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方法論記事

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞の養子免疫療法用

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DOI：

10.3791/59949

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2019年12月17日

 , 
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

この記事について

サマリー

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞を確実に生成し、その分化と機能をインビトロとインビボでテストするアプローチについて説明します。

要約

養子免疫療法は、癌および感染症の治療のための約束を保持します。キメラ抗原受容体(CAR)で原発性ヒトT細胞を転行し、子孫ex生体内を拡張する簡単なアプローチについて説明します。CAR発現を測定するアッセイと、分化、増殖能力、細胞溶解活性を測定します。CAR T細胞におけるエフェクターサイトカイン産生および炎症性サイトカイン分泌を測定するアッセイについて説明する。当社のアプローチは、養子免疫療法の前臨床モデルのためのCAR T細胞を培養するための信頼性の高い包括的な方法を提供します。

概要

キメラ抗原受容体(CAL)は、T細胞を異なる腫瘍抗原に対してリダイレクトする有望なアプローチを提供する。CARは抗原標的に結合する合成受容体である。正確な構成は可変ですが、CAL には通常 3 つの異なるドメインが含まれています。細胞外ドメインは、標的抗原への結合を指示し、典型的には、細胞外ヒンジを介してCARに連結された単一鎖抗体断片から構成される。第2のドメインは、一般的にT細胞受容体(TCR)複合体のCD3度鎖に由来し、CAR関与に続いてT細胞活性化を促進する。第3の共刺激ドメインは、T細胞機能、生着、代謝、および持続性を増強するために含まれる。B細胞急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)および多発性骨髄腫を含む種々の造血悪性腫瘍におけるCAR T細胞療法の成功は、このアプローチの治療上の約束を強調する1、2、3、4、5、6である。最近の食品医薬品局(FDA)の2つのCD19特異的CAR T細胞療法の承認は、小児および若年成人ALLのためのチザゲンレクリューセルおよびびまん性大細胞リンパ腫のためのアクシキャブタジーンシロロイセルであり、CAR T細胞療法の翻訳上のメリットを強化する。

CAR Tベースのアプローチは、末梢血からのT細胞の単離、活性化、遺伝子組換え、および拡張ex生体内を含む。分化はCAR T細胞の有効性を調節する重要なパラメータである。したがって、ex vivo培養中にT細胞分化を制限することは、注入された生成物が生着、拡大、および持続する能力を高め、養子移送2、7、8、9に続く長期免疫サーベイランスを提供する。T細胞は、ナイーブT細胞(Tn)、中央メモリ(Tcm)、エフェクターメモリ(Tem)、エフェクター分化(Tte)および幹細胞メモリ(Tscm)を含むいくつかの異なるサブセットで構成されています。エフェクター分化T細胞は強力な細胞溶解能を有する;しかし、彼らは短命であり、貧しい10、11、12を生み出します。対照的に、ナイーブT細胞およびTcmを含むあまり分化していない表現型を有するT細胞は、養子細胞移動13、14、15、16、18に続く優れた生着および増殖能力を示す。前製造された製品で収集されたT細胞の組成は、患者間で変化し得るし、CAR T細胞の治療可能性と相関する。開始アフェレシス産物におけるナイーブ様免疫フェノータイプを有するT細胞の割合は、生着および臨床応答19の両方と非常に相関している。

培養持続時間は、養子転法のために調製されたCAR T細胞における分化に影響を及ぼす重要なパラメータである。我々は最近、略培養パラダイム20を用いて優れた品質のCAR T細胞を生成するアプローチを開発した。我々のアプローチを用いて、限られた培養が優れたエフェクター機能を有するCAR T細胞を生じ、白血病の異種移植片モデルにおける養子移入に続く持続性を生み出すことを示した。ここでは、CART19細胞(CD3級および4-1BBシグナル伝達ドメインに付着した抗CD19 scFvを発現するように設計された自己T細胞)を確実に生成するアプローチを提示し、採用転写前のCAR Tの生理活性および有効性に関する洞察を提供するアッセイの詳細な説明を含む。

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プロトコル

すべての動物研究は、ペンシルベニア大学の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されています.

1. T細胞の活性化、伝達、拡張

  1. 6ウェル細胞培養皿のT細胞あたり3ビーズの割合で抗CD3/CD28磁気ビーズ(例えば、ダイナビーズ)と混合することにより、新鮮または凍結保存された一次ヒトT細胞を活性化します。X-VIVO 15培地中の培養T細胞は、5%正常ヒトAB血清、2mM L-グルタミン、20mM HEPES、およびIL2(100単位/mL)を添加した。膨張時にT細胞を106T細胞/mLの濃度で維持します。培養T細胞を37°C、20%O2、および95%湿度5%CO2で
  2. 一晩刺激した後、活性化されたT細胞にレンチウイルス上清を加える。3−5の感染の多重度(MOI)を達成するために必要な上清の体積を計算します。
    注:CD19-BB級CARレンチウイルスプラスミドは、CD8ヒンジ、4-1BB共刺激ドメイン、およびCD3級シグナルドメイン21からなる。CD19-BB級レンチウイルス上清は、先に説明したように生成された21.
  3. 3日目に、凍結保存のための細胞の代表的なアリコートを収集する。凍結保存の前に、穏やかなピペットと磁気分離によって磁気ビーズを除去してください。リン酸緩衝生理食塩酸(PBS)を0.5%ジメチルスルホキシド(DMSO)で含有する凍結培地を調製し、使用するまで4°Cで保存します。
    1. T細胞を300 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、5mLのPBSを加えます。細胞を300xgで5分間遠心分離し、PBSを廃棄する。
    2. 冷間凍結保存培地の1mLで細胞ペレットを再サスペンドする。T細胞を冷やした凍結容器に入れ、-80°Cで48時間保存し、凍結した細胞を液体窒素に移します。
  4. 残りのT細胞をPBSの5mLで1回洗浄し、残留ベクターを除去する。300 x gで5分間遠心分離し、PBSをデカントし、0.5 x 106細胞/mLの濃度でT細胞培養培地中の細胞ペレットを再サスペンドする。
  5. T細胞を2つの培養物に分割し、5日目と9日目に指定します。ヒトCD4およびCD8に対するカウントビーズ(材料表)およびモノクローナル抗体、ならびに生存率色素(材料表)を用いたフローサイトメトリーによるT細胞のカウント
    1. T細胞濃度を測定するには、500μLのPBS、5μLの計数ビーズ、7-アミノ-アクチノマイシンD細胞生存率溶液の10μL、CD4-FITCの4μLおよびCD8-APCの4μLを含むマスターミックスを調製する。40 μLのT細胞をマスターミックスに加え、生きたT細胞/ビーズ数に基づいてフローサイトメトリーによって細胞濃度を測定します。1日おきに0.5 x 106細胞/mLの濃度で培養物を維持するために再フィードします。
  6. 5日目に、ステップ1.3と1.5で説明されているように、5日目の文化をカウントし、凍結保存します。
  7. 7日目に、PBSで0.5 x 106 T細胞を洗浄し、蛍光活性化細胞選別(FACS)緩衝液の100μLで再サスペンドします。フローサイトメトリーにより蛍光共役抗CAR19特異種で免疫染色することによりCAR表面タンパク質発現を検出します。
  8. 9日目に、ステップ1.3で説明したように9日目の文化と凍結保存をカウントします。

2. T細胞分化のフェノールト評価

  1. 抗CD3-BV605(クローンOKT3)、抗CD14-パシフィックブルー(PB)(クローンHCD14)、抗CD19-PB(クローンHIB19)、抗CD4-BV510(クローンOKT4)、抗CD8-H7APC(クローン1)、抗Cアンチ CD45RO-PE (クローン UCHL1)、アンチ CD27-PE-Cy7 (クローン 1A4CD27)、抗 CD95-PerCP-Cy5.5 (クローン DX2)、および抗 CAR19-APC。
  2. 抗CD45RO-PE、抗CCR7-FITC、抗CD27-PE-Cy7および抗CD95-PerCP-Cy5.5のための個々の蛍光マイナス1(FMO)コントロールを準備し、肯定的に染色された細胞を背景から区別します。
  3. PBSで生体/死株試薬(材料表)1:10,000を希釈することにより、死細胞染色溶液を調製します。
  4. 以前凍結保存されていた3日目、5日目、および9日目のT細胞を解凍します。各群の遠心分離 1 x 106 T 細胞を 300 x gで 3 分間廃棄します。PBSで細胞を1回洗浄します。3分間300xgで遠心分離し、PBSを廃棄する。
  5. T細胞を室温(RT)で15分間死んだ染色液と混合し、光から保護する。
  6. 1 mL の FACS バッファーを追加して、死んだ細胞染色色をクエンチします。300xgで3分間遠心分離し、上清を廃棄し、ステップ2.1および2.2に記載の抗体カクテルを含むFACS緩衝液の100μLで細胞ペレットを再中断する。4 °Cで1時間インキュベートします。
  7. FACSバッファーと遠心分離機を300 x gで1mL加えて3分間、非結合抗体を洗い流します。FACS バッファを使用して 3 回繰り返します。
  8. 細胞を1%パラホルムアルデヒド(PFA)で再サスペンドし、4°Cで保存します。
  9. 固定後のCD45RO発現が減少するにつれて、免疫染色後のフローサイトメトリーにより試料を分析する。差別化を評価するには、シングルト (FSC-H 対 FSC-A)、ライブ CD3+ T セル (ダンプ [ライブ デッド バイオレット、CD14-PB および CD19-PB vs CD3-BV605]、CD4-BV510 vs CD8-APC-H7)の順にゲートします。CD4+ およびCD8+サブセットでは、CD45RO-PE と CCR7-FITC のゲートを使用して、ナイーブ状の T 細胞 (CD45RO-CCR7+)、Tcm (CD45RO + CCR7+)、テム (CD45RO+CCR7 - )、および Tte (CD45RO-CCR7-)を定義します。Tscmを同定するために、ナイーブ状T細胞集団におけるCD27+T細胞のゲート。このコンパートメントでは、TscmはCD95+であり、TnはCD95である -.

3. 体外機能解析

  1. CAR T細胞増殖とサイトカイン分泌
    1. フローサイトメトリーによって、ステップ 1.5 および 1.7 で説明されているように、CAR 発現とセルの生存率を確認します。
    2. 各グループ(3日目、5日目、9日目)から5 x 106T細胞をPBSで洗浄し、カルボキシフルオレセチンジアセテートコハシニジルエステル(CFSE)の1μM溶液でRTで3.5分間再サスペンドします。
    3. すぐに反応をクエンチするために10%ウシ血清(FBS)を含むPBSの10 mLを追加します。
    4. 溶液を300 x gで3分間遠心分離します。コールターカウンター(材料表)を使用してCFSE染色の終了時に細胞をカウントします。
    5. CFSE染色細胞(無刺激)を収穫し、1%PFAで再サスペンドし、フローサイトメトリーによる分析のために4°Cで保存する。
    6. 照射されたK562-CD19(標的)とK562野生型(対照)細胞の所望の数をサイトカイン遊離培養培地及び工程1.1に記載の培養条件で1:1の割合でインキュベートする。
    7. 24時間後、培養容器を300xgで5分間遠心分離し、細胞上清を120μL集める。製造業者の勧告に従ってLuminex分析によってIL2、IFNγ、TNFα、GM-CSF、および他の炎症性サイトカイン(IL1β、IL4、IL5、IL6、IL8、およびIL10)の活性化依存的産生を評価する。
    8. ステップ3.1.7で収集した上清の体積を、新鮮な媒体の同等の体積(120°L)に置き換えます。
    9. 3日目(すなわち、96時間後)に、ステップ1.5で前述したようにビーズベースのフローサイトメトリーを使用して、0.5 x 106細胞/mLの濃度でカウントし、再供給します。
    10. 5 日目に、ライブ CD3+セルをカウントし、0 日目の生きた T セル数に対する生きた T セルの折り変えを計算します。
    11. FlowJoソフトウェアを使用してCAR T細胞を分割する際にCFSE希釈の包括的な分析を実行し、細胞分裂の連続ラウンドを強調します。
      注:増殖アッセイはFlowJoマニュアルでよく説明されています。
  2. 細胞傷害性アッセイ
    注:CD19を発現する標的細胞を死滅させるCART19細胞の能力は、51Cr放出アッセイを用いて評価される。
    1. 5 x 105 K562-CD19、K562-野生型対照細胞、または NALM6 白血病細胞を Na251CrO4の 50 μL と 0.5 mL の RPMI を 37 °C のインキュベーターで 90 分間 10% FBS で補充して、標的細胞に標識します。
    2. 300 x gの遠心分離細胞を 2.5 分間廃棄し、放射性上清を適切な処分ビンに捨て、標的細胞を 5 mL の PBS で洗浄します。洗浄手順を 2 回繰り返します。
    3. 5%FBSを含むフェノール赤フリー培地で標的細胞を再サスペンドします。背景を減らすには、このメディアを残りの手順に使用します。
    4. フローサイトメトリー(セクション5.1で説明)によってCAR発現および細胞生存率を評価した後、CAR T細胞と標識された標的細胞をエフェクタ:ターゲット(E:T)比10:1、3:1、1:1の3倍に混合します。96ウェルU底板に移します。
    5. 並行して、標的細胞単独、および1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を有する標的細胞を含み、それぞれ自発的(S)および最大(M)51Cr放出を決定する。
    6. 300 x gの遠心分離細胞を5分間、5%CO2を用いて37°Cのインキュベーターで4時間または20時間インキュベートする。
    7. 指定時間後、培養容器を300 x gで5分間遠心分離し、35μLの細胞上清を集め、リーダープレートに移す。泡を避けてください。プレートを一晩乾かします。
    8. 標準的なプレートシールでプレートを密封し、液体シンチレーションカウンターでカウントします。上清中のクロムの存在量は、標的細胞殺害のプロキシを提供する。特定のリシスのパーセンテージを次のように計算します: 100 x (1 分あたりのカウント [cpm] 実験リリース – cpm S リリース)/ (cpm M リリース – cpm S リリース)。

4. インビボ機能解析

  1. 適応免疫系がない6-10週齢のNOD-SCID γc–/– (NSG)マウスを取得し、それらをランダムに治療/対照群に割り当てます。
  2. 0.1 mL滅菌PBSで1 x 106 NALM6細胞で尾静脈を介して静脈内に動物を注入する。
  3. 5-7日後、生物発光イメージング(BLI)による腫瘍生着を確認する。イソフルランで麻酔されたマウスにD-ルシフェリンの150mg/kgを注入する(体積は体重に依存する)。
  4. イメージングシステムを使用して生物発光値を測定します。マウスの周りに同一の領域の長方形を描くことによって、対応するソフトウェアを使用して総フラックスを定量化し、頭部から尾の長さの50%に達します。各画像の背景を個別に減算します。
  5. 白血病を確立した後、3 x 106日9 CART19細胞、0.5x 106日3CAR T細胞、または対応する非形調(NTD)ヒトT細胞を100μLの体積で、滅菌PBS/Ca2+の体積で末部静脈を介して注入する。
    注:培養過程で種々の間隔で採取した細胞の生理活性が異なるにつれて、選択した3日目の細胞の濃度は9日目よりも低くなる。
  6. 疾患の進行を決定するには、ステップ4.3で上述したように、生体発光値を週2回測定する。
  7. CAR T細胞の生着を決定するには、EDTAコーティングチューブ内のレトロ軌道出血を介して75μLの血液を採取します。50°Lの血液を絶対計数管に移す。
  8. CD45、CD4、CD8、CARに対する抗体で血液を30分間汚し、1x FACS溶解液の400μLをチューブと渦に十分に加えます。染色後、フローサイトメトリーにより表面マーカー発現を分析する。
    注:他の表面マーカーは、血液中のT細胞の分化および枯渇状態を評価するために使用することができる。
  9. 血液中のサイトカインレベルを測定するために、血液の上層から血清を分離するために4°Cで30分間1,200 x gで血液を遠心分離する。
  10. 血清を収集し、メーカーの指示に従って指定されたリーダープレートでサイトカインを測定します。

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結果

上記の方法を用いて、3日間または9日間T細胞を刺激し、拡張した(図1A,B)。また、図1Cに概説したゲーティング戦略で示されているように、細胞表面に発現する糖タンパク質の存在量を測定して、その分化プロファイルを解析した。ex vivo 培養中の経時のエフェクター分化に向けた進歩的なシフトを示す(図1D)。抗原に応答したCAR T細胞のエフェクター機能と増殖能を評価した。より少なく膨張した細胞(早期に収穫)は、より長い期間にわたって広範囲に培養された細胞に比べて機能的に優れていたことを示している。3日目のCART19細胞は、9日目に対するコグネイトリガンドによる再刺激時の増殖性および細胞溶解能を高めている(図2A,B)。

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ディスカッション

ここでは、ex vivo培養を通じて様々な間隔で採取したCAR T細胞の機能と有効性を測定するアプローチについて説明します。当社の方法は、増殖能力とインビトロでのエフェクター機能を評価するように設計されたアッセイに関する包括的な洞察を提供します。3日目から9日目に採取したCAR T細胞を用いたCARおよび白血病の異種移植片モデルを介したCARおよび詳細異種移植モデルを介してCAR T細胞活性を測定する方法について説明する。

ex vivoの膨張中に異なる時点で採取されたCAR T細胞の有効性を比較することには、固有の課題があります。3日間の培養期間で生成されるT細胞の量が少ないため、機能の包括的な評価を行うには数が不足している可能性があります。これは、外因性および固有因子20のために増殖能がしばしば低下する患者T細胞の文脈で悪化する。

その日3の細胞は、対数増殖期を終了している9日目の対応と比較して、代謝および増殖能力の向上を示すことを考えると、いくつのCAR T細胞を注入する必...

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開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

この作品は、ペンシルベニア大学(マイケル・C・ミローン)やセント・ボールドリック財団奨学生賞(サバ・ガセミ)との研究アライアンスを通じて、ノバルティス・ファーマシューティカルズが提供する資金を通じて一部支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗CD3/CD28ダイナビーズサーモフィッシャー40203D
APCマウス 抗ヒトCD8BD Biosciences555369RRID:AB_398595
APC-H7 マウス抗ヒトCD8抗体BD Biosciences560179RRID:AB_1645481
BD FACS Lysing Solution 10X ConcentrateBD Biosciences349202
BD Trucount Absolute Counting TubesBD Biosciences340334
Brilliant Violet 510 anti-human CD4 AntibodyBioLegend317444RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 AntibodyBioLegend317322RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE Cell Proliferation KitLife TechnolohgiesC34554
CountBright Absolute Counting Beads,InvitrogenC36950
FITC 抗ヒト CD197 (CCR7) 抗体BD Pharmingen561271RRID:AB_10561679
FITC マウス 抗ヒト CD4BD Biosciences555346RRID:AB_395751
HEPESGibco15630-080
ヒト AB 血清Valley BiomedicalHP1022
ヒト IL-2 IS、プレミアムグレードMiltenyi130-097-744
L-グルタミンGibco28030-081
液体シンチレーションカウンター、MicroBeta triluxPerkin Elmer
LIVE/DEAD 固定可能なバイオレット分子プローブL34964
マルチサイザー コールターカウンターベックマンコールター
Na251CrO4パーキンエルマーNEZ030S001MC
パシフィック青色抗ヒトCD14抗体BioLegend325616RRID:AB_830689
Pacific 青色抗ヒトCD19抗体BioLegend302223
PE抗ヒトCD45RO抗体BD Biosciences555493RRID:AB_395884
PE/Cy5 抗ヒト CD95 (Fas) 抗体BioLegend305610RRID:AB_493652
PE/Cy7 抗ヒト CD27 抗体ベックマンコールターA54823
フェノール レッドフリー培地Gibco10373-017
UltraPure SDS Solution, 10%Invitrogen15553027
Via-ProbeBD Biosciences555815
X-VIVO 15Gibco04-418Q
XenoLight D-Luciferin - K+ ソルトパーキン エルマー122799

参考文献

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