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方法論記事

カエモルハブ炎エレガンスにおける細胞構造と器官形態学の研究に関する定量的アプローチ

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DOI:

10.3791/59978

⸱

2019年7月5日

 ,  ,  , 
1Neuroscience Program, Monash Biomedicine Discovery Institute and Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, Melbourne VIC 3800, Australia.

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究では、自由に利用可能な画像処理ツールを用いて、C.エレガンスにおけるシナプスサイズと局在化、筋肉形態、ミトコンドリア形状の定量的測定を概説する。このアプローチにより、C.エレガンスにおける将来の研究は、遺伝的変異の結果としての組織および小器官構造変化の程度を定量的に比較することを可能にする。

要約

疾患の根底にある細胞機構を定義することは、新しい治療法の開発に不可欠です。これらのメカニズムを解明するために頻繁に使用される戦略は、候補遺伝子の突然変異を導入し、組織および細胞小器官の形態の変化を定性的に記述することです。しかし、定性的記述は微妙な表現の違いを捉えず、集団内の個人間の表現型の変動を誤って表現し、しばしば主観的に評価される。ここで、市販のバイオ画像処理ソフトウェアと組み合わせたレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて線虫ケートカエノルハブ炎エレガンスにおける組織および小器官の形態を研究する定量的アプローチについて説明する。シナプスの完全性(サイズと統合蛍光レベル)、筋肉の発達(筋肉細胞サイズとミオシンフィラメントの長さ)、およびミトコンドリア形態(円形およびサイズ)に影響を与えるフェノタイプの定量的分析を行った。これらの細胞構造に対する遺伝子変異の影響。これらの定量的アプローチは、線虫内の他の組織および小器官の形態を容易に定量的に評価するために容易に使用することができるので、ここで説明する用途に限定されない。

概要

線虫カエオルハブ炎エレガンス(C.エレガンス)は、ヒト疾患に関与する生物学的および分子過程を明らかにするモデルシステムとしてますます利用されている。成虫線虫は体長がわずか1mm以上で、最大300個の卵1個の大きな雄鶏を作り出すことができます。孵化後、C.エレガンスは成人に達するために3〜4日しか必要とし、約2〜3週間2週間生きる。培養の容易さのために、C.elegansは現在、ヒト疾患の治療法を同定するために費用対効果の高い、迅速な薬物スクリーニングを行うための生体内動物モデルの中で最も人気のあるモデルの1つである。さらに、その遺伝的保全、よく定義された行動パラダイム、蛍光または光顕微鏡のための透明な体、および遺伝子操作の容易さは、遺伝子変異の細胞および分子の結果の研究を容易に達成可能にする3. C. エレガンスゲノムは、約60-80%のオルソロジーをヒト遺伝子と共有し、それらの遺伝子の約40%が疾患に関連することが知られています。C.エレガンスでモデル化され、研究されているヒト疾患には、神経変性疾患(アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、シャルコット・マリー・トゥース病)、筋肉関連疾患()デュシェンヌ筋ジストロフィー)、および代謝疾患(高血糖)2、4.ほとんどのヒト障害では、疾患誘発性細胞および小器官の局在化および形態的変化が起こり、線虫モデルで容易に評価することができる。

蛍光マーカーは、顕微鏡下での動的可視化のための組織や小器官の標識に広く使用されています。しかし、C.エレガンスでは、遺伝的変異による形態的不規則性を評価する従来の方法は、主に視覚的記述に依存している。定性評価は、より広い範囲の方が意味線の記述(シナプス形態、GFPの束、特定の軸線形状、筋線維の厚さなど)をカバーし、形態学的変化の鳥の目のビューを提供することができますが、それらはあまり適していません。異なるグループ間の小さなバリエーションを比較します。さらに、定性的評価は視覚的、主観的な評価に基づいており、形態学的異常の過度または過少評価につながる可能性があります。最後に、定性的な観測値は個人によっても大きく異なり、データレプリケーションが困難になります。

近年、画像を定量的に分析できる、ユーザーフレンドリーで容易に利用できる計算アルゴリズムが数多く開発されている。しかし、このような画像解析ソフトウェアの利用は、特に体壁の筋肉やミトコンドリアに関連する形態学的研究に対して、C.エレガンスの研究に遅れをとっている。C.エレガンスの基礎構造解析を改善するために、容易に入手可能なオープンソース画像解析ソフトウェアの一部は、筋肉ミトコンドリア、体壁筋およびシナプスに対する遺伝子変異の影響を定量的に比較するために試みられた。形態。これらの実験手順は、これらのプログラム(フィジー、ilastik、CellProfiler、SQUASSH)を使用してシナプスサイズとシナプスタンパク質の局在化、体壁の筋肉面積と繊維長、およびミトコンドリアサイズの変化を評価する方法を詳細に概説します。線虫の遺伝的変異の結果としての循環性。

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プロトコル

1. C.エレガンス株の成長と維持

  1. 種子線虫成長培地(NGM、材料の表を参照)層流キャビネット内の成長が遅い大腸菌株OP50の300 μLを持つ寒天板。
  2. NGM寒天プレートを層流キャビネットに入れたままにしておきます。
    注:層状の流れキャビネットがない場合、プレートはベンチで乾燥したままにすることができますが、それらは汚染を起こしやすいです。
  3. OP50種子NGM寒天プレート2枚に少なくとも20匹の動物を移し、作業ストックを持つ。動物を移植する主な方法は2つあります。
    1. ピッキング:熱殺菌ピックを使用して動物を優しく持ち上げます。この方法は、寒天プレートから個々または複数の動物を選択するのに有効です。ピッキング時に先端に細菌の小さな擦り傷を持つことは、転送に役立ちます。
      注:ピックは、ガラスピペットに埋め込まれた長さ約4cmの小さなプラチナワイヤーで作られており、ワイヤーチップは「槍状」に平らにされています。クロスコンタミネーションを防ぐためにピッキング間のピックを加熱殺菌します。
    2. チャンキング:殺菌されたへらを使用して、1つのプレートから動物を含む寒天の小さな正方形をカットし、新しいプレートに逆さまに転送します。
      注:この方法は、一般的に、多数のワームを転送し、非汚染性寒天をチャンクする複数のラウンドを介してプレートから汚染を除去するために有用です。数秒間へらを燃やし、移動の間に100%エタノールでへらを浸すことによって、クロスコンタミネーションを避けてください。飢えたプレートからの移動は、飢餓や過密状態が細胞および細胞内構造の健康と形態に影響を与える可能性があるとして推奨されません。
  4. 標準的な成長温度(20°C)でワームを維持します。十分に供給されたワームの継続的な供給を確保するために、2~3日ごとに新しいOP50種子プレートにワームを移します。

2. 年齢同期C. エレガンス

  1. 人口が混雑しているが飢えていないまで、3-4 NGMプレート上のワームを維持します。
  2. M9溶液でNGMプレートから虫をそっと洗い流します。卵は大腸菌OP50に付くため、プレート上に残ります。すべての孵化した動物を取り除くために4つの追加の洗浄手順で繰り返します。
  3. ワームが40分間孵化するのを許します。
  4. プレートにM9溶液の1-2 mLを追加し、最近孵化したワームを緩めるために穏やかに旋回します。
  5. 最近生まれたワームでM9溶液を収集し、新鮮なNGMプレートにワームで溶液を転送します。
  6. NGMプレートを空気にさらすことで、M9溶液が蒸発できるようにします。NGMプレートの汚染を避けるために、オープン炎に隣接してこれを行います。
  7. 20°Cで27時間のワームを成長させ、第3幼虫(L3)段階に発達できるようにします。同期した3日間の成虫動物の場合、ワームは幼虫ステージ4で摘み取られ、さらに3日間成長して3日間の成人期に到達する。

3. イメージング用スライドの準備

  1. 電子レンジセーフボトル(100mLの超純水で3-4g)に3~4%のアガローズストックを用意します。
    注:寒天は、同じ濃度でアガロースの代わりに使用することができます。
  2. すべてのアガロースが溶けるまで、電子レンジで慎重にアガロースを溶かし、沸騰しないように注意してください(透明な溶液)。固化を防ぐために、溶液を70°Cに保ちます。
    注:アガローズストックは数回使用することができます。アガロースが固まった場合は、使用前に再加熱してください。
  3. パスツールピペットを使用して、溶かしたアガロースを顕微鏡スライド上に置きます。
    注:これらはパッドの完全性を乱すように寒天の滴に気泡を持つことを避けてください。
  4. すぐに別の顕微鏡スライドでアガロースの液滴を押し下げ、2つのスライドの間のパッドにアガロースを静かに平らにします。
    注: 残った気泡は、この段階で削除する必要があります。そうでない場合は、動物が簡単に気泡に立ち往生することができるので、新しいスライドを作る必要があります。スライドを押すときに横に寒天のオーバーフローを避けてください。
  5. アガロースを1分間乾燥させます。
  6. 2つのスライドを慎重に分離し、アガロースの損傷を避けながら、スライドの1つに固体パッドを残します。
    注:アガロースパッド付きスライドは、常に乾燥させることができるので、実験の直前に新鮮な準備する必要があります。アガロースパッドの厚さが一貫していることを確認します。これは、画像化を妨げる可能性があるため、パッドに気泡や亀裂が存在してはなりません。
  7. アガロースパッドの中心に0.05%のテトラミソール塩酸塩(麻酔薬)の小さな滴(5-10 μL)を追加します。
  8. 熱殺菌ピックを使用して、溶液が乾燥する前に、ストックプレートから麻酔液滴に約10~15匹の動物を素早く移します。OP50細菌の移動が多すぎると、溶液が曇り、イメージングを妨げる可能性があります。
    注:麻酔液がピッキング中に乾燥した場合は、単に動物に0.05%のテトラミゾール塩酸塩の2番目のドロップをピペット。動物は麻酔液の横側に横たわっている傾向がある。
  9. カバースリップをアガローズパッドのすぐ上に置き、そっと下に落とします。これは、気泡の形成を防ぐことができます。これは動物をつぶす可能性があるため、カバースリップに圧力をかけないで下さい。
  10. ひずみ名でスライドにラベルを付けます。

4. シナプス形態の評価

注:MEC-17過剰発現が後部横微小管(PLM)タッチ受容体ニューロンにおけるシナプス完全性に及ぼす影響は、ラインスキャン共焦点顕微鏡を用いてシナプスサイズと局在化を定量化することによって研究された。PLMニューロン(シナプス領域を含む)はuIs115(Pmec-17:tagRFP)トランスジーン(株:TU4065 5)を用いて可視化し、シナプス領域はjsIs37(Pmec-7:snb-1:GFP)で特異的に標識された(株:NM664)6).本研究は、外染色体MEC-17過剰発現株BXN07[cjnEx036][pmec-4:mec-17,Pmyo-2:mCherry;jsIs37;uIs115]7の非トランスジェニックおよびトランスジェニック動物で行われた。この研究で使用される株の完全なリストは表1に含まれています。

  1. タッチ受容体ニューロンシナプスの共焦点イメージング
    1. シナプス領域を画像化するには、488 nmと552 nmの光学ポンプ式半導体ダイオードレーザーに結合されたラインスキャン共焦点顕微鏡を使用し、画像キャプチャソフトウェアを装備しています。
    2. 最も低い倍率を使用してワームを見つけます。
    3. 動物が正常に配置されると、40X倍率に切り替え、浸漬媒体を適用します(本研究では、水浸漬を伴う40X/1.10 HC PL APO CS2マルチ没入型目的を使用しました)。
    4. GFP蛍光色素の488nmレーザー(2%パワー)とtagRFP蛍光素の552nm(1%パワー)でフッ素を励起することにより、シナプス領域を可視化します。
    5. シナプス領域全体をキャプチャするために最適な x フレームと y フレームを決定します。フレームを選択する際には、最適なピクセル サイズを考慮してください。本研究では、56nmの一貫したピクセルサイズを得た。
    6. ハイブリッドフォトディテクタを使用して画像をキャプチャし、蛍光素の過剰暴露を防ぐために利益を設定します(488 nm励起の場合は100%、552nm励起の場合は15%)。
    7. 使用する特定の目的に応じて最適なZステップサイズを使用して、シナプス全体をカバーするためにZスタック画像を収集します。本研究では、0.211nmの最適なZステップサイズを用いて用いられた。
      注:すべての画像が厳しい条件下で撮影され、統合された蛍光定量と比較が可能であることを確認してください。これは、キャプチャされたすべての画像(レーザーと検出器の設定、ピクセルサイズ、スキャン速度、最適なZステップサイズ)で顕微鏡検査パラメータを同一に保つことによって行うことができます。最適な設定は目的に依存し、ナイキスト計算機(https://svi.nl/NyquistCalculator)などのアクセス可能なバイオインフォマティクスプログラムを使用して計算することができます。画像を体系的にラベル付けし、ファイル名に基づいてファイルを整理して処理するバイオインフォマティクスソフトウェアを使用する場合に便利です。
  2. シナプス領域の定量化
    1. シナプス領域を分析するには、画像を TIFF ファイルとしてエクスポートします。ImageJなどのJavaベースの画像処理ソフトウェアを用いることができる(本研究では、ImageJのMRI画像変換マクロを用いていた)。
    2. シナプスのサイズと統合蛍光強度レベルをCellProfiler-3.1.5で得られたZスタックの合計強度から測定した。画像を CellProfiler3.1.5 ソフトウェアにロードします。必要に応じて、イメージ ファイル名に基づいてイメージをフィルター処理できます。
    3. 名前とタイプモジュールを設定します。必要に応じて、イメージ ラベルからメタデータを抽出して、それに応じて計算されたデータを整理します。
    4. uIs115(Pmec-17:tagRFP)トランスジーンから表現される拡散タグRFPを使用して、この領域の手の定義によってシナプス領域を決定します。これを行うには、セルプロファイラ-3.1.5 パイプラインに関連モジュールを追加します。
    5. 手定義シナプスのサイズと蛍光を測定するには、[オブジェクトのサイズと形状を測定] モジュールをパイプラインに追加します。
    6. 数学の計算モジュールを追加して、相対統合蛍光強度を計算します。jsIs37(Pmec-7::snb-1:GFP)から得られた統合強度単位を、uIs115(Pmec-17:tagRFP)用に得られた統合単位で除算します。
    7. 測定値と計算をエクスポートします。

5. 体壁の筋肉構造を定量化する

  1. 体壁筋構造の蛍光イメージング
    1. トランスジーンstEx30(例えばRW1596)を運ぶ株(例えば、RW1596)を得る(Pmyo-3:gfp::myo-3 + rol-6(su1006))8、ミオシン繊維をGFPで標識する。
      注:動物へのトランスジーンの導入は、既にトランスジーンを発現する動物と関心の株を交差させるか、または生殖腺の遠位腕にDNAをマイクロ注入することによって達成することができる。このトランスジーンのrol-6突然変異によって誘発される「転がり」表現型は、筋肉の視覚化を容易にする。体壁の筋肉は、通常、野生動物の視界からは見えないほど背部と腹部の側面に沿って走ります。rol-6(su1006)対立遺伝子は、動物のねじれを誘発し、それによってイメージングのためにいくつかの筋肉細胞を露出させる。
    2. 高分解能帯電結合デバイスカメラ(CCD)と組み合わせた蛍光顕微鏡を用いて動物を画像化し、40X以上の目的、GFPフィルタおよび取得ソフトウェアを用いて画像化する。
    3. 露出時間と照明強度を調整して、過飽和画像を防ぎます。
    4. 少なくとも1つの完全な目に見える斜めの筋肉細胞を含む動物のセクションから筋肉(400X倍率)の画像をキャプチャし、保存します。不完全な単一の筋肉細胞を持つ領域や、ピントが合っていないセクションを避けてください。また、極端な前部および後部領域、および外陰部に隣接する領域からの画像を除外します。
      注:動物が単一の目に見える完全な筋肉細胞を持っていない場合は、カバースリップを静かにスライドさせて、完全な細胞を露出するように動物を回します。
  2. 筋細胞領域の測定
    1. フィジーソフトウェア9で画像を開きます(バージョン2.0.0は、この研究で使用されました)。
    2. ポリゴン選択を使用して、単一の斜めの筋肉セルを慎重にトレースします。トレースを改善するためにアンカー ドットをドラッグして、最後のポリゴンの線を調整します。
    3. ソフトウェアの上部にある [分析] タブに移動し、[測定]をクリックして選択範囲を計算します。面積とその他の測定値を含む別の結果テーブルが表示されます。結果テーブルから領域測定が欠落している場合は、[分析]タブの[測定値を設定]に移動し、エリアボックスがチェックされたことを確認します。同様に、不要な他の測定値のチェックを解除します。
    4. 退化/欠落領域を持つ筋肉セルの場合は、ポリゴン選択ツールを使用して不足している領域をトレースし、[測定]をもう一度クリックします。セル内に複数のギャップがある場合は、各ギャップを個別にトレースします。
    5. 単一の筋肉細胞全体に対するギャップ領域の比率を計算します。比率が高いほど、細胞内の大きなギャップによる筋肉変性の程度が高いことを示します。野生動物に一般的に見られるように、行方不明の領域がない場合、比率はゼロとして計算されます。
      注:コントロールとして、筋肉構造の欠陥についてもスコアを視覚的に、結果を定量的な測定と比較します。これは、ラボで初めてひずみが研究されている場合に特に便利です。表現型スコアリングの場合、フィラメントの完全性に基づいて動物を欠陥または不良ではないと評価します。例えば、明確なフィラメントストレーション、GFPの束、または構造的な故障による筋肉細胞内のギャップの損失を持つ動物は、欠陥としてスコア付けされます。
  3. ミオシン繊維長のセグメンテーションと定量
    1. 必要に応じて、まずファイルを に変換します。フィジーまたは別のソフトウェアパッケージを使用してtif。TIFF ファイルを目的の場所に保存します。
    2. ilastik10を開きます(フリーソフトウェア、バージョン1.3.2はhttps://www.ilastik.org/からダウンロードできます)。
    3. ilastik で[新しいプロジェクトを作成]でピクセル分類を選択します。ソフトウェアは、プロジェクトの保存を求めるプロンプトを表示します。プロジェクトの名前を変更し、目的の場所に保存します。
      注: 新しいプロジェクトを作成する必要があるのは 1 回だけです。後続のセグメンテーションは、同じプロジェクトを使用して実行できます。同じプロジェクト設定を使用するには、上部の[プロジェクト]タブに移動し、[プロジェクトを開く]をクリックしてプロジェクト ファイルにアクセスします。
    4. 左側のパネルには5つのタブ(入力データ、機能選択、トレーニング、予測エクスポート、バッチ処理)が必要です。[入力データ]タブで、[新規追加] をクリックし、別の画像を追加します。ポップアップ ウィンドウを TIFF ファイルを含むフォルダに移動し、開くイメージを選択します。
    5. 下の次のタブ(機能選択)で、[フィーチャの選択]をクリックして、緑色のチェックボックスで示されるすべてのピクセルフィーチャを選択します。このステップのピクセル選択は、次のステップで異なるクラスのピクセルを区別するために使用されます。
      注: ピクセル フィーチャの選択は、画像の解像度によって異なります。したがって、開発者は、処理能力と時間が許す限り、可能な限りすべての機能または多くの機能を選択することをお勧めします。
    6. 次のトレーニングパネルでは、ピクセルに基づいて異なるオブジェクト クラスを分類できます。この場合、2つのクラスは、個々のGFP発現ミオシンフィラメントおよび不要な背景またはぼやけたエッジである。[ラベルの追加]をクリックして、最初のラベルを表示します。分類器の訓練を開始するためにフィラメントの数をスクロールします。
      注: ラベルをダブルクリックすると、名前を変更できます (たとえば、'ラベル 1' をフィラメントに変更する場合など)。色付きのボックスをダブルクリックすると、描画用の色と確率表示を変更できます。ペイントブラシの既定のサイズは 1 ですが、サイズを 61 に増やすことができます。間違ったピクセルが描画されている場合は、消しゴムツールを使用して図面を削除します。キーボード コントロール (-) と (Shift +) を使用して、それぞれ画像を拡大または縮小できます。矢印キーは、イメージの周りを移動するために使用されます。
    7. 2 番目のラベルを追加し、[バックグラウンド]に名前を変更します。フィラメント間の不要な背景やスペースの上にスクロールします。
    8. ライブアップデートをクリックし、ソフトウェアによって分類が正しく行われていることを確認します。より多くのスクロールを追加し、必要に応じてトレーニングを微調整します。
      注: この手順では、マージされたファイバとぼやけたエッジ(ボディラインなど)に注意することが重要です。ここでの予測を可能な限り改善して、測定の精度を高めます。低画質の画像のピクセルは分解しにくいため、予測精度も画像解像度に依存します。また、オプションですが、ライブ更新コントロールの横にある [フィーチャの提案] 機能でフィルター メソッドを実行することをお勧めします。
    9. トレーニング分類器が適切に実行されたら、[エクスポートの予測]パネルに移動します。[確率を使用して画像設定をエクスポート] を選択します。
    10. 次の設定を使用します。切り取りサブ領域xとyにチェックマークを付け、cのチェックを外します。cの開始値と停止値は、それぞれ 0 と 1 にする必要があります。変換のデータ型を符号なしの 8 ビットに変換し、チェックマークを再正規化 [最小、最大] に変換し、デフォルト値を使用します。出力ファイルビデオの形式を PNG に変更し、必要に応じてファイルとディレクトリの名前を変更します。
    11. エクスポート設定ウィンドウを閉じて、セグメント化したばかりの特定のイメージを書き出します。
    12. 保存した PNG イメージをフィジー ソフトウェアで開きます。画像は白黒で表示されます。
    13. 既定の設定を使用して、イメージのしきい値を調整します。
    14. スケルトン化プラグインを適用します(スケルトン化 2D/3D、次にスケルトンを解析します)。分岐の長さを含む、結果の別のテーブルが表示されます。分岐の長さは、ファイバの長さを表します。結果の他のデータも、ユークリッド距離など便利です。
      注: これらのサイズは生理的に不可能なため、長さが 0 μm 以上 250 μm を超える繊維を省略します。

6. ミトコンドリア形態の定量化

注:ミトコンドリア形態の定量化のために、本研究では、uIs115(Pmec-17:tagRFP)5トランスジーンを含むBXN0387株を用いて、PLMニューロンとjsIs609(Pmec-4:MLS:GFP)11を可視化した。特にPLMニューロン内のミトコンドリアを可視化する。この研究は、同期した3日齢の成人ワームで行われたが、他の年齢で、ならびに他の組織7で正常に行われている。

  1. PLMニューロン内のミトコンドリアの蛍光イメージング
    1. PLMニューロン内のミトコンドリアのサイズと形状の変化を測定するには、蛍光トランスジーンを使用してバックグラウンドニューロンとミトコンドリアの両方を可視化します。
    2. PLMニューロンを画像化するには、488 nmと552 nmの光学的にポンプでくみ上げた半導体ダイオードレーザーに結合された共焦点顕微鏡を使用し、画像キャプチャソフトウェアを装備しています。
    3. 上記の手順 4.1.1-4.1.4 に従ってワームをイメージし、飽和性のない露出条件を確保します。
    4. ニューロン全体を可視化するためには、タイル画像が必要な場合があります。これを達成するには、タイルスキャンオプションを持つソフトウェアを使用して、ニューロンの一方のコーナーでマーカーを見つけてドロップし、反対側の端を見つけてもう一方のマーカーをドロップします。ソフトウェアは、必要な領域をキャプチャするために必要なタイルの最適な数を計算します。
      注: スキャン時間を短縮するために、多くの場合、1 つの平面に続くニューロンを見つけやすく、タイルの数が少なくなります。
    5. タイル スキャンを Z スタックと組み合わせて行うには、タイル スキャンを開始する前に下限と上限を設定し、最適なスライス サイズが設定されていることを確認します。
    6. セグメンテーションは高解像度でより洗練される(ここでは、解像度が3224 x 3224ピクセルを使用した)ので、解像度が最適化されていることを確認します。
      注:uIs115(Pmec-17:tagRFP)トランスジーンはPLMをマークし、カメラの位置を正常に配置するために使用されますが、jsIs609(Pmec-4:MLS::GFP)から観察されたわずかな背景蛍光のために必ずしも画像化する必要はありません。PLM軸ゾン自体内のトランスジーン。これにより、実験から552nmフィルタを取り外すことで、走査および撮像時間を短縮することができる。
  2. SQUASSH を使用したオブジェクト セグメンテーション
    1. 画像ファイルを.tiff画像に変換し、フィジーイメージングソフトウェアを使用してZスタックから最大強度投影を生成します。完全なニューロンを含みながら画像を最小限のサイズにトリミングして、計算負荷を軽減し、バックグラウンドノイズを低減します。
      注:代表的な結果については、長い軸次プロセス内のミトコンドリアのみが考慮されたので、細胞体および任意のミトコンドリアは、各画像から除外された。
    2. ImageJ のモザイク スイート SQUASSH マクロを使用して、最大投影に対して分割ブレッグマン セグメンテーション12を実行します。このマクロのインストールとアプリケーションの詳細なガイドは、モザイクのウェブサイト(http://mosaic.mpi-cbg.de/)で入手でき、Rizkら201413によって説明されています。画像セグメンテーションのプロセスは、以下に短く説明する。
      注:このセグメンテーションは、蛍光強度の閾値を超えるオブジェクト(この場合は個々のミトコンドリア)を識別し、個々のオブジェクトのサイズと形状を正確に測定できるようにします。
    3. ユーザー定義のウィンドウがイメージ上を移動するローリング ボール方式を使用してイメージからバックグラウンド ノイズを除去し、各ウィンドウで最も頻繁に発生する強度からローカルの背景強度の推定値を置きます。これにより、不均一な背景強度が補正されます。
    4. オブジェクト検出を使用して、蛍光強度とピクセル数に基づいて、目的のオブジェクト(ミトコンドリア)を含む画像の領域を大まかに見つけます。このステップを管理するパラメータは、正規化と最小オブジェクト強度です。
      注:正規化は、小さな強度、ノイズ誘発ピークをセグメント化することを避けるために使用され、最小オブジェクト強度閾値は、バックグラウンド組織蛍光から細胞内小器官を定義するのに役立ちます。これらは、ミトコンドリアの最適なセグメンテーションを見つけるために操作される主な2つのパラメータであり、最適化プロセスは、テスト画像の異なるパラメータの試行錯誤を繰り返し、その後に手動検査を行う傾向があります。
    5. ソフトウェアを使用して、各オブジェクトの周囲のローカルな背景強度を推定し、最適なセグメンテーションの計算を支援します。
    6. サイズ、周囲、ピクセル数による長さ、および画像上の信号強度と x/y 位置を測定します。サイズ(nm)で測定値を計算するには、元の画像のピクセルサイズを係数にします。
      注: 各実験について、最適なパラメータを最初に計算する必要があります。セグメンテーションの精度を確保するために、テスト イメージに対して SQUASSH 解析を実行し、セグメンテーションの精度を手動で検査することをお勧めします。マクロは、元のイメージ上で識別された個々のオブジェクトを示す出力ファイルを提供し、これらの密接に検査し、適切にパラメータを調整すると、正確なセグメンテーションが保証されます。定義されたパラメータは、比較可能性のために実験全体に使用する必要があります。代表的な結果に使用されるパラメータは、表 2に含まれています。
    7. フィジーまたはImageJ解析ソフトウェアを開き、モザイクマクロコンテナに移動し、SQUASSHメニューを開きます。
      1. [背景減算]サブメニューを開き、[背景を削除] がオンであることを確認します。ウィンドウ サイズの既定値は 10 です。
      2. 目的の正規化と最小オブジェクト強度、チャネル 1の値を最適な識別およびセグメント オブジェクトに設定します(ステップ 6.2.4 を参照)。チャネル 2の値は、単一のトランスジーンでマークされたオブジェクトには必要ありません。
      3. 客観的特性からの推定PSFをクリックして、顕微鏡の特性に基づいてポイント広がり関数を推定します。これは、隣接するピクセルに対する各ピクセルの影響を考慮して、近くに位置するオブジェクトのセグメンテーションに役立ちます。
        注:サブピクセルセグメンテーションは、コンピュータの処理能力に対する負荷が増大したため、この実験では使用されていませんでした。軸が容易に定義されるので、セルマスクも使用されなかった。これらの設定は、より複雑な組織や細胞単位でオブジェクトを定義する場合に役立ちます。
      4. ビジュアライゼーション オプションの場合は、オブジェクトのアウトラインと[オブジェクトとイメージの保存]の特性がチェックされていることを確認します。グラフィックスおよび統計ソフトウェアで後で使用する場合は、正しい数の条件が入力されていることを確認します。
    8. .tiffイメージを含むフォルダを見つけて、マクロを実行します。このプロセスは、個々のイメージまたはフォルダー内にある遺伝子型ごとの画像のバッチで実行できます。出力ファイルは、元の画像と一緒にフォルダに配置されます。
  3. 形状の解析と測定
    1. SQUASSH からの出力を使用して、上記の測定値を含む行ごとの個々のオブジェクトを提供する項目化されたオブジェクト データ.csvファイルを提供します。
      注: このマクロ プロセスはオブジェクトの測定を自動化しますが、SQUASSH セグメンテーション後に出力イメージを手動でチェックして、マクロがミトコンドリアを正しく識別していることを確認することが常に重要です。
    2. 各ミトコンドリアの形状を分析するには、球状、円体の2次元測定を使用して、完全な円からの物体の偏差を推定します。
      注: 円形は面積と周長 (円形 = (4 x π) x(面積/周長 2) で、1 = 完全な円と 0 = 直線の関数です。これは、グラフィックスおよび統計ソフトウェアの数式を使用して実現できます。
    3. ミトコンドリアのプール全体のサイズと形状の分散を決定するには、ミトコンドリアサイズのビンが0.2 μm、ミトコンドリアの円形が0.05のビンを使用して、ヒストグラムとフィットガウス分布を計算します。

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結果

C.エレガンスは、その単純さ、既知の細胞系統、透明性、および利用可能なツールに起因する異なる組織や器官の形態を研究するための理想的なモデル生物です。ここでは、生きた蛍光イメージングと無料のバイオ画像処理ソフトウェアを用いて、シナプスや筋肉を含む小器官(ミトコンドリアなど)や組織を研究するための定量的アプローチを提供する。

通常のシナプス開発にはMEC-17発現の厳格な規制が必要

神経系におけるα-チューブリンアセチルトランスフェラーゼMEC-1714,15,16の機能をさらに理解するために、タンパク質を過剰発現するC.エレガンスにおけるタッチ受容体ニューロンにおけるシナプス形態学を研究した17.これらの細胞構造は、信号が...

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ディスカッション

形態学的変動は、顕著な差異を手動でカウントするか、または任意の閾値を使用して、野生型表現型と比較して欠陥を決定することにより、しばしば評価されてきた。しかし、最近では、形態学の比較研究に定量的な方法が用いられ、細胞レベルと細胞内レベルの変化を公平に測定・記述することが求められている。フェノタイプ間の微妙でありながら生物学的に関連する違いを特定する能力は、環境因子または遺伝病によって引き起こされる形態の変化を制御する基礎となる分子機構を理解するための強力な手段である。計算能力と顕微鏡イメージング解像度の継続的な増加は、成長の容易さとC.elegans遺伝学の汎用性と相まって、洗練された自由なイメージングソフトウェアの組み合わせのための完璧なプラットフォームを提供しています細かい詳細な共焦点画像を使用します。ここでは、シナプスの大きさとタンパク質の局在化、体壁の筋肉面積と繊維の長さ、および遺伝的背景の範囲におけるミトコンドリア形態を評価し、定量化する方法を実証した。

これらの分析は微妙な形態学的な違いを定量化する能力を実証していますが、限界があります。これらの分析のそ...

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開示事項

著者らは、彼らが競合する利益を持っていないと宣言します。

謝辞

私たちは、貴重な議論と入力のためのノイマンラボのメンバーに感謝します。いくつかの株は、研究インフラプログラム(P40 OD010440)のNIHオフィスによって資金提供されているCGCによって提供されました。著者らは、C.エレガンスに関する豊富な情報に関するWormBaseに感謝し、モナッシュ大学モナッシュマイクロイメージングに関するインストルメンテーション、トレーニング、技術サポートの提供を認めています。この研究は、CMTAA研究助成金(2015年と2018年)、NHMRCプロジェクト助成金1101974および1099690によってB.Nに授与されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
寒天Merck1.01614.1000
AgaroseInvitrogen16500-500
共焦点顕微鏡LeicaTCS SP8倒立プラットフォーム
蛍光顕微鏡Carl Zeiss AGZeiss Axio Imager M2
ガラスカバーガラス #1Thermo scientifiqueMENCS22221GP
Glassカバースリップ #1.5ツァイス474030-9000-000SCHOTT
製 ガラススライドサーモサイエンティフィクMENS41104A/40
ライトLEDショットKL 300 LED
実体顕微鏡オリンパスSZ51
トリプトン (カゼイン由来ペプトン)メルク107213リソジェニーブロス(LB)培地
酵母エキスの成分メルク103753リゾジェニーブロス(LB)培地
塩化ナトリウムメルク106404リソジェニーブロス(LB)培地
ペプトン(肉由来ペプトン)ク107214線虫増殖培地(NGM)寒天
原料Sigma A1296線虫増殖培地(NGM)寒天用原料
塩化ナトリウムメルク106404線虫増殖培地(NGM)用成分 寒天
コレステロールSigmaC8667-25G線虫増殖培地(NGM)用成分
塩化カルシウムメルク102382線虫増殖培地(NGM)寒天用成分
硫酸マグネシウムメルク105886線虫増殖培地(NGM)寒天用成分
リン酸ジカリウムメルク105101線虫増殖培地(NGM)用成分 寒天
二水素カリウムメルク104873線虫増殖培地(NGM)寒天用成分
リン酸二ナトリウムメルク106586M9緩衝液用成分
塩化ナトリウムメルク106404M9緩衝液用成分
リン酸二水素カリウムメルク104873M9 バッファーの成分
硫酸マグネシウムメルク105886M9 バッファーの成分
パスツールピペットコーニングCLS7095D5X-200EA
シャーレコーニングCLS430589-500EA
プラチナワイヤーシグマ267201-2G
スパチュラメットアプリ2616
テトラミソール塩酸塩グマL9756-5G
用原料 メル用リン酸シ

参考文献

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