多重共免疫沈殿を用いたタンパク質相互作用ネットワークダイナミクスの定量化

サマリー

定量多重免疫沈殿(QMI)は、2つのサンプル間の標的タンパク質相互作用の豊富さの違いを敏感に検出するためにフローサイトメトリーを使用します。QMIは、少量の生体材料を用いて行うことができ、遺伝子組み換えタグを必要とせず、以前に定義されたタンパク質相互作用ネットワークに適応させることができる。

要約

動的タンパク質とタンパク質の相互作用は、運動性からDNA複製、シグナル伝達まで、細胞の挙動を制御します。しかし、タンパク質相互作用ネットワーク内の複数のタンパク質間の動的相互作用のモニタリングは技術的に困難です。ここでは、暴露によって検出された共有複合体におけるタンパク質の相対的な蛍光測定に基づくタンパク質相互作用の倍の変化を定量的に評価できる定量多重免疫沈殿(QMI)のプロトコルを提示する。サーフェスエピトープ(PiSCES)。QMIでは、細胞リザートからのタンパク質複合体を微小球に免疫沈殿させ、PiSCESの豊富さを定量化するために異なるタンパク質の標識抗体を用いてプローブする。免疫沈殿抗体は、異なるMagBeadスペクトル領域に結合され、フローサイトメーターが複数の並列免疫沈殿を区別し、同時に各に関連するプローブ抗体の量を定量化することができます。QMIは遺伝的タグ付けを必要とせず、他の免疫沈殿法と比較して最小限の生体材料を使用して行うことができます。QMIは、相互作用するタンパク質の任意の定義されたグループに適応することができ、これまでT細胞および神経グルタミン酸シナプスのシグナル伝達ネットワークを特徴付けるために使用されてきた。結果は、潜在的な診断および治療用途を有する新しい仮説生成につながった。このプロトコルには、初期抗体パネルの選択からアッセイの実行およびデータの分析に至るQMIを実行する命令が含まれる。QMIアッセイの初期アセンブリは、パネルを生成する抗体をスクリーニングし、適切なリシスバッファーを経験的に決定することを含む。その後の試薬調製物には、MagBeadsに対する免疫沈殿抗体を共生的に結合し、ストレプトアビジン結合蛍化フルオロフォールによって標識できるようにビオチン化プローブ抗体が含まれる。アッセイを実行するために、ライセートを一晩MagBeadsと混合し、次いでビーズを異なるプローブ抗体で分割してインキュベートし、次いで蛍色素標識を、フローサイトメトリーで読み取ります。実験条件によって大きく異なる PiSCES を識別するために 2 つの統計検定が実行され、結果はヒートマップまたはノードエッジダイアグラムを使用して視覚化されます。

概要

動的タンパク質とタンパク質の相互作用は、ほとんどの細胞生理学の機能的基礎である分子シグナル伝達カスケードおよびモチル構造を構成^する1.これらのプロセスは、単一の入力に基づいて定常状態を切り替える線形シグナル伝達経路として描かれることが多いが、実験データとモデリングデータは、それらが統合ネットワーク2、3^{として機能することを明確に示している。4.}Gタンパク質の場合、異なる受容体は同じGタンパク質を活性化する能力を有することが多く、単一の受容体は複数のタイプのGタンパク質5、6を活性化することもできる。比較的少数のGタンパク質クラスがシナプス伝達、ホルモン調節、細胞移動などの膨大な配列の細胞機能を特異的に調節するためには、細胞はこれらのシグナルを統合し、分化する必要^{があります4,5.}このシグナル特異性は、Gタンパク質および他のタンパク質に対して、主に微調整されたタンパク質-タンパク質相互作用およびその時間的ダイナミクス1、3に基づいて導出される、^4,5,6,7.シグナリングネットワークは、複数の入力、出力、およびフィードバックループを持つ動的タンパク質複合体で構成されているため、単一の摂動は細胞の生理学の全体的な恒所的バランスを変更する機会を有^{する4 、7}.複数の入力の統合が健康と病気7、8の離散細胞機能を制御する方法をよりよく理解するために、シグナル伝達をネットワークの観点から検討する必要があることは今広く合意されています。 ^{9,10,11,12,13}.これを踏まえ、動的タンパク質相互作用ネットワークにおける倍の変化に関する中程度のスループット、定量的データを収集するために、定量多重免疫沈殿(QMI)を開発しました。

QMIは、細胞リサートを蛍光色素の異なる比率を含む磁気ビーズに共存結合した免疫沈殿抗体のパネルでインキュベートする抗体ベースのアッセイです。特異的な抗体を明確な磁気ビーズクラスに結合すると、同じリサートからの複数の標的タンパク質の同時共免疫沈殿が可能になります。免疫沈殿(IP)に続いて、磁気ビーズは、第2の、フルオロフォア共役プローブ抗体(またはフッ素蛍結合ストレプトアビジンと共にビオチン化抗体)でインキュベートされる。各IP抗体プローブ抗体対によって認識されるタンパク質、またはPiSCES(暴露表面エピトープによって検出された共有複合体中のタンパク質)との共結合は、フローサイトメトリーによって検出され、異なる異なる間で定量的に比較することができるサンプル条件¹⁴.図1の図は、蛍光共役プローブ抗体によって標識された免疫沈殿タンパク質複合体を有する磁気ビーズの図を含むQMIアッセイの実行に関与するステップを示す(図1C)。

QMIの感度は、免疫沈殿に使用される磁気ビーズの数に対するリサートのタンパク質濃度に依存し、10%の折りたたみ変化を検出する分解能を達成するには、他の物質に比べて少量の出発物質しか必要とされない共同 IP メソッド^14,15.例えば、QMIで使用される開始物質の量は、サンドイッチ酵素結合免疫ソルベントアッセイ(ELISA)に必要とされるものと同様であるが、単一のQMIアッセイで複数の相互作用が検出される。20のIPおよび20のプローブターゲットを用いてQMIアッセイは、マウス前頭前皮質の3mm冠動脈セクションから単離された1-5 x 10^5の一次T細胞、および3 x 10⁶培養マウス原発を用いて行われた。皮質ニューロン^14,16,17.この感度により、QMIは、臨床サンプルなどの限られた可用性を持つ細胞または組織の分析に有用です。

QMIは、以前に定義されたタンパク質相互作用ネットワーク(抗体が利用可能な場合)に適応することができ、現在までに、T細胞抗原受容体(TCR)シグナルポソームおよびニューロン中のグルタマチングシナプスにおけるタンパク質のサブセットを分析するために開発された。^17歳,18.T細胞受容体シグナル伝達の研究において、QMIは、PiSCESにおける刺激誘発性変化を同定し、次いで対照群から自己免疫患者を区別し、内因性自己免疫シグナル伝達を検出し、最後に相互作用の不均衡な疾患関連サブネットワークを含む仮説¹⁴.より最近では、同じQMIパネルを使用して、TCR関連タンパク質シグナル^伝達19における定性的差ではなく定量的な選択によって決定されるのが同じである。ニューロンにおいて、QMIは、シナプス可塑^性17の新しいモデルを支持する方法で、異なるタイプの入力シグナルに対するタンパク質相互作用ネットワークの入力特異的再配置を記述するために使用された。さらに、このシナプスQMIパネルは、自閉症の7つのマウスモデルの違いを特定し、PiSCESのバイオシグネチャに基づいてモデルをサブグループにクラスター化し、以前は認識されていなかった共有分子欠損を正確に仮定するために使用されました。^モデル16の1つで.同様のアプローチを使用して、異なる薬物治療に応答する可能性のある他のサブグループをスクリーニングしたり、特定の応答性のサブグループに薬物を割り当てたりすることができます。QMIは、基礎科学に加えて、診断、患者サブタイピング、および薬剤開発に潜在的なアプリケーションを持っています。

QMI抗体パネルを組み立てるには、初期抗体スクリーニングおよび選択プロトコルを以下のセクション1に記載する。抗体パネルが同定されると、選択された抗体をIP用の磁気ビーズに結合するためのプロトコル、および選択されたプローブ抗体の生体化のためのプロトコルがセクション2に記載されています。細胞または組織のライサテス上でQMIアッセイを実行するためのプロトコルは、セクション3に記載されています。最後に、単一の実験で~5 x 10⁵個の個別データポイントを生成できるため、データ処理、分析、および視覚化を支援する命令とコンピュータコードがセクション4で提供されます。セクション 2-4 で説明するワークフローの概要を図 1に示します。

プロトコル

1. アッセイデザイン

1. 候補抗体製剤
   1. 目的のタンパク質ごとに、スクリーニングする抗体を3~5個選択します。可能であれば、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体を使用してください。また、1つの非特異的対照抗体を含む。
   2. トリスを除去するには、抗体を30kDaスピンフィルタに加え、最小体積まで回転させ、リン酸緩衝生理食べ物(PBS)を500μL加え、3回繰り返してバッファー交換を行います。キャリアタンパク質を除去するには、メーカーのプロトコルに従って抗体精製を行います(特定の精製推奨については、材料の表を参照してください)。
      注:これは、キャリアタンパク質および自由アミン基(Trisなど)を持つバッファーがCOOH基と反応し、その後のビーズ結合および生物化反応を消色するためです。すべての抗体が精製され(キャリアタンパク質なし)、一次アミンを含まないバッファー(すなわち、トリスなし)であることを確認してください。
   3. 各抗体をカルボキシレート修飾ラテックス(CML)ビーズに組み合ね、DavisおよびSchrum²⁰によって説明した。抗体を保存するために、ビーズ結合反応を最大1/5(すなわち、0.2-1 mg/mL抗体の10 μLを持つ3.6 x 10⁶ビーズ)までスケールダウンします。
   4. ヘモサイトメーター(通常~10⁸/mL)を使用してビーズ数を推定し、4°Cで保存します。ビーズは1年以上保存され、QMIアッセイで正常に使用されていますが、賞味期限または有効期限は正式に確立されていません。B/Sバッファー内のNaN3は細菌の増殖を防ぎます。
   5. 各抗体の一部をビオチン化する(下記のセクション2.2参照)。4 °Cで保存します。
   6. 有効なCMLビーズ結合と正確な計数を確認し、PE結合抗体を反応させたPE結合抗体を用いて1 x 10⁵ビーズを染色し、フローサイトメーターで読み取る。
   7. ストレプトアビジン-HRPを用いてドットブロットによる抗体バイオチリン化を確認する。
   8. ラボで有効であることがわかっている試薬を生成したら、ステップ 1.1.5 および 1.1.6 の確認反応でこれらの試薬を正のコントロールとして使用します。
2. IP-FCMによる抗体スクリーニング(フローサイトメトリーで検出された免疫沈殿)
   1. 適切なスクリーニングリサートを決定します。これおよび他のすべてのQMI前のスクリーニングステップ(このセクション1:アッセイデザインに含まれるもの)では、限られた可用性を持つバイオサンプルを使用しないでください。代わりに、野生型マウス組織、細胞株、または制限資源ではない正常なヒトドナー組織などの同等の対照材料を選択します。
      注: このアッセイのリシスバッファーの選択は簡単なものではなく、セクション 1.5: 洗剤の選択、およびディスカッション セクションの最後の段落で説明されています。標準リシスバッファーは、150 mM NaCl、50 mMトリス(pH 7.4)、10mMフッ化ナトリウム、2mMオルソバナデート、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルのベースを持っています。QMIと互換性のある洗剤には、1%NP-40、1%デジトニン、0.1-1%トリトンX-100、および0.5-1%デオキシコール酸14、16、17、18、19、21が含まれる。
   2. 各IPに使用するリサートの総体積を計算し、スクリーニングするIPプローブの組み合わせごとに10 μLを使用します。Xプローブ抗体をスクリーニングし、1つのIgG制御を使用する場合、各IPは(X+1)*(10 μL)*(ピペッティング誤差の場合は1.1)を使用します。X+1 は、必要な IgG プローブ制御を考慮します。例えば、3x3抗体スクリーンでは、各IPは44 ulを使用する必要があります。IgG IP コントロールを含める必要があります (図 2のスクリーニングの例を参照)。
   3. 使用する CML ビーズ番号を計算します。Xプローブ抗体をスクリーニングする場合は、[(X+1) * 5 x 10⁴ビーズ]を使用します。理想的には、ウェルあたり5,000ビーズは、フローサイトメーターによって読み取られるウェルあたり>2,000ビーズになります。例えば、3 x 3抗体スクリーンでは、各IPはステップ1.1.3から約0.66 μLのCMLビーズストックである20,000ビーズを使用する必要があります(ビーズは、まず正確さを確保するためにヘモサイトメーターを使用して定量する必要があります)。
   4. ステップ1.2.2から各CMLビーズの体積をステップ1.2.3からスクリーニングし、ビーズが沈降するのを防ぐために回転して4°Cで一晩、ステップ1.2.2からリザートの体積をインキュベートします。典型的には、96ウェルPCRプレートの最初のカラムでインキュベーションを行い、PCRチューブストリップキャップを付けてキャップを使用します。
   5. CMLビーズを3,200 x gで1分間スピンダウンし、シンク上のプレートを1回の急速なフリックで取り除きます。小さな白いペレットは、フリックの前後の両方の各井戸の底部に表示される必要があります。
   6. 各ビードプローブペアに対して20 μLに等しいフライPバッファのボリューム内のCMLビードを再中断します。Xプローブ抗体の場合は、ステップ1.2.2と同様に、(X+1) * (20 μL) * (ピペッティング誤差の場合は1.1)を使用します。3 x 3 画面の場合は、FlyP バッファの 88 μL で再中断します。FlyPバッファは100 mM NaCl、50 mMトリスpH 7.4、1%BSA、0.01%NaN₃です。
   7. 96ウェルPCRプレートの各IPを(X+1)ウェルに分散し、Xは20 μL/ウェルを使用してスクリーニングされるプローブ抗体の数です。図 2Aは、スクリーニングの設定例を示します。
   8. ウェルあたり 200 μL の FlyP バッファーを使用して、さらに 2 回洗浄します。ステップ1.2.5のようにプレートを回転させ、各洗浄後に洗浄バッファを取り除くためにプレートをフリックします。ペレットは非常に小さいですが、各洗浄後に表示される必要があります。
   9. スクリーニングされる各ビオチン化抗体について、総体積を(Y+1)* 1.1 * 50 μLとして計算し、ここでYはスクリーニングされるIP抗体の数である。この体積のFlyPバッファーにおける働く濃度に対する希釈抗体は、典型的には0.5mg/mLストックの1:100希釈から始まる。
   10. 96ウェルプレートの各カラムに各希釈抗体を分配し、CMLビーズが再懸濁されていることを確認します。
   11. CMLビーズが懸濁液に残るように、15分間隔で回転またはピペッティングを行い、4°Cで1時間インキュベートします。
   12. FlyPバッファーの200 μLで3倍を洗浄し、各洗浄遠心分離機ごとに、ステップ1.2.5のようにリサートを除去します。
   13. FlyP バッファ内の 1:200 ストレプトアビジン PE の 50 μL ですべての CML ビーズを再中断します。
   14. 暗闇の中で4°Cで30分間インキュベートします。
   15. FlyPバッファーの200 μLで3倍を洗浄し、各洗浄遠心分離機ごとに、ステップ1.2.5のようにリサートを除去します。
   16. FlyP バッファの 200 μL で再中断し、フロー サイトメーターで実行します。
3. アッセイに含める抗体の選択
   1. FSC-H対SSC-Hを使用してサイズにゲートし、FSC-H対FSC-Aを使用してダレットを除去します。
   2. PE蛍光強度のヒストグラムを生成し、両方のIgGコントロール(IgGビーズ試験プローブ、テストビーズ-IgGプローブ)をテストされたペアにオーバーレイします(図2)。
   3. ノイズに対して明確な信号を与えるビーズプローブペアを探します(図2B)。さらに、ビーズとプローブの両方に同じ抗体を使用することは理想的ではありません。差動エピトープ認識は、一部のエピトープが特定のタンパク質複合体に閉塞される可能性があるため、相互作用を観察する可能性を最大化します。受け入れ可能なオプションがない場合は、追加の抗体で画面を繰り返します。
4. 抗体特異性の確認
   1. 目的の標的に対する抗体特異性を確保するために、標的がノックアウトされたリサートサンプルを使用する。たとえば、ノックアウト マウスや RNAi セルラインなどです。あるいは、標的タンパク質が人工的に発現された標的陰性細胞株からのリサートを使用する。
   2. 手順 1.2 で説明したように IP-FCM を実行し、実験に合わせて修正します。
5. 洗剤の選択
   1. 洗剤は共同IP実験で重要なため、異なるバリエーションを経験的にテストして、アッセイが変化を検出する可能性が最大であることを確認します。まず、特定の条件で変化することがわかっている、または研究に特に関心のある比較的小さな相互作用パネル(4-8)を選択します。
   2. 初期スクリーン用に作られた非蛍光、抗体共役CMLビーズを用いて、多様なリシスバッファー洗剤条件を用いて1.2に記載されているようにIP-FCMを行う。洗剤スクリーンは、唯一の変数として洗剤で、または各洗剤のための異なる細胞条件で実行することができます。洗剤はIPプローブの組み合わせで予期しない背景を生じることがあるため、常にビーズとプローブの両方にIgGコントロールを使用してください。
   3. 画面のMISに基づいて、目的のPiSCESの信号を最適化する洗剤を選択します。いくつかの妥協を行う必要がある可能性が高い²².

2. 多重試薬製剤

1. 磁気ビーズカップリング
   1. 磁気ビーズ領域マップを使用して、クロス検出のリスクを最小限に抑えるパターンで使用するビーズ領域を選択します。磁気ビーズは通常、右に塗りつぶすので、斜めに隣接するビーズ領域は避けてください。Luminexのウェブサイトに表示されているビーズ図の他のすべての列からのビーズをお勧めします(https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/)。
   2. 250 μLでPBS(1.1.2のように)で0.1 mg/mLでキャリアフリー抗体を調製します。
   3. 渦磁気ビーズを広範囲に、次にアリコート250 μLを琥珀色のマイクロ遠心管に入れます(ビーズを光漂白から保護します)。
   4. 磁気ビーズを60s用に磁気分離し、上清を除去します。
   5. MESバッファーの250 μL(50 mM MES pH 6.0、1 mM EDTA)、渦、60sのために磁気的に分離し、上清を除去します。MESバッファの200 μLで磁気ビーズを繰り返し再度使用します。
   6. スルフォ-NHSの2mgの単一使用チューブにMESの40 μLを追加し、50 mg/mLストックを作ります。
   7. 磁性ビーズに作りたてのスルフォ-NHSの25 μLを追加します。渦。
   8. MESバッファーに50mg/mLの25μLを新たに溶解したEDAC[1-エチル-3-(-3-ジメチルアミノプロピル)カルボジミド塩酸塩、EDCとも呼ばれる]をMESバッファーに添加します。渦。
   9. 部屋の温度、1000のrpmで20分間の管保持の付属品が付いている渦の上でカバーし、振る。
   10. 60sのために磁気的に分離し、上清を除去します。
   11. PBSの500 μLで再中断し、渦、60秒のために磁気的に分離し、上清を除去する。繰り返します。
   12. ステップ2.1.2から抗体溶液の250 μLを再中断します。渦。
   13. 1000 rpmで渦器で揺れ、部屋の温度で2時間をインキュベートする。
   14. 磁気ビーズに500μLのPBSを加え、渦を60秒分けて磁気的に分離し、上清を除去する。
   15. ブロッキング/ストレージ(B/S)バッファの750 μLを追加します(PBS pH 7.4、0.01% NaN₃で1%BSA)。カバーし、部屋の温度で30分、1000のrpmをインキュベートします。
   16. 60sのために磁気的に分離し、上清を除去します。B/Sバッファーの100 μLで再中断します。
   17. 4 °Cで保存します。ビーズは1年以上保存され、QMIアッセイで正常に使用されていますが、賞味期限または有効期限は正式に確立されていません。B/Sバッファー内のNaN₃は細菌の増殖を防ぐ必要があります。
   18. ステップ1.1.5のように、蛍光抗宿種の二次的な結合磁気ビーズを染色し、フローサイトメーターで読み取ることによって磁気ビーズ結合を検証します。
2. ビオチニル化
   1. 抗体がキャリアタンパク質を持たないPBS内にあることを確認してください。
   2. ビオチン化される抗体の総μgを計算します(多重での使用に推奨される100~200 μg、スクリーニングに推奨される25〜50 μg)。
   3. 新鮮な10mMスルフォ-NHS-ビオチンを調製する(ddH2Oの224μLを1mgの無重量チューブに加えることによって行うことができる)。
   4. 抗体、渦またはピペットを上下に混合する25 μgあたり10mMスルフォ-NHS-ビオチンの1 μLを追加します。
   5. 1時間の部屋温度でインキュベートします。
   6. 4°Cで1時間インキュベートします。
   7. 30 kDaスピンフィルタを使用して非結合ビオチンを除去し、反応を停止します。PBSの500 μLを追加し、最小容積に達するまでカラムを回転させます。追加の PBS の 500 μL を追加し、合計バッファー交換を 3 回繰り返します。
   8. 分光光度計で1-2 μLの吸光度を測定して濃度を推定し、抗体濃度を0.5mg/mLにします。
   9. 4 °Cで保存します。

3. 定量多重免疫沈殿

1. プレートレイアウト
   注:このアッセイは、96ウェルプレートと2-4サンプル条件を使用して実行する場合に最適です。
   1. 条件間の変化を検出するために、常に同じプレート上で適切なコントロール(すなわち、刺激された対非刺激細胞)を実行します。各サンプルをプレート全体に水平に分散し、異なるプローブ抗体に各カラムを使用します。各プローブのテクニカル レプリケートのセットは、最初のセットの直後に実行する必要があります。例については、図 3を参照してください。
   2. 正確なプレートのローディングと解析を容易にするために、プレートレイアウトを慎重に文書化します。
2. サンプル調製・免疫沈殿(1日目)
   1. プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を用いた適切な洗剤中の組織または細胞をライスし、氷上で15分間インキュベートする。常にライサテを冷たく保つように注意してください。
      注:生体材料およびリサートタンパク質濃度を記載する正確な量は経験的に決定されなければならず、以前に使用されたサンプルのいくつかの例は、導入の第3段落に記載されています。一般に、サンプルあたり200 μLの200 μLの範囲では、20 IPおよび20プローブ標的に対して過去に成功しているが、各抗体パネルおよび細胞または組織タイプに対する理想的な入力は経験的に決定されなければならない。
   2. 16,000 x gで15分間4°Cでスピンダウンし、膜や破片を除去します。上清をリサートとして保つ。
   3. BCAアッセイまたは類似のタンパク質濃度を決定し、サンプル間のタンパク質濃度を正規化します。セルを使用する場合は、条件ごとに同じ数のセルから始め、正規化はオプションです。
   4. アッセイに各クラスの約250個の磁気ビーズを含むマスター磁気ビーズミックスを調べます。データ分析後にビーズ数を調整して、将来のアッセイでは各クラスの平均 110 個のビーズがウェルごとに読み取られるようにします。
      注: 計算例: (新しいビーズボリューム) = [(実行平均) / 110] * (前のビーズボリューム)。ビード ボリュームは、この方法で 8 回の実行ごとに、または必要に応じて調整する必要があります。通常、各磁気ビードの3-4 μL(上記のように調製)は、2プレート実験に使用されます。
   5. 磁気分離でFlyPバッファで磁気ビーズミックス2xを洗浄し、FlyPバッファで再サスペンドします。再懸濁液を使用するには、プレートあたりサンプルあたり10 μLを使用します。FlyPバッファは100 mM NaCl、50 mMトリスpH 7.4、1%BSA、0.01%NaN₃です。
   6. 磁気ビーズミックスを徹底的に渦動かした後、アリコート10μLを氷冷マイクロ遠心管(サンプル1本につき1チューブ)に入れます。免疫沈殿のために各チューブに同量のリサート(正規化濃度)を追加します。
   7. アリコート磁性ビーズ混合物を1つのチューブにして、実行中の各プレートにします。例えば、2プレート実験の場合、ライサートを2本のチューブに分割する。免疫沈殿のために一晩4°Cの回転子に管を置き、光を防ぐために覆われる。
3. アッセイの実行(2日目)
   1. プレート#1用のライサート磁気ビーズチューブから始めます。磁気ビーズラックを使用して磁気ビーズからリサートを除去し、将来の分析のためにリサートを予約します。ビーズを500μLの氷冷FlyPバッファーで2倍洗います。チューブチューブは常に氷の上または4 °Cに保管してください。
   2. リサスペンション量を(プローブ数)*(2技術反復)*(ウェルあたり25μL)**(ピペッティング誤差の場合は1.1)として計算します。氷冷 FlyP バッファの計算ボリュームで IP を再中断します。
   3. 穏やかなピペッティングによって磁気ビーズを完全に再膨張させた後、氷の上に平底の96ウェルプレートに1ウェルあたり25 μLを分配します。
   4. 別の96ウェルプレートでは、その順序がプレートレイアウト上の列と一致するように、FlyPバッファ内の2倍の作業濃度(作業濃度は通常1:100または1:200、経験的に決定される)にビオチン化プローブ抗体を希釈します(図3参照)。 ).働く濃度でのプローブ抗体の最終体積はウェル当たり50μLとなるため、調製した各2x抗体の体積は(25μL)*(生体試料数)**(2技術反復)*(ピペッティング誤差の場合は1.1)でなければなりません。
   5. マルチチャンネルピペットを使用して、各プローブ抗体希釈の25 μLを磁気ビーズ含有アッセイプレートに分配します。
   6. 水平プレートシェーカーで振って磁気ビーズを混ぜて再吊り下げ、4°Cで1時間インキュベートし、暗闇の中で450rpmで振ります。
   7. 4°Cで磁気プレートワッシャーにFlyPバッファで3倍を洗浄します。
   8. 1:200ストレプトアビジンPEの50 μLで磁気ビーズを再中断します。
   9. ビーズを混ぜて再濁させ、4°Cで30分間インキュベートし、暗闇の中で450rpmで振ります。
   10. 4°Cで磁気プレートワッシャーにFlyPバッファで3倍を洗浄します。
   11. FlyP バッファの 125 μL で再中断します。
   12. 900 rpmで1分間振り、ビーズを徹底的に再び振り直します。
   13. 冷蔵フローサイトメーターで実行します(図S1の図を参照)。フローサイトメーターソフトウェアの「高RP1ターゲット」設定と、領域あたり1,000ビーズの停止条件(機械が早期に停止するのを防ぐために個々のウェルにあるべき数を大幅にオーバーシュート)と80 μLのサンプル体積を使用します。
   14. 途中で実行を一時停止し、ビーズを再一時停止して、セトリングを防ぎます。
   15. データ ファイルを .xml 形式でエクスポートします。
   16. ステップ 3.3.1 から、残りのプレートのプロセスを繰り返します。

4. データ分析

注: ANC コードは、N = 4 の実験から 2 つの条件を比較するように設計され、各条件に対して 2 つの技術的な反復があります。例えば、細胞は4回独立して刺激され、QMIは制御(無刺激)および刺激された細胞の4つの異なる日に実行され、上記のように技術的な反復を行い、データ分析は以下のように進む。

1. 調整可能なアルファカットオフ(ANC)を備えたアダプティブノンパラメトリック
   1. MATLAB を開き、アクティブ ディレクトリを、ANC プログラム コンポーネントとフロー サイトメーターからエクスポートされた .xml ファイルを含むフォルダに設定します。
   2. 実験計画の詳細を反映するために、「ANC入力」ファイルを記入してください。補足ファイルに含まれるサンプルファイルは、サンプルデータを実行するために事前に入力されています。
   3. プログラムを実行して、.csv ファイルをアクティブ ディレクトリに書き込みます。このファイルは、PiSCES が 0.05 の偽陽性 (アルファ) レベルで、コントロール条件と実験条件の間、4 つの実験反復すべて、または少なくとも 3/4 反復で有意に異なる PiSCES を報告します。
   4. ステップ 4.3.1 で使用するために、ファイル内の 3/4~4/4 として表される少なくとも 3 つの実験反復で有意な差がある PiSCES として定義される「ANC ヒット」に注意してください。
2. 加重相関ネットワーク解析²³ (CNA)
   1. 「_MFI」で終わるMatlabによって出力されるデータファイルの列タイトルを貼り付け/書き起こしします。新しい Excel シートの最初の行に CSV" します。実験数の「実験」、および「治療」の列を追加し、実験処理、または分析する他の変数を追加します。このファイルを "traits.csv" として保存します。
   2. R スタジオを開き、作業ディレクトリを "_MFI" を含むフォルダに設定します。CSV」と「特性」。CSV"ファイル。
   3. コメント付きコマンド・ファイルに示されているように R コマンドを実行し、ファイルに含まれる指示に記載されています。WCNA モジュールは、各実験特性と有意に相関するグラフィック ファイルとして出力され、各モジュールとの相互作用 IP_i_Probe_Jの相関関係は .csv ファイルとして出力されます。
   4. 注: モジュール メンバーシップ (MM) > 0.7 および p < 0.05 との相互作用として定義され、ステップ 4.3.1 で使用するために、関心のある実験変数と有意に相関していると特定されたモジュールのメンバーシップに対して。
3. ポジティブな「ヒット」とビジュアライゼーション
   1. ANC 出力ファイルの "3/4 の 4/4 ヒット" リストの各相互作用 (ステップ 4.1.4 から) では、CNA 出力ファイルをチェックして、その相互作用が 「CNA ヒット」であるかどうかを確認します (ステップ 4.2.6 を参照)。各 ANC ヒットも CNA ヒットであるかどうかを示す新しい列を作成します。
   2. ステップ 4.1.3 から ANC 出力スプレッドシート "_Hits.csv" に指定された値を平均して、ANC の各 ANC の CNA ヒットの平均ログ₂倍の変更値を計算します。平均化前に値をログ₂倍の変更に変換します。3/4 レプリケートのみで有意だった交互に、外れ値を削除します。
   3. 1 つの列に IP としてリストされている各 ANC の CNA ヒット、2 番目の列のプローブ、および 3 番目の列の折り目変更値を含むスプレッドシートを作成します。このスプレッドシートを使用して、ネットワークとしてファイルをインポートして Cytoscape でノードエッジダイアグラムを作成します。

結果

抗体スクリーニング
図 2Bは、タンパク質コネキシン36に対するスクリーンの結果を示す。ほとんどの IP_プローブの組み合わせは、IgG コントロールに対して信号を生成しません。モノクローナル抗体1E5およびポリクローナル抗体6200のいずれかを有するIPは、IgG対照と比較してビーズ分布において右方向にシフトする。ここで、IP 1E5およびプローブ6200polyは、IPおよびプローブと同じ抗体を使用することを避けるために選択され、両方とも2つの独立抗体によって認識される非特異的タンパク質の確率を低減し、および使用して共同関連を検出する可能性を高める。異なるエピトープ。IgG コントロールと比較して少なくとも 1 ~ 2 ログ高い MFI を持つ IP_probe の組み合わせを選択することをお考めしますが、代替手段が特定されない場合は、コントロールと一貫して区別できる弱い MFI を生成するペアが使用されることがあります。図 2

ディスカッション

QMIアッセイは、抗体パネルの開発、装置、試薬への多大な投資を必要としますが、アッセイが確立されると、実験的に制御されたタンパク質相互作用ネットワークを観察する高次元データを収集できます。刺激。技術的には、QMIはサンプルおよび抗体の井戸位置の慎重なピペッティングおよび追跡を必要とする。アッセイプレートを注意深くラベル付けすると、紙上の井戸の位置の詳細なテンプレートを作成し、データ分析のために保存されるので便利です。流量サイトメーターマイクロプレートキャリアを含め、ビーズとリサートを常に冷たく保つことの重要性(カスタム冷凍指示については図S1を参照)は誇張することはできません。タンパク質相互作用は室温で急速に解離し、未変更の室温フローサイトメーターを使用する初期の試みは、多くの温度不安定相互作用の同定で終了したが、意図したとおりに変化したものではない。刺激。

QMIは抗体ベースのアッセイなので、抗体の初期選択が重要です。モノクローナル抗体または組換え抗体は、結果の変動性を低減するために可能な限り使用する必要があります。ポリクローナルはロットツーロッ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェル平底プレート	Bio Rad	171025001
96ウェルPCRプレート	VWR	82006-704
BioPlex 200 システム、HTF	Bio Rad	171000205	、部分的に冷蔵保存するように改造されています。詳細については図S1を参照してください
Bio-Plex Pro Wash Station	Bio Rad	30034376
BSA	Sigma
CMLビーズ	Invitrogen	C37481
EDTA	Sigma	E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	A39256
MagPlex Microspheres	Luminex	MC12xxx-01	xxxは、抗体
精製
MES	Sigma	M3671
マイクロプレート フィルム、非滅菌	USA Scientific	2920-0000
ホスフォターゼ阻害剤カクテル #2	Sigma	P5726
プロテアーゼ阻害剤カクテル	Sigma	P8340
サンドイッチ準備冷蔵庫	Norlake	SMP 36 15	Bioplex 200 ナトリウムのカスタム冷凍用
フッ化物	Sigma	201154
オルトバナジン酸ナトリウム	Sigma	450243
Streptavidin-PE	BioLegend	405204
Sulfo NHS	Thermo Scientific	A39269
Tris	Fisher Scientific	BP152