我々は、単一のコルチコストリアタールグルタミン酸シナプスにおけるグルタミン酸放出とクリアランスのバランスを、成体マウスからの急性スライスにおける評価するプロトコルを提示する。このプロトコルは、グルタミン酸検出用の蛍光センサ iGluu、信号取得用のsCMOSカメラ、焦点レーザー照明装置を使用します。
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この記事について
サマリー
要約
シナプスは、互いに独立して動作する高度に区画化された機能ユニットです。ハンチントン病(HD)および他の神経変性疾患では、グルタミン酸クリアランスの不十分さと結果として生じる流出および流出効果のために、この独立性が損なわれる可能性がある。シナプス前の末端および/または樹状脊椎の変わった占星術のカバレッジ、ならびにグルタミン酸放出部位におけるグルタミン酸輸送体の減少サイズは、疾患の病因に関与しており、その結果、異症/高キネジーの症状が生じる。しかし、HDにおけるグルタミン酸シナプスの機能障害につながるメカニズムはよく理解されていない。シナプスイメージングの改善と応用により、動きの開始を妨げるメカニズムに新たな光を当てるデータを得ました。ここでは、新しい遺伝子でコード化された超高速グルタミン酸センサーiGluu、広視野光学、科学CMOS(sCMOS)カメラ、473 nmレーザー、およびレーザー測位システムを使用して、適切な健康または病気の疾患の年齢から急性の皮質コストリアタールシナプスの状態を評価することによって、単一シナプス分解能を達成するための比較的安価なアプローチの原理要素を説明する。グルタミン酸過渡は、単一または複数のピクセルから構築され、i)グルタミン酸濃度の最大上昇に基づいてi)グルタミン酸放出が活性領域とiiの隣にあるグルタミン酸濃度[Glu]の時間定数(TauD)に反映されるように構築された[Glu]。短期可塑性の安静ブブトンサイズと対照パターンの違いは、子宮内脳症(IT)または錐管(PT)経路に属するコルチコストリアタール末端の同定の基準として役立った。これらの方法を用いて、症状のあるHDマウスではPT型コルチコストリアタールシナプスの40%がグルタミン酸クリアランスが不十分であることを発見し、これらのシナプスが興奮性損傷の危険にさらされる可能性があることを示唆した。この結果は、虚血性表現型を有するハンチントンマウスにおける機能不全シナプスのバイオマーカーとしてのTauDの有用性を強調した。
概要
「単一接続」に属する各シナプス末端の相対的な影響(すなわち、2つの神経細胞間の接続)は、典型的には、心内ナプティックニューロン11,22の初期セグメントに対するその影響によって評価される。ポストナプティクスニューロンからの体細胞および/または樹状記録は、最も一般的であり、これまで、トップダウンまたは垂直の視点33、4、54,5の下で情報処理を明確にする最も生産的な手段でもあります。しかし、それらの離散領域と(げっ歯類)非重なり合う領域を持つアストロサイトの存在,は、シナプス部位6、7、8、9、107における信号交換、統合9,10および同期6の局所メカニズムに基づく水平視点を寄与し得る。8
アストログリアが遊ぶことが知られているので、一般的に、神経変性疾患....
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プロトコル
すべての作業は、動物実験のためのEU指令2010/63/EUに従って行われており、ベルリン健康保護技術安全局(G0233/14およびG0218/17)に登録されました。
注:Q175ワイルドタイプ(WT)とヘテロ接合体(HET)からの録音は、任意の年齢と性別で行うことができます。ここでは、51〜76週の年齢で男性と女性を研究しました。
1. コルティコストリアタール軸索における発現用グルタミン酸センサーiGlu uの注入
- ピペットプーラー(ワンステップモード)を使用して、ウイルスの注入用のホウケイ酸ガラスピペットを準備します。引っ張った後、ピペットを手動で破って30〜50 μmの先端直径を得る。
- ウイルス AAV9-CaMKIIa.iGluuを保存します。WPRE-hGH (7.5 x 1013 13gc/mL) で -80 °Cで 10 μL アリコート.ウイルス産生後すぐに注射を行う場合(6ヶ月以内)、5°Cに保つ。手術前にバイアルを取り出し、室温で維持してください。
- ガラスピペットを充填し、すべての気泡を削除します。
- 87.5 mg/kg ケタミンおよび 12.5 mg/kg キシラジンを含む溶液の腹腔内注射で動物を麻....
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結果
2種類のコルチコストリアタール酸筋性静脈瘤の同定
IT および PT の afferent は、それぞれレイヤ 2/3 と 5 に由来し、イプシラショナルおよび逆側 (IT 端末のみ) 線条体に差異的な影響と終了パターンを示します。運動の開始の間に観察される反復的な活性化条件下でのグルタミン酸放出およびクリアランスの特性についてはまだほとんど知られていないが、それぞれのグルタミン酸放出静脈瘤がサイズ22において異なることは十分に文書化されている。サイズ基準を適用すると、IT端末とPT端末が短期可塑性24の対照的な形態を示すことが分かった。50ミリ秒の刺激間隔で、より小さいIT端末は対パルスうつ病(PPD)を起こしやすいが、より大きなPT端末は対パルス促進を示した。この差は、より短い間隔(20ms)および一連の6パルスにわたっても観察された。図3および図6は、生理学的Ca2+/.......
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ディスカッション
実験は、シナプス依存性と神経変性の過程におけるシナプスの損失の可能性という一般的な関心の問題に関するものであり、我々は、老化した(>1年)マウスからの急性脳切片の影響を受けたシナプスを同定するための新しいアプローチを記述する。最近導入されたグルタミン酸センサiGluuの改善された運動特性を利用して、シナプスグルタミン酸放出と取り込みとの関係を以前は不可能であった方法で照らす。
グル,タミン酸クリアランスがシナプスの機能と維持に及ぼす影響はあまりよく解明されていないが、グルタミン酸誘発性興奮毒性がニューロンの喪失およびシナプス剪定を引き起こす可能性があるという仮説は、てんかん、脳卒中および神経変性疾患38、39、40、41に関するほぼすべての関連レビューで38,39言及されている。40,41しかし、利用可能な.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、CHDI(A-12467)、ドイツ研究財団(Exc 257/1およびDFGプロジェクトID 327654276 - SFB 1315)、シャリテの壁内研究基金によって支援されました。K.テレク、セントジョージズ、ロンドン大学、N.ヘラッサ(リバプール大学)に感謝します。uD.ベタンスとA.シェーンヘルは優れた技術支援を提供しました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ステレオマイクロソープ | WPI | PZMIII | 精密ステレオズーム双眼顕微鏡 |
| 立体視鏡 | Stoelting | 51500D | デジタルラボ 新標準 定位固定装置 |
| 高速ドリル装置 | Stoelting | 514439V | Foredom K1070 クロモターキット |
| インジェクションシステム | Stoelting | 53311 | 五等式脳定位固定装置インジェクター (QSI) |
| ハミルトンシリンジ5&マイクロ;l | ハミルトン | 87930 | 75RN Syr (26s/51/2) |
| レーザー位置決めシステム | Rapp OptoElectronic | UGA-40 | UGA-40 |
| iGluu 励起用青色レーザー | Rapp OptoElectronic | DL-473-020-S | 473 nm レーザー |
| ダイクロイック ミラー 473 nm | Rapp OptoElectronic | ROE TB-355-405-473 | ダイクロイック |
| 1P 直立顕微鏡 | カール・ツァイス | 000000-1066-600 | Axioskop 2 FS Plus |
| 対物レンズ 63x/1.0 | Carl Zeiss | 421480-9900 | W Plan-Apochromat |
| 4x 対物レンズ | Carl Zeiss | 44-00-20 | Achroplan 4x/0,10 |
| iGluu | Omega 光学 | XF2030 | |
| 用ダイ | XF3086 | ||
| ダイクロイックミラー | Omega 光学 | ||
| 自家蛍光微量用蛍光フィルター | オメガオプティカル | QMAX EM600-650 | |
| sCMOS カメラ | Andor | ZYLA4.2PCL10 | ZYLA 4.2MP Plus |
| Acquisition ソフトウェア | Andor | 4.30.30034.0 | Solis |
| AD/DA コンバータ | HEKA Elektronik | 895035 | InstruTECH LIH8+8 |
| 取得ソフトウェア | HEKA Elektronik | 895153 | TIDA5.25 |
| 電極位置決めシステム | サッターインスツルメント | MPC-200 | マイクロマニピュレーター |
| 電気刺激装置 | シャリテ工房 | STIM-26 | |
| スライカ | VT1200 S | バイブロトーム | |
| ブラウン/フレーミングタイププーラー | サッター | Instr SU-P1000 | P-1000 |
| インジェクションピペット用ガラス管 | WPI | 1B100F3 | |
| 刺激用ガラス管ピペット | WPI | R100-F3 | |
| テトロドトキシン | Abcam | ab120054 | TTX |
| iGluu プラスミド | Addgene | 106122 | pCI-syn-iGluu |
| Q175 マウス | Jackson Lab | 27410 | Z-Q175-KI |
参考文献
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
- Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014)....
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