多重共免疫沈殿を用いたタンパク質相互作用ネットワークダイナミクスの定量化

Summary

定量多重免疫沈殿(QMI)は、2つのサンプル間の標的タンパク質相互作用の豊富さの違いを敏感に検出するためにフローサイトメトリーを使用します。QMIは、少量の生体材料を用いて行うことができ、遺伝子組み換えタグを必要とせず、以前に定義されたタンパク質相互作用ネットワークに適応させることができる。

Abstract

動的タンパク質とタンパク質の相互作用は、運動性からDNA複製、シグナル伝達まで、細胞の挙動を制御します。しかし、タンパク質相互作用ネットワーク内の複数のタンパク質間の動的相互作用のモニタリングは技術的に困難です。ここでは、暴露によって検出された共有複合体におけるタンパク質の相対的な蛍光測定に基づくタンパク質相互作用の倍の変化を定量的に評価できる定量多重免疫沈殿(QMI)のプロトコルを提示する。サーフェスエピトープ(PiSCES)。QMIでは、細胞リザートからのタンパク質複合体を微小球に免疫沈殿させ、PiSCESの豊富さを定量化するために異なるタンパク質の標識抗体を用いてプローブする。免疫沈殿抗体は、異なるMagBeadスペクトル領域に結合され、フローサイトメーターが複数の並列免疫沈殿を区別し、同時に各に関連するプローブ抗体の量を定量化することができます。QMIは遺伝的タグ付けを必要とせず、他の免疫沈殿法と比較して最小限の生体材料を使用して行うことができます。QMIは、相互作用するタンパク質の任意の定義されたグループに適応することができ、これまでT細胞および神経グルタミン酸シナプスのシグナル伝達ネットワークを特徴付けるために使用されてきた。結果は、潜在的な診断および治療用途を有する新しい仮説生成につながった。このプロトコルには、初期抗体パネルの選択からアッセイの実行およびデータの分析に至るQMIを実行する命令が含まれる。QMIアッセイの初期アセンブリは、パネルを生成する抗体をスクリーニングし、適切なリシスバッファーを経験的に決定することを含む。その後の試薬調製物には、MagBeadsに対する免疫沈殿抗体を共生的に結合し、ストレプトアビジン結合蛍化フルオロフォールによって標識できるようにビオチン化プローブ抗体が含まれる。アッセイを実行するために、ライセートを一晩MagBeadsと混合し、次いでビーズを異なるプローブ抗体で分割してインキュベートし、次いで蛍色素標識を、フローサイトメトリーで読み取ります。実験条件によって大きく異なる PiSCES を識別するために 2 つの統計検定が実行され、結果はヒートマップまたはノードエッジダイアグラムを使用して視覚化されます。

Introduction

動的タンパク質とタンパク質の相互作用は、ほとんどの細胞生理学の機能的基礎である分子シグナル伝達カスケードおよびモチル構造を構成^する1.これらのプロセスは、単一の入力に基づいて定常状態を切り替える線形シグナル伝達経路として描かれることが多いが、実験データとモデリングデータは、それらが統合ネットワーク2、3^{として機能することを明確に示している。4.}Gタンパク質の場合、異なる受容体は同じGタンパク質を活性化する能力を有することが多く、単一の受容体は複数のタイプのGタンパク質5、6を活性化することもできる。比較的少数のGタンパク質クラスがシナプス伝達、ホルモン調節、細胞移動などの膨大な配列の細胞機能を特異的に調節するためには、細胞はこれらのシグナルを統合し、分化する必要^{があります4,5.}このシグナル特異性は、Gタンパク質および他のタンパク質に対して、主に微調整されたタンパク質-タンパク質相互作用およびその時間的ダイナミクス1、3....

Protocol

1. アッセイデザイン

1. 候補抗体製剤
   1. 目的のタンパク質ごとに、スクリーニングする抗体を3~5個選択します。可能であれば、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体を使用してください。また、1つの非特異的対照抗体を含む。
   2. トリスを除去するには、抗体を30kDaスピンフィルタに加え、最小体積まで回転させ、リン酸緩衝生理食べ物(PBS)を500μL加え、3回繰り返してバッファー交換を行います。キャリアタンパク質を除去するには、メーカーのプロトコルに従って抗体精製を行います(特定の精製推奨については、材料の表を参照してください)。
      注:これは、キャリアタンパク質および自由アミン基(Trisなど)を持つバッファーがCOOH基と反応し、その後のビーズ結合および生物化反応を消色するためです。すべての抗体が精製され(キャリアタンパク質なし)、一次アミンを含まないバッファー(すなわち、トリスなし)であることを確認してください。
   3. 各抗体をカルボキシレート修飾ラテックス(CML)ビーズに組み合ね、DavisおよびSchrum²⁰によって説明した。抗体を保存するために、ビーズ結合反応を最大1/5(すなわち、0.2-1 mg/mL抗体の10 μLを持つ3.6 x 10⁶ビーズ)までスケールダウンします。
   4. ヘモサイトメーター(通常~10^8....

Results

抗体スクリーニング
図 2Bは、タンパク質コネキシン36に対するスクリーンの結果を示す。ほとんどの IP_プローブの組み合わせは、IgG コントロールに対して信号を生成しません。モノクローナル抗体1E5およびポリクローナル抗体6200のいずれかを有するIPは、IgG対照と比較してビーズ分布において右方向にシフトする。ここで、IP 1E5およびプローブ6200polyは、IPおよびプローブと同じ抗体を使用することを避けるために選択され、両方とも2つの独立抗体によって認識される非特異的タンパク質の確率を低減し、および使用して共同関連を検出する可能性を高める。異なるエピトープ。IgG コントロールと比較して少なくとも 1 ~ 2 ログ高い MFI を持つ IP_probe の組み合わせを選択することをお考めしますが、代替手段が特定されない場合は、コントロールと一貫して区別できる弱い MFI を生成するペアが使用されることがあります。図 2

Discussion

QMIアッセイは、抗体パネルの開発、装置、試薬への多大な投資を必要としますが、アッセイが確立されると、実験的に制御されたタンパク質相互作用ネットワークを観察する高次元データを収集できます。刺激。技術的には、QMIはサンプルおよび抗体の井戸位置の慎重なピペッティングおよび追跡を必要とする。アッセイプレートを注意深くラベル付けすると、紙上の井戸の位置の詳細なテンプレートを作成し、データ分析のために保存されるので便利です。流量サイトメーターマイクロプレートキャリアを含め、ビーズとリサートを常に冷たく保つことの重要性(カスタム冷凍指示については図S1を参照)は誇張することはできません。タンパク質相互作用は室温で急速に解離し、未変更の室温フローサイトメーターを使用する初期の試みは、多くの温度不安定相互作用の同定で終了したが、意図したとおりに変化したものではない。刺激。

QMIは抗体ベースのアッセイなので、抗体の初期選択が重要です。モノクローナル抗体または組換え抗体は、結果の変動性を低減するために可能な限り使用する必要があります。ポリクローナルはロットツーロッ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96ウェル平底プレート	Bio Rad	171025001
96ウェルPCRプレート	VWR	82006-704
BioPlex 200 システム、HTF	Bio Rad	171000205	、部分的に冷蔵保存するように改造されています。詳細については図S1を参照してください
Bio-Plex Pro Wash Station	Bio Rad	30034376
BSA	Sigma
CMLビーズ	Invitrogen	C37481
EDTA	Sigma	E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	A39256
MagPlex Microspheres	Luminex	MC12xxx-01	xxxは、抗体
精製
MES	Sigma	M3671
マイクロプレート フィルム、非滅菌	USA Scientific	2920-0000
ホスフォターゼ阻害剤カクテル #2	Sigma	P5726
プロテアーゼ阻害剤カクテル	Sigma	P8340
サンドイッチ準備冷蔵庫	Norlake	SMP 36 15	Bioplex 200 ナトリウムのカスタム冷凍用
フッ化物	Sigma	201154
オルトバナジン酸ナトリウム	Sigma	450243
Streptavidin-PE	BioLegend	405204
Sulfo NHS	Thermo Scientific	A39269
Tris	Fisher Scientific	BP152