ここでは、表現型および機能解析のための後部根神経節からマクロファージを迅速に分離するための機械的解離プロトコルを提示する。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
末梢神経損傷後の後の後の後の後の後の後の後部根神経節の免疫細胞と感覚ニューロン間の分子と細胞の相互作用を研究する関心が高まっています。マクロファージを含む末梢単球細胞は、有毒症、抗原提示、およびサイトカイン放出を通じて組織損傷に応答することが知られている。新たな証拠は、神経因性疼痛の発症および神経損傷の文脈における軸線修復に対する背中根神経節マクロファージの寄与に関与している。神経損傷の文脈における後部根神経神経マクロファージの反応を迅速に表現(または「急速に単離」)することは、未知の神経免疫因子を同定することが望まれている。ここでは、酵素フリーの機械的解離プロトコルを使用して、マクロファージを後部根神経節から迅速かつ効果的に分離する方法を示します。サンプルは細胞のストレスを制限するために全体を通して氷の上に保たれます。このプロトコルは、標準的な酵素プロトコルに比べてはるかに時間がかからず、蛍光活性化細胞選別分析に日常的に使用されています。
概要
免疫細胞が末梢神経損傷1、2に続く神経因性疼痛に寄与するというかなりの証拠がある。成熟マクロファージを含む末梢単球細胞は、有病動細胞症、抗原提示、およびサイトカイン放出を通じて組織損傷および全身感染に応答することが知られている。脊髄後角における神経損傷誘発ミクログリア活性化と並行して、後部根神経節(DRG)におけるマクロファージも神経損傷3,4後に有意に膨張する。特に、マクロファージがDRG5,6,7の感覚ニューロンと相互作用することにより末梢神経損傷後の神経因性疼痛発症に寄与するかどうかを判断する関心が高まっている。8,9,10歳,11.さらに、最近の研究はまた、神経損傷後の軸線修復におけるDRGマクロファージの寄与を含む
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
すべての動物実験は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の機関動物ケア・使用委員会によって承認され、実験動物のケアと使用に関するNIHガイドに従って実施されました。
1. 実験マウスから腰椎DRGを採取する
- 実験を開始する前に、9巻の培地を1体のCa++/Mg++-free 10x HBSSと混合して密度勾配媒体(例えば、Percoll)の作業溶液を調製する。氷の上に置いておけ
- 2.5%アバーチンでマウスを麻酔する。後ろ足のピンチに対する応答の欠如によって動物が完全に麻酔されたことを確認します。
注:6〜8週齢の雄マウスと雌マウスの両方を用いた。 - 予熱した1x PBSの10 mLでマウスをトランスカルティブに浸透させます。
- マウスを化学ヒュームフードの中にテープで固定した4本の足で、マウスをサフィンの位置に置きます。鉗子によって肋骨ケージの下の皮膚を持ち上げ、肝臓および横隔膜を露出させるために外科はさみで小さい切開をする。
- 横隔膜と肋骨ケージを切るためにはさみを使い続け、胸膜腔を開けて心臓を露出させる。
- アイリスはさみで右心房の付属品を素早く切ります。出血が指摘されたら、左心室の後端に30Gの針を挿入し、ゆっくりと動物を浸透させるために予め冷やされた1x PBSの10 mLを....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
単離細胞を検証するために、まずマクロファージ・ファス誘発性アポトーシス(MAFIA)トランスジェニックマウス17を選択した。この線は、マクロファージとミクログリアの両方で特異的に発現されるCSF1受容体(CSF1R)のプロモーターの制御下で、薬物誘導性FK506結合タンパク質(FKBP)-Fas自殺融合遺伝子および緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現する。FK結合タンパク質ダイネライザーの全身注射、AP20187(AP)は、トランスジーンを発現する細胞のアポトーシスを誘導する。EGFPの発現はまた、DRG内のマクロファージを監視することを可能にする。MAFIAマウスのマクロファージを枯渇させるために、我々はAP(1 mg/kg)の毎日3回の食肉注射で研究を開始した。最後の注射後、DRGはGFPに対する免疫染色のために切除した。我々は、VEH処理マウスと比較してAP処理マウスのDRGにおけるGFP+細胞の有意な損失を記録した(図1A-B)。別の実験では、このプロトコルを使用して.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
ここでは、マウスDRGから分離されたマクロファージを効果的に濃縮する新しい方法を紹介する。DRG免疫細胞を単離する従来のアプローチは、酵素消化15、18を必要とし、これは現在、望ましくない細胞損傷を制限し、収率を増加させるために、我々のプロトコルで機械的均質化に置き換えられています。したがって、新しいプロトコルは、はるかに少ない時間がかかります。さらに重要なことは、酵素消化がマクロファージを刺激し、分子シグネチャを変更する可能性があることです。対照的に、私たちの機械的アプローチは、細胞のストレスを大幅に制限します。
FACS解析を用いて、単離されたDRG細胞におけるマクロファージをさらに特徴付け、大きな細胞回収を実証した。このプロトコルの下で単離されたDRG細胞の80%以上が生存可能であることが判明した(図2D)。1匹のマウスのL4/L5 DRGからは、少なくとも50,000~100,000セルが期待されて.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は、この原稿に関連する競合する金銭的利益を宣言しません。
謝辞
研究は、によってサポートされました: 麻酔教育研究のための財団 (XY);麻酔および周術的ケアのUCSF部門 (XY);1R01NS100801-01(GZ)を使用しています。本研究は、NIH(P30CA082103)の助成を通じて、HDFCCC細胞分析共有資源施設の一部を支援した。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-マウス CX3CR1-APC 抗体 | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| セルストレーナー (70 mm ナイロン) | Falcon | 352350 | |
| 遠心分離機 | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce 組織ホモジナイザー | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACSチューブ(5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS(10x、Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ミリリットル |
参考文献
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
