生成することが証明されていますが、有用なmfIHC染色戦略を作成するプロセスは、広範な最適化と設計のために時間がかかり、厳密なことができます。現場で正確な細胞相互作用を表す堅牢な画像を作成し、手動分析の最適化期間を緩和するために、スライド準備、抗体の最適化、多重設計、エラーを示します。染色プロセス中に一般的に遭遇します。

Introduction

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無傷の腫瘍微小環境(TME)の可視化は、固体悪性腫瘍における細胞浸潤だけでなく、細胞間相互作用も評価する上で不可欠である。多重蛍光免疫組織化学(mfIHC)は、癌および関連疾患1、2、3、4、および癌の研究における細胞の多抗原表現型の有効なツールとして出現した。 5,6,7.これは、大きなデータセットを分析するように設計された新しいソフトウェアおよびプログラムと組み合わせることで、セル1、2、4間の複雑な相互作用の観察を可能にする。データ取得におけるレート制限係数は、多くの場合、分析前の染色組織の品質です。

TMEで細胞を表現するために使用される以前の技術には、免疫組織化学(IHC)、免疫蛍光(IF)およびフローサイトメトリーが含ま....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての作業は、ミシガン大学の内部審査委員会によって承認されています。

1. 一次抗体とスライド製剤の最適化

  1. 従来のIHCを用いて多重化に対する抗体の理想的な濃度を決定する。
    1. 手動従来の免疫組織化学(IHC)13により多重化の抗体を試験する。
    2. CD3抗体検査に扁桃組織を使用するなど、検査された抗体ごとに豊富な細胞型を持つ特定の組織を使用します。
    3. 同社が推奨するIHCの基準濃度を使用し、推奨濃度の抗体濃度と推奨濃度の上下濃度でIHCを完了します。
  2. ホルマリン固定パラフィン埋め込み組織をスライド上に準備します。
    1. マイクロトームを使用して、4と6 μmの間の厚さでFFPE組織のブロックを切断し、充電されたスライドに適用します。
      注:蒸留水を使用すると、多重を通じて適切な組織の取り付けと付着が保証されます。
    2. スライドを平らにし、ティッシュ側を上に置き、一晩37°Cで乾燥させます。
    3. 多重化を完了する準備ができるまで、極端な温度から離れたスライド ボックスにスライドを格納します。

2. 一般的な染色方法

  1. 洗浄および抗原検索溶液の調製
    1. 脱イオン水の....

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Results

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7色多重アッセイを得る全体的なプロセスは、反復パターンに従う。図 1は、プロセスを図式形式で記述します。スライドを切断して乾燥させたり、実験室から受け取り、60°Cのハイブリダイゼーションオーブンで1時間焼き上げたら、デパラフィン化と水分補給に進み、再びホルマリンでスライドを固定し、抗原の検索を行います。多重化の各ラウンドは抗原検索から始まり、抗体除去で終了します(図1)。

プロセスの各ステップの最適化は、明確で使いやすいイメージを実現するために最も重要です。抗体は、各抗体に対してpH6およびpH9を有する抗原検索バッファーを使用して、その特定の抗体に最も適した抗原検索バッファーを視覚化するために、まずIHCによって試験されるべきである。一般に、核標的はバッファーpH9で抗原検索に応答する。例えば、FOXP3は、pH9の抗原検索バッファーを使用する場合に最適であり、pH6の抗原検索バッファーに最適なCD3とは対照的に使用されます。IHC プロセスから取得したイメー.......

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Discussion

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固形腫瘍生検および外科的切除からの無傷の組織標本は、疾患分析および患者の予後のための重要な診断および予測ツールのままである。多重蛍光免疫組織化学(mfIHC)は、免疫組織化学(IHC)、免疫蛍光(IF)およびフローサイトメトリーの利点を組み合わせた新しい技術です。その場で細胞をプローブする以前の方法は、組織環境8における細胞間配置の評価を可能にしたが、しかし、プローブできるエピトープの数が少ないため、複雑な分析が制限される。フローサイトメトリーは、検体中の多くの細胞型を分析するのに有用であるが、単一細胞懸濁液9、10としてサンプルを準備することにより空間的文脈を失う。mfIHCは、細胞微小環境の空間コンテキストを保持し、標識されたエピトープ11当たりの信号を増幅しながら標識することができるエピトープの数を増やすことによって、これらの技術を橋渡しする。これまでの研究では、がんおよび非癌組織標本1、2、3、4、5、15における細胞.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者たちは、以前パーキン・エルマーから来たエド・スタックに、オリジナルの多重染色のセットアップと最適化に関する彼の支援に感謝したいと思います。著者らはまた、分析ソフトウェアを使用してヒントをアコヤバイオサイエンスからクリステンシュミットに感謝したいと思います。この出版物で報告された研究は、賞番号P30CA046592の下で国立がん研究所によってサポートされました, K08CA201581(1lf)、K08CA234222(js)、R01CA15158807(mpm)、RSG1417301CSM(mpm)、R01CA19807403(mpm)、U01CA22414501(午後)、hcCA170568 (hc)。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。ジェフリー・A・コルビー・コロン癌とトム・リウ記念研究基金による追加支援が行われました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100% エタノールフィッシャーHC8001GAL
70% エタノールフィッシャーHC10001GL
95% エタノールフィッシャーHC11001GL
解析ソフトアコヤ バイオサイエンスCLS135783inForm version 2.3.0
退色防止封入剤サーモフィッシャーP36961プロロング ダイヤモンド
ブロッキング ソリューションベクターSP-6000クソール
ウシ血清アルブミン(BSA)シグマライフサイエンスA9647-100G
カバースリップフィッシャー12-548-5E
繊細なタスクワイプキンバリークラーク34120
蛍光希釈剤アコヤバイオサイエンスARD1A01EAオパールTSA希釈剤
Fluorophore520コヤバイオサイエンスFP1487001KT1:100
蛍光色素 540アコヤバイオサイエンスFP1494001KT1:100
蛍光色素 570アコヤバイオサイエンスFP1488001KT1:100
蛍光色素 620アコヤバイオサイエンスFP1495001KT1:100
蛍光色素 650アコヤバイオサイエンスFP1496001KT1:100
蛍光色素 690アコヤバイオサイエンスFP1497001KT1:100
フルオロフォア DAPIアコヤバイオサイエンスFP1490TBSTまたはPBSに3滴
耐熱ボックスTissue-Tek25608-904プラスチックスライドボックス-グリーン
加湿チャンバーイビサイエンティフィックAT-12
ハイブリダイゼーションオーブンフィッシャーバイオテック
疎水性バリアペンベクターH-4000ImmEdge
顕微鏡パーキン・エルマーCLS140089マントラ定量的病理ワークステーション
マイクロ波パナソニックNN-A661Sインバーター技術
中性緩衝ホルマリンフィッシャーサイエンティフィックSF100-410% 中性緩衝ホルマリン
pH 6 抗原賦活化緩衝液アコヤバイオサイエンスAR600AR6
pH 9 抗原賦活化緩衝液アコヤバイオサイエンスAR900AR9
リン酸緩衝生理食塩水フィッシャーBP3994PBS
プラスチックスライドボックスティッシュテック25608-906
ラップフィッシャーNC9070936
ポリソルベート 20フィッシャーBP337-800トゥイーン 20
プライマリ抗体 CD163LeciaNCL-LCD1631:400
一次抗体 CD3DakoA04521:400
一次抗体 CD8Spring BioM53901:400
一次抗体 FOXP3DakoM35151:400
一次抗体 pancytokeratinCell Signaling126531:500
一次抗体 PD-L1細胞Signaling136841:200
二次抗体Akoya BiosciencesARH1001EAOpal polymer
スライド染色セットElectron Microscopy Sciences6254001
Tris buffered salineCorning46-012-CMTBS
Vertical slide rackElectron Microscopy Sciences50-294-72
XyleneFisher
ブロアX3P1GAL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
  2. Barua, S., et al. A Funct....

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