方法論記事

マウスにおける右心室系と低酸素誘発性肺動脈高血圧に対する侵襲的血行力学的評価

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DOI：

10.3791/60090

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2019年10月24日

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1Beijing Key Laboratory of Pre-clinical Research and Evaluation for Cardiovascular Implant Materials, State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Centre for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Laboratory Animal Center, Peking University, 3Center of Cardiac Surgery for Adults, State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Centre for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

この記事について

サマリー

ここでは、開胸手術アプローチを用いてマウスにおける右心室および肺動脈の侵襲的な形乱態評価を行うプロトコルを提示する。

要約

肺動脈性高血圧症(PAH)は慢性および重度の心肺疾患である。マウスは、この病気を模倣するために使用される一般的な動物モデルです。しかしながら、右心室圧(RVP)および肺動脈圧(PAP)の評価は、マウスにおいて技術的に困難なままである。RVPとPAPは、左右の心臓系の解剖学的な違いのために、左心室圧よりも測定が困難である。本論文では、健康マウスとPAHマウスを用いた安定した右心馬力測定法とその検証について述べた。この方法は、胸部開胸手術と機械的換気サポートに基づいています。それは閉じた胸のプロシージャと比較して複雑なプロシージャである。この手術には十分な訓練を受けた外科医が必要であるが、この手順の利点は、RVPとPAPパラメータの両方を同時に生成することができるので、PAHモデルの評価のための好ましい手順である。

概要

肺動脈性高血圧症(PAH)は、小さな肺動脈の細胞増殖および線維化によって引き起こされる肺動脈圧(PAP)および右心室圧(RVP)の上昇を伴う慢性および重度の心肺疾患である1.肺動脈カテーテルは、スワンガンツカテーテル2とも呼ばれ、RVPおよびPAPの臨床モニタリングで一般的に使用されている。さらに、無線PAP監視システムは、臨床的に3、4、5を使用されている。マウスの研究のための疾患を模倣するために、PAH6のヒト臨床症状をシミュレートするために低酸素環境が使用される。動物におけるPAPの評価では、大型動物はヒト被験者と同じ技術を用いて肺動脈カテーテルを介して比較的監視が容易であるが、ラットやマウスなどの小動物は体の大きさが小さいため評価が難しい。マウスにおける右心室系の運動力学的測定は、超小型サイズ1Frカテーテル7で可能である。マウスにおけるRVPおよびPAPを測定する方法は文献8、9で報告されているが、その方法論は詳細な説明を欠いている。RVPとPAPは、左右の心臓システムの解剖学的な違いのために、左心室圧よりも測定するのが難しいです。

同じマウスでPAPとRVPの両方のパラメータを取得するために、右心の快進測定のための開胸手術ベースのアプローチ、健康なPAHマウスとの検証、複雑な開胸中に人工データを生成しないようにする方法について説明します。手術。この技術は、十分に訓練された外科医によって行われるのが最善であるが、それは同じマウスでPAPおよびRVPを評価することができるという利点がある。

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プロトコル

動物プロトコルは、北京ユニオン医科大学、フワイ病院、中国医学アカデミー(NO.0000287)の制度的動物ケアと使用委員会によって審査され、承認されました。実験動物は、中国の動物福祉のガイドラインに従って収容され、供給されました。

注:8~12週齢の雄C57BLマウスは、12時間暗い/12時間の光サイクルを有する環境に収容された。PAHマウスを酸素濃度10%の下で4週間収容し、肺高血圧を誘発するために酸素制御低酸素室によって維持され、対照マウスを同一の条件下で室内空気(21%酸素)に収容した。RVPおよびPAP測定は、低酸素チャレンジの4週間の終わりに行った。

1. 術前準備

  1. 圧力トランスデューサカテーテル(サイズ:1Fr)を、血行力学実験の前に少なくとも30分間室温で0.9%生理食合いで浸漬します。
  2. フィルター2,2,2-トリブロモエタノール溶液を0.22μmフィルターで、4度冷蔵庫に保存します。
  3. 手術用手袋などの清掃された手術ツールや消耗品を準備します。
  4. カテーテル洗浄用消化酵素溶液10mLを10mL調製します。
  5. 圧力トランスデューサカテーテルを圧力ボリュームシステムに接続します。
  6. 各マウスの圧力測定を取得する前に、圧力トランスデューサを校正します。
    1. キャリブレーションノブを0 mmHgおよび25 mmHgにして、検証圧力信号をデータ集録ソフトウェアに送信し、ソフトウェアのキャリブレーション設定を設定します。
    2. ノブをトランスデューサに回し、バランスノブをベースラインゼロに調整します。
  7. 標準的なステレオ顕微鏡および外科の間の体温維持のための温度制御された小さい動物の外科テーブルを置く。
  8. 外科区域に十分な光を与えるためにマイクロサージャリーのための光の照明システムを設定する。

2. 胸部開胸手術とヘモ力学測定

  1. 腹腔内注射(i.p.)を介して2,2,2-トリブロモエタノールの250 mg/kgのマウスを麻酔する。必要に応じて、手順中に元の用量の1/3〜1/2で補足用量を繰り返します。
  2. 剃毛器と脱毛ローションを使用して胸と首の毛皮を取り除きます(図1 A、2A)。
  3. 手術中の体温(37°C)を維持するために、温度制御された小動物手術台の上のスフィンの位置に各マウスを固定します。
  4. 70%のエタナルで手術部位をきれいにします。
  5. 麻酔が効いたら、つま先ピンチを用いて十分な麻酔誘導を確認する。
  6. 首の皮膚に中線切開を行います(図1A)。
  7. 湾曲した鉗子を使用して骨格筋を解剖し、気管を露出させる(図1B,1C)。
  8. 修飾された22G静脈内鞘カテーテルを使用して口から挿管を行う。鉗子を使用してチューブが気管内にあることを確認します(図1D)。
  9. チューブを小さな動物用換気装置に接続します。人工呼吸器の取扱説明書10に従って、体重に基づいて呼吸数と潮位を計算して設定する。たとえば、説明した計算に基づいて、30 g マウスの呼吸数を 133/分、潮位量を 180 μL に設定します。
  10. テープを使用して換気のためのチューブを確保します。
  11. つま先ピンチを使用して適切な麻酔誘導を確認します。
  12. 胸の皮膚に中線切開を行い、焼灼ツールを使用して胸筋を慎重に解剖する(図2B,2C)。
  13. 中央にはさみを使って胸骨を切り、胸腔を露出させる(図2D)。
  14. 胸を開いた手術の間に焼灼器を使用して出血を防ぐ。
  15. 右心室をリトラクタで露出する (図 2E)。
  16. 生理線浸漬圧力トランスデューサカテーテルを25G針で作られた小さなトンネルを右心室に挿入し、RVPを測定します(図2Fおよび図3A,3C)。
  17. カテーテルケーブルを持ち、肺動脈と同軸的な方法で肺動脈弁を横切る。圧力波形を観察し、安定したPAP信号を得る(図3B、3D)。
  18. データ取得システムとソフトウェアを使用して、hemodynamicデータを記録します。
  19. 最終測定の後、2,2,2-トリブロモエタノール溶液の過剰投与量のi.p.注射を介してヒトにマウスを安楽死させる。
  20. 慎重に右の心臓システムからカテーテルを取り除き、1%の消化酵素溶液を含む1 mLシリンジに入れます。
  21. 蒸留水を使用してカテーテルを慎重に洗い流し、元の箱に保管してください。

3. ヘモダイナミクスのデータ解析

注:ヘモダイナミックデータは、解析ソフトウェア11(材料表)を使用して記録され、分析されました。

  1. マウスごとに、ノイズのない少なくとも 10 個の連続した安定したハートビート サイクルを選択して、各パラメータの RVP または PAP データの平均データを取得します。
  2. Studentのt検定を使用して、通常の空気制御群と低酸素群を比較します。注: p < 0.05 は統計的に有意と見なされました。データは平均±SDとして提示される。

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結果

圧力トランスデューサカテーテルを25G針で膨張したトンネルを介して右心室(図3A)に挿入し、典型的なRVP波形(図3C)を得た。カテーテルは絶えず調節され、ゆっくりと進み、肺動脈を通過しながら肺動脈と同じ軸に保たれた(図3B)。圧力センサが肺動脈に正常に挿入されると、特徴的な二分不調を有する典型的なPAP波形が現れた(図3D)。人工データの生成を避けるために、波形にノイズが発生したのか(図4)、カテーテルのゼロレベルがドリフトしたのかを観察しました(図5)。この場合、補正が行われ、ノイズのあるセグメントはデータ分析から除外されました。

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ディスカッション

気管挿管は、胸部開胸手術の最初の重要なステップです。ラットやマウスなどの小動物の気管挿管の古典的な方法は、気管にT字型の切開を行い、気管にY型気管チューブを直接挿入することを含む。実際には、この方法は操作中に簡単ではないことがわかります。Y型気管チューブは小動物には大きすぎて気管と角度を形成します。したがって、チューブを所定の場所に固定することは困難である。さらに、開胸手術中に誤って気道から挿管チューブが出ると、通常は機械的換気サポートが失われたために動物死に至る。そこで、皮膚に切開を行い、気管を露出させる筋肉層を分離して気管内挿管14の方法を改変し(図1C)、気管チューブを気道に直接挿入して、動物の口。気管内チューブの配置は、鉗子を使用して気管をクランプすることによって便利に確認することができる(図1D)。ガイド針を取り外し、シースカテーテルのみを使用した後、22Gの静脈内カテーテルが挿管チューブとして...

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開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

本研究は、北京連合医科大学大学院教育教育教育教育教育改革プロジェクト(10023-2016-002-03)、不和病院青少年基金(2018-F09)、北京前臨床研究の鍵研究室長と心臓血管インプラント材料の評価 (2018-PT2-ZR05).

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2,2,2-トリブロモエタノールSigma-AldrichT48402-5G麻酔用
動物温度調節器Physitemp Instruments, Inc.TCAT-2LV温度制御用
解剖鉗子ファインサイエンスツールズ株式会社11274-20手術用
ジェミニ焼灼システムジェミニGEM 5917手術用
静脈カテーテル (22G)BD 血管カテーテル381123挿管用
LabChart 7.3ADInstrumentsデータ分析用
光照明システムオリンパス手術用
Mikro-Tip カテーテルミラー・インスツルメンツ、テキサス州ヒューストンSPR-1000圧力測定用
ミラー圧力-ボリュームシステムミラーインスツルメンツ、ヒューストン、テキサス州MVPS-300圧力測定用
O2コントローラーと低酸素チャンバーBiospherixProOx 110慢性低酸素症用
PowerLab データ収集システムADInstrumentsPowerLab 16/30データ記録
用 はさみファインサイエンスツールズ株式会社14084-08手術用
小動物用人工呼吸器ハーバード製装置ベント 845手術用
実体顕微鏡オリンパスSZ61手術用
手術テープ3M手術用
Terg-a-zyme 酵素Sigma-AldrichZ273287-1EAカテーテル洗浄用
ミニ

参考文献

  1. Humbert, M., et al. Advances in therapeutic interventions for patients with pulmonary arterial hypertension. Circulation. 130 (24), 2189-2208 (2014).
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  11. LabChart. , Available from: https://www.adinstruments.com/products/labchart?creative=290739105773_keyword=labchart_matchtype=e_network=g_device=_gclid=CjwKCAjwxrzoBRBBEiwAbtX1n42I2S06KmccVncUHkmExU8KKOXXREyzx8bvTrxYMSze-ooE0atcbRoCliwQAvD_BwE (2019).
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