ここでは、成体マウスにおける感染の内因性経路を介して髄膜炎球菌性髄膜炎を誘発する方法について説明する。我々は、接種の調製から内人種差別感染までの髄膜炎球菌感染のステッププロトコルによるステップを提示する。その後、動物の生存を記録し、マウス組織の細菌負荷を評価します。
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この記事について
サマリー
要約
髄膜炎(髄膜炎)は狭い宿主範囲の微生物であり、世界的に細菌性髄膜炎の主な原因として認識されています。髄腔球菌は、健康な被験者のおよそ10%のヒト鼻咽頭の一過性の植民地である。特に状況では、粘膜関門を貫通する侵襲的な能力を獲得し、敗血症を引き起こす血流に侵入する。最新のケースでは、髄炎の結果的な発症がなくても、敗血症のフルミネリングが発生する可能性があります。逆に、細菌は血流の中で十分に増殖し、血液脳関門を通過し、中枢神経系に達し、フルミナント髄炎につながる可能性があります。細菌性髄炎のマウスモデルは、宿主と病原体の相互作用を調査し、この致死性疾患を引き起こす病因のメカニズムを分析するのに有用なツールを表す。しかし、過去数十年間にいくつかの実験モデルシステムが評価されてきたが、これらのいずれも髄膜炎球菌疾患の特徴的な病理学的事象を再現できなかった。この実験プロトコルでは、細菌の不必要な接種に基づくマウスモデルにおける髄膜炎球菌性髄膜炎の誘導に関する詳細な手順について説明する。ヒト髄炎の特異な徴候は、臨床パラメータ(例えば、温度、体重)の評価、生存率の評価、微生物学的分析および脳損傷の組織学的検査を通じてマウス宿主に記録された。インティリテーラーナル(i.cist.)接種を使用する場合、髄膜球菌はシステナマグナに直接完全に送達し、脳組織における非常に効率的な髄膜炎球菌複製をもたらす。約18時間で生存可能な数の生存率の1,000倍の増加が観察される。さらに、髄膜球菌は脾臓、および感染したマウスの肝臓にも見られ、肝臓が髄膜炎球菌複製の標的器官を表す可能性があることを示唆している。
概要
ナイセリア髄膜炎は、世界中の人間集団における髄膜炎および敗血症の最も一般的な原因の1つとしてよく知られている、ヒト宿主に限定されたグラム陰性β-プロテオバクテリウムである。健康で無症候性の担体(人口の2~30%)の上気道(鼻と咽喉)を植民地化しますが、細菌は時々様々な宿主の免疫防御を回避し、血流から脳に広がり、制御されない局所を引き起こします髄膜炎菌性髄膜炎として知られている炎症。宿主と細菌因子の組み合わせは、侵襲的な行動1への収容者からの移行に寄与しているように見える。
N. 髄膜炎は、ヒトの植民地化と感染に特化しています。それは狭い宿主範囲を有し、したがって、ヒト髄膜炎菌性疾患を再現する適切な動物モデルの欠如による生体内病因の研究に限られている。その結果、髄菌によって引き起こされる敗血症および髄炎の病因に関する理解の根本的なギャップにつながっていた。過去数十年の間に、多くのin vitroシステムの開発は、いくつかの髄膜炎球菌毒性因子2、3、4の同定を可能にした。これらの貴重な研究は、髄膜炎球菌感染の成功に対するこれらの因子の役割を理解するための重要な洞察を提供したが、これらのモデルは、体液性および細胞と....
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プロトコル
このプロトコルは、1986年11月24日(86/609/EEC)の欧州共同体評議会指令に従って、動物の苦しみを最小限に抑え、マウスの数を減らすために行われました。本研究で報告された生体内実験は、倫理動物ケア・利用委員会(2012年12月14日)とイタリア保健省(Prot. 0000094-A-03/01/2013)によって承認された。すべての手順は、BSL2ルームのバイオセーフティキャビネット2(BSC2)内で行う必要があり、潜在的な感染廃棄物は専用の容器に処分する必要があります。
1. N. 髄膜炎血清基C株を有するマウスの感染
注意:N.髄膜炎は潜在的に有害な病原体であり、この微生物を取り扱う際に必要なすべての予防措置を講じる必要があります。実験全体にはバイオセーフティレベル2(BSL2)封じ込めが必要です。動物実験に関与する研究者は、実験期間中、使い捨て可能な個人用保護具(PPE)を着用する必要があります。
- 生体内感染研究のための細菌の調製
- GC(ゴノコッカル)寒天プレートに新鮮なナイセリア髄膜炎培養から単一のコロニーを選び、1%(vol/vol)ポリビトックスサプリメントを補充し、GCブロスの10 mLで接種する。
- 220 rpmの....
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結果
N.髄膜炎野生型および等素変異株に感染したマウスの生存
これらの代表的な結果で使用されるナイセリア髄膜炎株は、セログループC参照株93/4286(ET-37)およびその等因性変異体93/4286ΩcssAを、cssA遺伝子の挿入不活性化により得られ、コード化したUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼは、カプセル合成軌跡25にマップされる。本マウスモデルにおけるcssA-欠陥株の毒性度を評価するために、感染動物の50%の死亡を判定できる致死量(LD50)を評価した。この目的のために、動物の3つのグループは、野生型株93/4286の104〜10 6 CFUの範囲の用量で、および変異株93/4286ΩcssAの107〜10 9 CFUの間の用量で、眼科内に感染した.一般に、臨床パラメータの減少(例えば、体重および温度)および死亡率の.......
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ディスカッション
本研究では、i.cistによる成人マウスにおける髄膜炎球菌性髄膜炎を誘発する実験プロトコルについて述べている。髄膜炎菌の接種私たちの知る限りでは、髄膜炎菌性髄膜炎の他のモデルは、i.cistによって感染した実験室マウスで開発されていません。ルート;過去に、この方法は、ラット31とウサギ32の両方で髄膜炎球菌性髄膜炎のモデルを提供するために探求されてきました。髄膜炎菌性疾患の最も高い率は、幼児、青年、および若年成人33、34、35の間で発見されることをよく知られています。このため、髄炎マウスモデルでは、新生児や乳児動物に焦点を当てるのではなく、8週齢の免疫担当動物が用いられた。
実験モデルでは、i.cistを使用することにしました。それはCSFの細菌複製を促進するので、システナマグナに直.......
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開示事項
著者たちは何も開示する必要はない。
謝辞
研究は、PRIN 2012 [付与番号 2012WJSX8K]によって部分的にサポートされました: "粘膜感染症における宿主微生物相互作用モデル:新しい治療戦略の開発"と PRIN 2017 [2017SFBFER]: "間の相互作用に取り組むための統合されたアプローチ適応、ストレス条件と挑戦的な病原体の抗菌性」。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1,8 スカート クライオバイアル おねじ付き | Starlab | E3090-6222 | |
| 50 mL ポリプロピレン コニカル チューブ | Falcon | 352070 | 30 mm x 115 mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | ステンレス鋼 |
| 警報温度計 | TESTO | 9000530 | |
| BactoTMプロテオースペプトン | BD | 211693 | |
| BDマイクロファインシリンジ | BD | 320837 | U-100インスリン |
| BDプラスチパックシリンジ1mL 25G 5/8インチ | BD | 300014 | 05mm×16mmBD |
| プラスチパックシリンジ5mLBD | 308062 07mm×30mm | ||
| バイオハザード オーラB 垂直層流キャビネット | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up: 400 mL, Total Volume 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm |
| C150 CO2 インキュベータ | ーバインダー | 9040-0078 | |
| ケージボディ Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267 x 207 x 140 mm3、床面積 370 cm2 |
| 細胞培養シャーレ 蓋付き | Thermo Scientific | 150288 | 作業量:5 mL |
| 遠心分離機 | エッペンドルフ | マイクロ遠心機 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| 二カリウムリン酸水素三水和物 | カルロエルバ | 471767 | |
| 二ナトリウムリン酸水素無水ACS-分析用 | カルロエルバ | 480141 | g1000 |
| ダイエット標準証明書 | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | 動物用食品ペレット |
| デュモン HPピンセット 5 ステンレス製 | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0.10 x 0.06 mm2 チップ |
| 電子天秤 | Gibertini | EU-C1200 | 最大 1200 g, d = 0.01 g, T = -1200 g |
| エッペンドルフ 微量遠心分離機チューブ セーフロック | エッペンドルフ | T3545-1000EA | |
| エリスロマイシン | Σ-Aldrich | E-6376 | 25 g |
| ボン極細ハサミ | F.S.T. | 14084-08 | ステンレス鋼 |
| フィルタートップ(ミニアイソレーター)、ロッククランプ | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC寒天ベース | OXOID | CM0367 | |
| ギリーズ鉗子1 x2歯 | FST | 11028-15 | ステンレス鋼 |
| グリセリンRPE | カルロエルバ | 453752 | 1 L |
| グレーフ鉗子 | FST | 11052-10 | 鋸歯状 先端幅: 0.8 mm |
| 内蓋 | Tecniplast | 1264C116 | |
| 鉄デキストラン溶液 | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| ケタミン | インターベット | ||
| 微生物学的安全キャビネット BH-EN および BHG クラス II | 高速 | BH-EN 2004 | |
| 微量遠心チューブ 1.5 mL | ブランド | PP780751 | スクリューキャップPP、グラッド |
| マウスハンドリング鉗子 | F.S.T. | 11035-20 | 鋸歯状ゴム;グリップ面:15 mm x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000 mL |
| 天然ラテックス手袋 | Medica | M101 | |
| ニューブランズウィッククラシックC24インキュベーター シェーカー | PBIインターナショナル | C-24 クラシックベンチトップインキュベーターシェーカー | |
| ペトリPSディッシュ | VWR | 391-0453 | 90 x 14.2 mm2 |
| Pipetman Classic P20 | ギルソン | F123600 | 2-20 μL |
| ピペットマン クラシック P200 | ギルソン | F123601 | 20-200 μLL |
| ピペットマン クラッシム P1000 | ギルソン | F123602 | 200-1,000 μL |
| ポリビトックス | オキソイド | SR0090A | |
| 塩化カリウム | J.T. ベーカー・ケミカルズ B.V. | 0208 | 250 g |
| リン酸二水素カリウム | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1 kg |
| PS 使い捨て鉗子 | VWR | 232-0191 | |
| 取り外し可能な仕切り | Tecniplast | 1264C812 | |
| 丸底ポリプロピレンチューブ | ファルコン | 352063 | 5 mL |
| 塩化ナトリウム | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS リテーナーとポリエステルフィルターシート | Tecniplast | 1264C | |
| スタンダードパターン鉗子 | F.S.T. | 11000-12 | ステンレス |
| スティーブンス腱切開はさみ | F.S.T. | 14066-11 | ステンレス鋼 |
| 外科用ハサミ - ToughCut | FST | 14130-17 | ステンレス |
| タッチ N 凝灰岩 使い捨てニトリル手袋 | アンセル | 92-500 | |
| 超低温 (ULT) 冷凍庫 | ハイアール | DW-86L288 | 容量 = 288 L |
| ワグナーはさみ | F.S.T. | 14070-12 | ステンレス鋼 |
| キシラジン | インターベット |
参考文献
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al.
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