Method Article

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

DOI:

10.3791/60085

⸱

September 25th, 2019

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1Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, The Children's Hospital of Philadelphia, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

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このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたヘテロ接合性またはホモ接合ヌクレオチド変化の生成を容易にする方法を提供する。

Abstract

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ヒト多能性幹細胞は、遺伝子機能を研究し、疾患に関連する特定の変異をモデル化するための強力なシステムを提供します。正確なヘテロジゴウス遺伝子改変の生成は、CRISPR-CAS9が第2対立遺伝子のインデル形成を媒介しているため困難である。ここでは、1 つだけが目的のシーケンス変更を表現する 2 つの修復テンプレートを使用して、この問題を克服するためのプロトコルを示しますが、両方のテンプレートには、再切断とインデル形成を防ぐためのサイレント変異が含まれています。この方法論は、DNAの遺伝子編集コード領域がヒト疾患および生物学を研究するための等元制御および変異ヒト幹細胞株を生成するのに最も有利である。さらに、遺伝子編集実験の労力とコストを削減するために、トランスフェクションおよびスクリーニング方法論の最適化が行われている。全体として、このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞モデルを利用した多くのゲノム編集プロジェクトに広く適用可能である。

Introduction

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ヒト胚性幹細胞(HESC)および誘導多能性幹細胞(iPSC)は、異なる系統の細胞型を生成する能力を維持しながら、更新能力のためにヒト疾患をモデル化するための貴重なツールである1,2 、3、4.これらのモデルは、遺伝子機能を調知する可能性を開き、特定の変異および文言型が様々な疾患5,6にどのように関連しているかを理解する。しかしながら、特定の変化が特定の表現型にどのように連結されるかを理解するためには、対同原性制御および変異細胞株の使用は、線対線変動性7、8を制御するために重要である。転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)および亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、原発細胞を含む多様な遺伝モデルにおける挿入または欠失(インデル)変異を生成するために使用されてきた。しかし、これらのヌクレアーゼは、使用し、高価な9、10、11、12、13、14を使用するのが面倒なことができます。

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Protocol

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1. ガイドRNA(gRNA)の設計・施工

注:各gRNAは、100 bpの二本鎖(ds)オリゴヌクレオチド(図1A-C)を生成するためにアニールされた2つの60塩基対(bp)オリゴヌクレオチドで構成されています。gRNAの設計、生成、試験の効率は約2週間です(図2)。

  1. ゲノム編集対象のDNA領域を選択し、フォーマットに適合する3-4 23 bp配列を同定し、5'-G(N 19)NGG-3'を同定する。これらのシーケンスは、対象地域の 20 bp 以内に配置する必要があります。
    注:ターゲティングは、センスまたはアンチセンスストランドで実行することができます。
  2. CRISPOR(http://crispor.tefor.net)などのリソースを使用して、ゲノムの冗長性とオフターゲット確率のgRNA配列を評価します。
  3. 20 bpターゲット配列(プロトスペーサー隣接モチーフまたはPAMを除く)を2つの60merオリゴヌクレオチドに組み込みます(シーケンスは5'~3'、赤と緑は図1Cに示すように逆補数です)。
  4. 選択したベンダーから2つ....

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Results

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gRNAの生成とインデルのスクリーニング

各gRNAをプラスミドベクターにクローニングし、U6プロモーターを用いて発現する。AflII制限酵素は、プラスミド(#41824アジーン)を線形化するために使用され、U6プロモーターの後に位置する。2つの60bpオリゴをアニーリングした後に生成された100bpバンドは、DNAアセンブリを用いてgRNA発現ベクターにクローニングされる。gRNAプラスミドが生成されると、それらはCRISPS-CAS9 GFPプラスミド(#44719アジーン)と共にHESCまたはiPSCにトランスフェクトされる。GFP+細胞は、トランスフェクトされた細胞とメッキのために濃縮するために2日後にソートされる(セクション5参照)。10-14日後、単一細胞由来コロニーを採取し、DNAを単離して、各gRNAに対して生成されたインデル形成をスクリーニングするために使用する。gRNA部位にまたがるプライマーを用いたPCR増幅は、EtBrを用いて2.5%(w/v)のアガロースゲルを用いてインデル形成を可視化するために使用され、.......

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Discussion

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このプロトコルでは、CRISPR-CAS9と2つのssODN修復テンプレートを使用して、ヒト多能性幹細胞において特定のヘテロ接合性またはホモ接合ゲノム変化を生成することが実証されている。この方法により、10%に近い効率でヘテロ接合ゲノム変化を発現する等元細胞株の生成に成功した。このプロトコルは、細胞選別後に低密度で細胞を培養した後の細胞増殖と生存をサポートする照射MEF上で成長したヒトESCとiPSCの両方に最適化されています。細胞死は10 ng/mL bFGFおよびY-27632二塩酸塩を持つ細胞を維持することによって最小にすることができる。このプロトコルはフィーダーフリー培養システムに適合する可能性がありますが、さらなる最適化が必要な場合があります。

トランスフェクション効率は細胞株から細胞株まで可変ですが、脂質トランスフェクション試薬のDNA3μgと3μLの使用は、一般的に0.5~2%のトランスフェクション効率の最良の結果を与えました。しかしながら、トランスフェクション効率が低ければ、DNAや脂質試薬の量の最適化が行うことができる。他のトランスフェクション試薬も研究者によって.......

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Disclosures

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著者は何も開示していない。

Acknowledgements

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この研究は、国立心臓・肺・血液研究所(NHLBI)、国立衛生研究所(助成金U01HL099656(P.G.およびD.L.F.)およびU01HL134696(P.G.およびD.L.F.)からの資金提供によって支援されました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5mlポリスチレン丸底チューブ、セルストレーナーキャップ付きCorning352235
6ウェルポリスチレン組織培養皿Corning353046
AflII制限エンドヌクレアーゼニューイングランドバイオラボR0520
アガローVWRN605
DMEM/F12培地サーモフィッシャー11320033
dNTPsRoche11969064001
蛍光活性化セルソーター(FACS)装置
ゲル抽出キットMacherey-Nagel740609
Gibson Assembly KitNew England BiolabsE2611 gRNA_Cloning
VectorAddgene41824
LB 寒天プレート 50 μg/ml カナマイシン
リポフェクタミン ステム試薬サーモフィッシャー(STEM00001)
マトリゲル増殖因子還元型 (GFR)Corning354230
マウス胚性線維芽細胞 (MEFs)
ヌクレオスピンゲル抽出および PCR クリーンアップキットMacherey-Nagel740609
眼窩振盪インキュベーター
pCas9_GFPベクターAddgene44719
PCRストリップチューブUSAScientific1402-2900
Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼおよび5倍;Phusion bufferNew England BiolabsM0530
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep KitInvitrogenK210011
Proteinase KQiagen Qiagen19133
StellarTM electrocompetent Escherichia coli cellsTakara636763
SOC mediumNew England BiolabsB9020S
TrypLE Express Enzymeサーモフィッシャー12605036
Y-27632 二塩酸塩/ROCK阻害剤(ROCKi)Tocris1254
ス

References

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  1. Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
  2. Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  3. Murry, C. E., Keller, G.

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CRISPR Cas9Human Pluripotent Stem CellsGene EditingIsogenic Cell LinesHeterozygous MutationsRepair TemplatesTransfection OptimizationColony PickingFluorescence Activated Cell SortingRestriction Enzyme Digestion

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