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方法論記事

免疫標識腎組織の光学クリアリングとイメージング

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DOI:

10.3791/60002

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2019年7月22日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Clinical Immunology, University Hospital RWTH Aachen, 2III. Department of Medicine, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, 3Department of Nephrology, Monash Health, 4Division of Nephrology and Hypertension, Oregon Health and Science University, 5Renal Section, Veterans Affairs Portland Health Care System, 6Fondation LeDucq Transatlantic Networks of Excellence, 7Department of Internal Medicine, Nephrology and Transplantation, Erasmus Medical Center

この記事について

サマリー

抗体標識、光学クリアリング、および高度光顕微鏡検査の組み合わせにより、完全な構造または器官の3次元解析が可能になります。ここでは、厚い腎臓スライスの免疫標識、エチルシナメートによる光学クリアリング、および3次元腎臓構造の可視化と定量を可能にする共焦点イメージングを組み合わせる簡単な方法です。

要約

光学クリアリング技術は、その後の3次元(3-D)イメージングのためにサンプル全体で屈折率を平衡化することにより、組織を透明にします。彼らは、顕微鏡的な距離にわたって広がる顕微鏡多細胞構造を分析する可能性について、すべての研究分野で大きな注目を集めています。腎臓の管、血管、神経、糸球体が多くの方向に広がっていることを考えると、これまで伝統的な2次元技術によって部分的にしか捕捉されていなかったため、組織のクリアリングは腎臓研究の多くの新しい領域を開きました。光学クリアリング方法のリストは急速に成長していますが、この分野の初心者が特定の研究問題に最適な方法を選択することは困難なままです。ここでは、厚いマウス腎臓スライスの抗体標識を組み合わせた簡単な方法です。安価で非毒性ですぐに使用でき、化学エチルシナメートを用いて光学クリアリング。と共焦点イメージング。このプロトコルは、腎臓を浸透させ、特殊な装置を必要とせずに抗体結合を増加させるために抗原検索ステップを使用する方法について説明します。その応用は、腎臓内の異なる多細胞構造をイメージングする際に提示され、組織への不十分な抗体の浸透をトラブルシューティングする方法に対処される。また、内因性蛍風素をイメージングし、非常に大きなサンプルを取得することの潜在的な困難と、それらを克服する方法についても議論する。この簡単な議定書は3次元のティッシュを研究するための容易なセットアップおよび包括的な用具を提供する。

概要

臓器全体や大きな多細胞構造の研究に対する関心の高まりは、透明な組織を3次元でイメージングする光学クリアリング法の開発につながっています。最近まで、全体の構造の細胞数、長さ、または体積を推定する最良の方法は、2次元1の後続の分析のための組織の全身サンプリングに基づく立体または網羅的な連続断面であり、2,3.しかし、これらの方法は時間がかかり、高いレベルのトレーニングと専門知識を必要とします4.光学クリア法は、サンプル全体で屈折率を平衡化して、3-Dイメージング5、6、7の組織を半透明にすることによって、これらの問題を克服する。

いくつかの光学クリア法が開発されており、溶媒ベースと水性ベースの2つのカテゴリーに分類されます。水性ベースの方法は、さらに単純な浸漬8、9、高水和10、11、およびヒドロゲル埋め込み12、13に分けることができる。溶媒ベースの方法は、組織を脱水し、脂質を除去し、屈折率を約1.55の値に正規化する。ほとんどの溶媒ベースの方法の限界は、GFPなどの一般的に使用されるレポータータンパク質の内因性蛍光の消光、溶媒毒性、一部のイメージングチャンバーまたは対物レンズで使用される接着剤を溶解する能力、および組織の収縮脱水14,15,16,17,18,19,20,21.しかし、溶媒ベースの方法は、簡単で時間効率が良く、多くの異なる組織タイプで働くことができます。

水性ベースの方法は、1.38-1.528、11、12、22、23、24の範囲で屈折指数を有する水溶液中の組織の浸漬に依存する.これらの方法は、内因性蛍光レポータータンパク質の放出を維持し、脱水誘発収縮を防ぐために開発されたが、ほとんどの水性ベースのクリアリング方法の限界は、プロトコルのより長い持続時間、組織の拡張、およびタンパク質修飾(すなわち、ScaleA2のような過水化プロトコルにおける尿素によるタンパク質の部分変性)7、11、23、25。ScaleSは、尿素とソルビトールを組み合わせることにより組織膨張に対処し、尿素誘発組織膨張を脱水してバランスをとり、電子顕微鏡10で評価した組織超構造を保存した。組織の収縮または膨張は、構造の絶対サイズ、オブジェクト間の距離、または体積あたりの細胞密度に影響を与えます。したがって、組織の除去時のサイズ変化の測定は、得られた結果7、26を解釈するのに役立ち得る。

一般に、光学クリアリングのためのプロトコルは、前処理、透過性化、免疫標識(必要な場合)、屈折率照合、高度な光顕微鏡によるイメージング(例えば、2光子、共焦点、またはまたは)光シート蛍光顕微鏡)。クリアリングアプローチのほとんどは、神経組織を視覚化するために開発されており、新しい研究は、他の臓器5での応用を検証しています。この包括的なツールは、糸球体27、28、免疫浸潤28、血管系28、および管状セグメントを含む腎臓構造の信頼性と効率的な分析を可能にするために以前に実証されています29、および健康および疾患における糸球体機能および管状リモデリングの理解を深める理想的なアプローチである。

ここで要約すると、腎臓の管状の免疫染色を組み合わせた溶媒ベースの方法です。安価で非毒性で、すぐに使用する化学エチルシナメート(ECi)による光学クリアリング。完全な管の視覚化および定量を可能にする共焦点顕微鏡イメージ投射。この方法は簡単で、市販の抗体の染色と腎臓スライスの抗原検索を組み合わせ、特殊な装置を必要としないため、ほとんどのラボがアクセスできます。

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プロトコル

注:ここに記載されているすべての実験手順は、オレゴン州立保健科学大学、ポートランド、オレゴン州、およびドイツのアヘンの関連地方自治体の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 逆行性腹部大動脈灌流とマウス腎臓の固定

  1. 同じ日または夕方にソリューションを準備し、一晩冷蔵庫に保管してください。使用前に室温(RT)に対する温かい溶液。
  2. 1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)で3%パラホルムアルデヒド(PFA)の新鮮なバッチを作ります。マウス1匹につき約50~100mLのPFAが必要です。
    1. PFAの1Lを作るために:PFAの30グラムの重量を量り、ヒュームフードに蒸留水の800 mLを追加します。50-60 °Cに攪拌し、熱します。70°C以上の加熱を行わな。
      注意: PFA は有毒です。ヒュームフードにPFAを準備します。
    2. ゆっくりと2N NaOHの数滴を追加します。PFA がソリューションに入るか、さらに数滴を追加するまで、数分待ちます。一部の小さなチャンクは溶解しません。
    3. 溶液を熱から取り除きます。20x PBSの50 mLを追加します。RTに氷の上で冷やす。
    4. pHをHClで7.3-7.4に調整し、蒸留水を1Lに加えます。
    5. 0.22 μm フィルターで 1x PBS および 3% PFA を濾過して、未溶解粒子を除去します。
  3. 1x PBSの1Lにヘパリンの1,000単位を追加します。ヘパリンを含む1x PBSと3%のPFAを1x PBSで別々の50 mLプラスチックシリンジに移します。
    注:利用可能な場合は、80-100 mmHgまたは静水圧(ドリップ法、灌流溶液の高さ:動物の上160〜200センチメートル)に設定された圧力制御ポンプは、腎臓灌流に使用することができます。
  4. PBS、PFA、鈍い21Gバタフライ針を3ウェイストップコックに接続します。システム全体に気泡がないことを確認します。
  5. 15 mLの円錐形チューブにラベルを付け、それにPFAの10 mLを分配します。
  6. 120 mg/kg 体重ケタミンと 16 mg/kg 体重キシラジンを使用して年齢の男性または女性 C57BL/6 マウス 12-24 週を深く麻酔.動物は、手術に進む前に反射神経をつまむ(例えば、つま先のピンチ反射)応答性の完全な欠如をチェックする必要があります。
  7. 動物が麻酔の外科面に達したら、解剖顕微鏡の下で背中に置きます。手術はさみを使用して中線腹部切開で腹部を外科的に開き、腹部大動脈を露出させる。
  8. 腹部大動脈を直上に固定し、血栓を曲がった止血で結節する。その後、マイクロセレファインで腎動脈のすぐ下の腹部大動脈をクランプします。バンナスはさみで2つのクランプの間に腹部大動脈に小さな切開(1ミリメートル)を作ります。蝶の針をゆっくりと切開部に挿入し、腹部大動脈を開けないように注意してください。
  9. 5-0シルク縫合糸で右腎動脈をリゲートし、灌流と固定のために1つの腎臓だけが必要な場合は、他の分析のために右の腎臓を取り除きます。
  10. マイクロセレファインを取り外し、ヴァンナスはさみでポータル静脈をトランスエクトし、ヘパリンを含むPBSの50 mLを直ちに浸透させ、その後、3%PFAの50 mLで切り替え、浸透する。
    注:腹部大動脈を通る高い灌流圧は、組織を通じてより良い抗体拡散のために腎管を開くために必要とされる。心臓を通る灌流は腎管を開けないかもしれない。
  11. 注入された腎臓を慎重に収集し、組織を穿刺または圧迫を避ける。
  12. カプセルを取り出し、腎臓を厚さ1mmの冠状動脈スライスに切ります。スライスの厚さを標準化するには、スライサーマトリックス (材料の表)を使用します。
    注:または、ビブラートムの使用を検討してください。
  13. 腎臓のスライスを標識された15 mL円錐形チューブに準備されたPFAで浸します。
  14. PFAの10 mLを別の標識された15 mL円錐形チューブに分配します。次のマウスに移動する前に、PBSで3ウェイストップコックと蝶の針をフラッシュします。
  15. 光から保護されたRTで一晩ポスト固定を行います。

2. 組織調製と免疫染色

  1. 固定後、腎臓スライスをRTの水平ロッカーで1時間1x洗浄バッファー(材料の表)で2回洗います。
  2. 抗原検索を実行します。500mLビーカーで1x抗原アンマスキング溶液(材料のT可能)の300 mLを92-98°Cに加熱します。92-98 °Cで1時間撹拌しながら加熱されたバッファーに透過性のカセットを埋め込んでスライスを囲みます。ビーカーを熱から取り出し、RTに冷ましておきます。
    注:一部のベンダーは、免疫組織化学の適用のために抗体をテストし、データシートに推奨抗原検索方法を含めます。したがって、一部のエピトープは、より基本的なバッファ(例えば、pH9)を必要としてもよい。
  3. スライスを0.1%のトリトンX-100で1x洗浄バッファーの10 mLに移し、RTで一晩ロックします。
  4. 通常の抗体希釈剤の500μLで一次抗体を希釈する(材料の表)。濃度が 1:50-1:100 から始まります。希釈した一次抗体で腎臓スライスを37°Cで4dで静かに揺らします。
    注:各抗体は固有の特性を有するため、抗体のインキュベーションおよび希釈時の温度は、個々のプローブに最適化する必要があります。二次抗体のみのコントロールの場合、一次抗体なしで希釈剤で腎臓組織をインキュベートする。市販の抗体希釈剤の代わりに、0.1%トリトンX-100および0.01%のアジドナトリウムを用いた1x PBSを使用することができる。
  5. 腎臓スライスを10mLの1x洗浄バッファーで一晩RTで洗浄し、8時間後に洗浄バッファーを1回交換します。
  6. 正常抗体希釈剤の500 μLで二次抗体(例えば、Alexa Fluor結合二次抗体の場合は1:100)を希釈する。希釈二次抗体で腎臓スライスを37°Cで4日間インキュベートします。このステップ以降は、腎臓のスライスを光から保護します。
  7. 腎臓のスライスを10mLの1x洗浄バッファーで一晩RTで洗浄し、8時間後に洗浄バッファーを1回交換します。

3. 組織クリアリング

  1. 腎臓スライスを5mLの高品位100%エタノール(材料表)を穏やかな揺れ(1時間後に新鮮なエタノールに1回変更)でRTで2時間転送します。このステップは、組織脱水のためです。
    注:高品位のエタノールは、次のステップで高い組織半透明を達成するために必要とされる。メタノールまたはテトラヒドロフランは、高い線引電性を持つ代替脱水試薬である。
  2. 一晩RTで穏やかな揺れ(2時間後に新鮮なECiに1回の変更で)とECi(材料のテーブル)の2 mLに腎臓スライスを浸します。
    注:ECiの凍結/融点は6-8 °Cです。そのため、サンプルは冷蔵庫に保管しないでください。適切に換気されたヒュームフードに浸漬を行い、衣服や皮膚との直接接触を避けます(ECiは非毒性食品医薬品局承認化合物ですが、臭いが強い)。通常のエッペンドルフチューブまたはガラス容器(ポリスチレン容器なし)を使用してください。
  3. 組織の半透明度はECi浸漬後および腎臓のスライスがイメージ投射の準備ができているとき達成することができる。

4. 共焦点イメージングと画像解析

注:イメージングのために、屈折率一致溶液が対物レンズと互換性がある限り、他の顕微鏡検査技術を使用することができる。このプロトコルは、反転共焦点顕微鏡を使用します。

  1. ガラス底皿(材料の表)にECiの600-1,000 μLを追加します。
    注:ECiはプラスチック製の皿を溶かす有機溶剤であるため、通常の細胞培養皿の使用は避けてください。同様に、ECi は対物レンズのプラスチック部品/絶縁リングを攻撃する可能性があります。互換性のあるイメージング皿30および自作の3Dプリントチャンバ28の概要については、適切なレポートを参照してください。
  2. 半透明の腎臓スライスを皿に移します。腎臓のスライスに丸いカバースリップを置き、ガラス底に光圧をかけます。ECiの漏れを避けるために、パラフィンフィルム(材料のテーブル)で皿を密封します。
    注:全体の器官または数ミリメートルの厚さの組織スライスは、サンプルのためのECiプールを作るために組織の周りの境界(歯科セメントまたはシリコーンエラストマー;材料の表を参照)を必要とするかもしれません。
  3. 皿を顕微鏡イメージングプラットフォームに置きます。
  4. いくつかのZスタックを取り、ステッチを実行します。5 μm の Z ステップ サイズから開始します。
    注:非常に厚いティッシュスライスまたは器官のイメージ投射のための長い作業距離(>5 mm)および高い数値絞り(>0.9)の目的を使用することを検討してください。イメージング後、組織をエタノールに戻し、0.02%のアジドナトリウムで洗浄バッファーまたはPBSに保存します。
  5. ソフトウェア (材料の表)を使用して 3-D レンダリングを使用してイメージを分析します。

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結果

腎臓は、43種類の細胞型31からなる複雑な器官である。これらの細胞のほとんどは、糸球体や細管などの大きな多細胞構造を形成し、その機能は互いの相互作用に大きく依存しています。古典的な2-D組織学的手法は、部分的にこれらの大きな構造をキャプチャし、無傷の構造内の焦点変化を見逃す可能性があります 31.したがって、光学クリアリング技術を用いて3D解析を行い、それらが健康や疾患においてどのように機能するかを理解するのに役立ちます。

ほとんどの溶媒ベースの光学クリアリング技術は、少なくとも部分的に内因性蛍光レポータータンパク質信号を消光する。YFPタグ付きパルブアルブミンのクエンチンは、ECiを用いた脱水および光学クリアリング時に観察された(図1)。しかしながら、他の強い蛍光タンパク質はシグナルクエンチングに抵抗し、およびpHを基本レベル(pH8-11)に調整し、内因性蛍光タンパク質14、20、28、30を安定化してもよい。

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ディスカッション

光学クリアリング技術は、様々な臓器における微小解剖学の3D可視化と定量化に広く注目されています。ここで、溶媒系クリアリング法(ECi)を、腎臓スライス中の管状全体の3Dイメージング用免疫標識と組み合わせた。この方法は、シンプルで安価で迅速です。しかし、他の研究の質問は、他のクリアリングプロトコル5で最もよく答えられるかもしれません.また、溶媒ベースの方法は、主に脱水ステップ14、18に起因して、可変度で組織収縮を引き起こすことに留意することが重要である。ほとんどの溶媒ベースの方法(例えば、ECi14)も、GFPやtdTomatoなどのレポーターの内因性蛍光を少なくとも部分的に消光する。したがって、FDISCO32、CLARITY12、またはCUBIC11は、代替プロト...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

T.S.は、DFGドイツ研究財団(332853055)、エルス・クローナー・フレセニウス・スティフトゥン(2015_A197)、RWTHアーヘン(RWTHリターナープログラム)の医学部からの助成金によって支援されています。V.G.P.は、ドイツのゲッセルシャフトファーネフロロジー、アレクサンダー・フォン・フンボルト財団、オーストラリア国立保健医療研究評議会の研究フェローシップによって支援されています。D. H. E はフォンダシオン・レダックによってサポートされています。R. K. は、DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1,SFB/TRR57,SFB/TRR219)、ノースラインウェストファミリア州(MIWF-NRW)、RWTHアーヘン大学臨床研究学際センター(O3-1)からの助成金によって支えられています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 以上m フィルターフィッシャーサイエンティフィック09-761-112
15 mL コニカルチューブフィッシャーサイエンティフィック339650
21 G バタフライニードルブラウンベノフィックス
3ウェイストップコックフィッシャーサイエンティフィックK420163-4503
3D分析ソフトウェアBitplane AGIMARIS
3D分析ソフトウェアCellprofiler無料のオープンソースソフトウェア
5-0 silk sutureFine Science Tools18020-50
50 mL プラスチックシリンジFisher Scientific14-817-57
抗BrdUモノクローナル抗体Roche11296736001
抗体希釈剤DakoS0809
CD31-647BioLegend102516
クエン酸抗原賦活化液ベクターラボラトリーズH-3300
湾曲止血剤フィッシャーサイエンティフィック13-812-14
ダコウォッシュバッファーアジレントS3006
解剖顕微鏡MoticDSK-500
カセット埋め込みカールロスE478.1
エタノールメルク
桂皮酸エチルSigma-Aldrich112372
フレキシブルフィルム/パラフィルム MSigma-AldrichP7793
ヤギ 抗AQP2サンタクルスバイオテクノロジー sc-9882
モルモット 抗NKCC2該当なし 該当なし DOI: 10.1681/ASN.2012040404
HClカールロスP074.1
ヘパリンSagent Pharmaceuticals401-02
HemostatAgnthos312-471-140
水平ロッカーLabnetS2035-E
イメージングディッシュIbidi81218
KetamineMWI Animal Health501090
Micro serrefineFine Science Tools18052-03
NaOHフィッシャーサイエンティフィックS318-500
手術用はさみメリット97-272
パラホルムアルデヒドモフィッシャーサイエンティフィックO4042-500
ウサギ抗リンショThr53-NCCPhosphoSolutionsp1311-53
エラストマーワールド精密機器Kwik-SILKWIK-SIL
アジ化ナトリウムSigma-AldrichS2002
組織スライサーZivic InstrumentsHSRA001-1
Triton X-100Acros OrganicsAC215682500
Vannas はさみファインサイエンスツール15000-00
VibratomeLancerSeries 1000
XylazineMWI Animal HealthAnaSed Inj SA (Xylazine)
100983サーシリコーン

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