このプロトコルでは、リンパ球は、多孔質膜によって下部チャンバから分離された移行系の上部チャンバーに配置される。ケモカインは底室に添加され、ケモカイン勾配に沿って活発な移動を誘導する。48時間後、リンパ球は、移行を定量するために両方の部屋でカウントされます。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
本明細書では、基本的な実験室のスキルと材料を用いて、排外移動系におけるリンパ球ケモキネティック運動を評価する効率的な方法を提示する。グループ2自然リンパ球細胞(ILC2)およびCD4+Tヘルパー細胞を、鶏卵オブアルブミン(OVA)チャレンジBALB/cマウスの脾臓および肺から単離した。CD4+T細胞とILC2の両方でCCR4の発現を比較的確認した。CCL17 および CCL22 は CCR4 の既知のリガンドです。そこで、このex vivo移行法を用いて、CCCL17-およびCCL22誘発性CCR4+リンパ球の動きを調べた。ケモカイン勾配を確立するために、CCL17およびCCL22を移行システムの底室に配置した。その後、単離されたリンパ球を上のチャンバーに加え、48時間の期間にわたって、リンパ球は3μmの細孔を通って下部チャンバーのケモカインに向かって積極的に移行した。これは、リンパ球の化学化物を決定するための効果的なシステムですが、当然のことながら、生体内臓器微小環境に見られる複雑さを模倣しません。これは、研究中の臓器およびリンパ球のその中の画像化の添加によって克服することができる方法の1つの制限である。対照的に、この方法の利点は、ライブイメージングよりもはるかに費用対効果の高い速度でエントリーレベルの技術者によって行う場合です。治療化合物が移行を増強するために利用可能になるにつれて、腫瘍浸潤細胞細胞の場合のように、または移行を阻害するために、おそらく免疫病理学が懸念される自己免疫疾患の場合には、スクリーニングツール。一般に、この方法は、目的のケモカインが一貫してメディア制御よりも統計的に高いレベルでケモキネティクスを生成している場合に有効である。このような場合、所定の化合物による阻害/増強の程度も同様に決定することができる。
概要
このオリジナルの移行方法は、実験医学1のジャーナルで1962年にスティーブン・ボイデンによって提示されました。ケモタキシスとケモキネティクスについて私たちが知っていることの多くは、ボイデン室の開発なしには不可能です。1977年に最初のケモカインが発見される前に、好中球1、2の細胞運動を増幅しながらマクロファージの細胞運動を停止させることができる血清因子について学ぶために、ex vivo移行システムが使用された。免疫細胞の移動に関する膨大な知識が開発され、現在までに47のケモカインが19の対応する受容体3、4で発見されています。さらに、これらのケモカイン経路の多数の阻害剤/増強剤は、治療目的5、6、7、8の開発を受けている。これらの化合物の多くは、与えられたケモカイン9に対する化合物と免疫細胞応答性との間の直接的な相互作用を理解するため....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
ここに記載されているすべての方法は、ネブラスカ大学医療センター(UNMC)とユタ大学の施設動物ケアおよび使用委員会によってレビューされ、承認されました。
1. 試薬のセットアップと準備
-
完全なRPMI(ロズウェルパーク記念研究所)メディアを準備します。
- RPMIの90 mLに熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)の10 mLを追加します。
- 100xペニシリン連鎖筋筋ミン-グルタミンの1mLを100mLの100mLに10%FBS RPMIの追加します。
-
ILC2 拡張メディアを準備します。
- IL-2およびIL-33(各サイトカイン20ng/mL)を完全なRPMIの10 mLに加える。
- ストックサイトカインが10 μg/mLの場合、完全なRPMI培中の10 mLを含む15 mLチューブにIL-2およびIL-33のピペット20 μLを含む。
-
肺解離培地を調剤する。
- 1型コラゲナーゼの50mgを250mLの未補充RPMIに加える。
- ステップ1.3.1のメディアの250 mLに100倍ペニシリン連鎖筋菌-グルタミンの2.5 mLを追加します。 ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
CD4+ T細胞およびILC2上のCCR4発現。
排生移行実験の成功のためには、リンパ球がCCR4を介してCCL17およびCCL22に応答するかどうかを決定することが不可欠である。そこで、流量細胞メトリーによりCD4+T細胞とILC2の両方でCCR4発現を決定した。OVA特異的CD4+ヘルパーT細胞がCCR4を発現することはよく知られているが、ILC2上のCCR4の発現についてはあまり知られていない。図1は、CCR4発現の代表的な結果を、比較的、CD4+T細胞(図1A,C)およびILC2(図1B,D)の雄および雌から、OVAチャレンジBALB/cマウスを示す。フローサイトメトリーは、アロフィコシアニン(APC)に結合したモノクローナル抗体を.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
本明細書では、排生体移行システムにおけるケモカイン誘発リンパ球の移行を評価するための確立された方法を提示する。プロトコルにはいくつかの重要なステップがあり、そのうちの1つは実験中の免疫細胞上の正しいケモカイン受容体の発現を検証することである。私たちの手の中で、我々はアレルギー性炎症におけるTh2ヘルパーT細胞上のCCR4の重要性を強調する文献の体のためですCCR4を選びました。オブアルブミン誘発性炎症は、以前に少なくとも2つのCCR4アンタゴニスト24、25によって制限されることが示された。しかしながら、これは、グループ2自然リンパ球細胞(ILC2)26、27の発見前であった。我々は、ILC2細胞がCD4+T細胞よりも高いCCR4を発現することを示す新しいデータを生成し、これらの細胞がCCL22に一貫して応答していることを示した。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は、開示する財務情報や利益相反を持っていません。
謝辞
この作品は、米国肺協会(K.J.W.)、T.A.W.とK.J.W.に授与されたメモリアルユージーン・ケニー基金、ユタ大学からの寛大なスタートアップ支援、およびT.A.W.(VA I01BX0035)に対する退役軍人省賞によって資金提供されました。T.A.W.は退役軍人省から研究キャリアサイエンティスト賞(IK6 BX003781)を受賞しています。著者たちは、リサ・チュドメルカ氏の編集支援を認めたいと考えています。著者らは、この原稿のために生成されたフローサイトメトリーデータを収集する上での彼らのサポートのためのUNMCフローサイトメトリーコアに感謝します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.4% トリパン ブルー | シグマ-アルドリッチ | 15250061 | |
| 1 mL シリンジ | BD バイオサイエンス | 329424 | U-100 シリンジ マイクロファイン 28 G 1/2" 1cc |
| 100x ペニシリン-ストレプトマイシン、L-グルタミン | Gibco | 10378-016 | RPMI 培地 15 |
| mL コニカルチューブ | オリンパスプラスチック | 28-101 | ポリプロピレンチューブ |
| 3 μm トランズウェルインサート | ジェネシー・サイエンティフィック | 25-288 | 24ウェルプレート 12個のトランズウェルインサートを含む |
| 3倍安定化固定剤 | BD ファーミゲン338036 | メーカーのプロトコルに従って1倍溶液を調製 | |
| 5mLポリスチレンチューブ | STEM Cell Technologies | 38007 | |
| 50mLコニカルチューブ | オリンパスプラスチックス | 28-106 | ポリプロピレンチューブ |
| 8チャンバー簡単分離磁石 | STEM Cell Technologies | 18103 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies Corporation | A1049201 | |
| Advanced cell strainer, 40 μm | ジェネシー・サイエンティフィック | 25-375 | ナイロンメッシュ、40 μmストレーナー |
| 水酸化アルミニウム、試薬グレード | Sigma-Aldrich | 239186-25G | 20 mg/mL |
| 抗マウス CCR4;APC標識 | バイオレジェンド | 131211 | 0.5 μg/test |
| 抗マウス CD11b | BD Pharmigen | 557396 | 0.5 μg/test |
| 抗マウスCD11c;PE eFluor 610 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 61-0114-82 | 0.25 μg/test |
| 抗マウス CD16/32, Fc ブロック | BD Pharmigen 553141 | 0.5 μg/test | |
| 抗マウスCD19;APC-eFluor 780 コンジュゲート | Thermo-Fischer Scientific | 47-0193-82 | 0.5 μg/test |
| 抗マウスCD3;PE Cy 7-共役 | BD Pharmigen | 552774 | 0.25 μg/test |
| 抗マウスCD45;PE共役BD | Pharmigen | 56087 | 0.5 μg/test |
| 抗マウス ICOS (CD278) | BD Pharmigen | 564070 | 0.5 μg/test |
| 抗マウスNK1.1(CD161);FITC 共役 | BD Pharmigen 553164 | 0.25 μg/ | |
| test抗マウスST2(IL-33R);PerCP Cy5.5 | バイオレジェンド | 145311 | 0.5 μg/test |
| 全自動セルカウンター | BIORAD | 1450102 | |
| 全自動解離剤 | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| ウシ血清アルブミン、凍結乾燥粉末 | Sigma-Aldrich | A2153-10G | 0.5% 無血清 RPMI |
| セルカウンター Clides | BIORAD | 1450015 | |
| Chicken Egg オボアルブミン、グレード V | Sigma-Aldrich | A5503-10G | 500 μg/mL |
| コラゲナーゼ、1型、ろ過済み | Worthington Biochemical Corporation | CLSS-1、5 X 50 mg バイアル (LS004216) | 25 U/mL の RPMI |
| コンペンセーションビーズ | Affymetrix | 01-1111-41 | 1 滴/コントールチューブ |
| 解離チューブ | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-335 | |
| FACS バッファー | BD Pharmigen | 554657 | 1x PBS + 2%FBS、アジ化ナトリウム付き;4°Cで保管。C |
| ヒート不活化-FBS | ジェネシーサイエンティフィック | 25-525H | 10%完全RPMI&でILC2 増殖培地 |
| マウス CCL17 | GenScript | Z02954-20 | 50 ng/mL |
| マウス CCL22 | GenScript | Z02856-20 | 50 ng/mL |
| マウス CD4+ T 細胞濃縮キット | STEM Cell Technologies | 19852 | |
| マウス IL-2 | GenScript | Z02764-20 | 20 ng/mL |
| マウス ILC2 濃縮キット | STEM Cell Technologies | 19842 | |
| マウス組換えIL-33 | STEM Cell Technologies | 78044 | 20 ng/mL |
| RPMI | Life Technologies Corporation | 22400071 | |
| Separation Buffer | STEM Cell Technologies | 20144 | 1x PBS + 2% FBS; 4 °C;C |
| 小動物ネブライザーとチャンバー | データサイエンスインターナショナル | ||
| 滅菌生理食塩水 | バク | スター2F7124;NDC 0338-0048-04 | 0.9%塩化ナトリウム |
参考文献
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Imm....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
