このプロトコルの目的は、免疫蛍光、転写などの異なる分析システムで対処することができる腫瘍バルク状環境における癌関連線維芽細胞(CAF)の分化を研究するために、インビトロモデルで3Dを確立することです。分析および生命細胞のイメージ投射。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
インビトロ研究のための理想的なモデルを定義することは、主に細胞の分化などの生理学的プロセスを研究する場合に不可欠です。腫瘍間質では、宿主線維芽細胞は癌細胞によって刺激され分化する。したがって、それらは腫瘍微小環境に寄与し、腫瘍の進行を支持する表現型を獲得する。このスフェロイドモデルを用いて、このような3Dインビトロモデルシステムを設定し、この分化過程におけるラミニン-332とその受容体インテグリンα3β1の役割を解析した。このスフェロイドモデルシステムは、腫瘍微小環境条件をより正確な方法で再現するだけでなく、細胞内および細胞外の免疫蛍光染色などの異なる下流研究を可能にするので、非常に汎用性の高いモデルです。マーカー、ならびに沈着した細胞外マトリックスタンパク質。さらに、qPCRによる転写解析、フローサイトメトリーおよび細胞侵襲は、このモデルで研究することができる。ここでは、CAFのインテグリンα3β1およびその異位堆積リガンド、ラミニン-332の役割を評価するスフェロイドモデルのプロトコルを、分化および膵臓癌細胞の侵入を支持する。
概要
腫瘍微小環境は非常に複雑なニッチであり、腫瘍細胞1の維持および進行にとって非常に重要である。これは、癌細胞だけでなく、間質線維芽細胞によっても形成されます。腫瘍細胞は、正常組織2の間質と特異的かつ異なる間質に囲まれている。ラミニン-332は、膵臓腺癌3のような異なる腫瘍の間質で異なる腫瘍の間質で異なる細胞外マトリックスタンパク質を発現する。また、ECMの生化学的組成物および剛性および張力などの生体的性質も、腫瘍バルク4内で変化する。この腫瘍間質、または「反応性間質」は、隣接する癌細胞への線維芽細胞の適応および腫瘍進行のための有利で支持的な環境を開発する他の非常に重要なプレーヤーの募集によって引き起こされる。間質線維芽細胞の分化は癌関連線維芽細胞(CAF)をもたらす。これらの細胞は、α平滑筋アクチン(αSMA)5または神経/グリア抗原2(NG2)6などの異なるマーカーを用いて同定することができる。
腫瘍微小環境(TME)をCAFで要約するのに最も適したインビトロモデルを選択することは困難である。このようなモデルシステムについては、費用対効果が高く再現可能な方法でTMEの生理的パラメータを模倣する方法を考慮する必要があります。TME内では、異なる細胞タイプの増殖、分化、移行、および侵入などの異なるプロセスが発生します。これらの細胞プロセスは、異なる方法で個別に行うことができる。しかし、実験条件は、下層の剛性がCAF分化プロセスに影響を与えるので、腫瘍間質ECMとの細胞相互作用を考慮しなければならない。R.G.ウェルズは、細胞の行動に対するマトリックス剛性の影響についてコメントし、インビトロ培養細胞で観察された細胞骨格組織および分化状態が動脈実7である可能性があることを強調した。機械的緊張5、7を含むCAFの分化に異なる刺激が関与しているようです。これを回避するために、2D軟質基板は、硬い培養皿プラスチックの問題を回避するので、分化研究のためのアプローチが可能である可能性があります。線維芽細胞を成長させることができる柔らかい2D表面は、コラーゲン-Iコーティングポリアクリルアミドゲルであり、それによってゲル剛性は、ポリアクリルアミドおよびゲル架材の濃度によって操作することができる。αSMAリッチストレス繊維の接着および形成は、ゲル剛性8と共に線維芽細胞において増強される。これらの結果は、より多くの生理的なインビトロ分化モデルのための柔らかい基板足場の重要性を強調する。しかし、私たちの手の中では、これらのゲルの実験的再現性とイメージングは困難でした。これらの欠点を克服するために、分化と侵入研究のための3Dスフェロイドモデル用の2Dソフト基板システムを変更しました。このモデルは、より臨床的に関連し、インビトロオルガノイドと同様に、生体内細胞相互作用、ECM産生および沈着、ならびに細胞挙動9における要約を行う。
スフェロイドは、細胞が付着する基板を欠いているときに形成される。細胞が粘着面なしで放置されると、それらは多かれ少なかれ球状構造を形成するために凝集する。スフェロイドが1種類の細胞で構成されている場合、それらはホモスフェロイドと呼ばれています。2つ以上の異なる細胞タイプで構成される場合、それらはヘテロスフェロイドを形成する。
スフェロイド調製のための異なる方法の中で、我々は非付着ラウンドボトム96ウェルプレートを使用してプロトコルを実行します。コストに関しては非常に効果的です。ここでは、線維芽細胞、CAFまたはCAFの両方のホモスペロイドを生成し、CAFまたはインテグリンα3 KO CAFおよび膵管癌細胞(AsPC-IおよびPANC-I)の分化プロセスとヘテロスペロイドを調べるために、インテグリンα3サブユニットを欠いている。周囲のマトリックスに。
これらの研究の目的は、ヒト膵臓癌生検から単離された一次CAFを使用することにあった。しかしながら、細胞を得るための生検は乏しく、このため、これらの研究で使用されるCAFはHTERTを含むレンチウイルスを用いて不死化されている。それらはiCAFと呼ばれ、その正常な対応する原発性ヒト膵臓線維芽細胞はiNFと呼ばれる。ヒト膵線維芽細胞および膵管癌細胞、AsPC-IおよびPANC-Iが市販されている。
このプロトコルは、CAF分化プロセスにおけるラミニン-332-インテグリン相互作用の効果を研究するために使用された。この相互作用およびその機能の特異性を証明するために、阻害剤化合物が用された:BM2、ラミニニン結合部位を遮断するモノクローナル抗体であるラミニニン-332α3鎖10、またはレビン1、またはレビン1、およびスネーク毒由来化合物ラミニン結合インテグリンα3β1、α6β1およびα7β111、12.
侵入アッセイでは、細胞はmCherry(iCAFおよびインテグリンα3 KO iCAF)またはGFP(AsPC-IおよびPANC-I)をコードするcDNAを含むレンチウイルスを用いて、ヘテロスフェロイド中の異なる細胞型を区別するために変換された。それらを不死化し、蛍光タンパク質(mCherryおよびGFP)発現でそれらを標識する細胞の伝達は、以前の研究13で説明されています。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
1. 細胞マトリックス相互作用の異なるTGF-β1阻害化合物を用いた線維芽細胞/CAF分化のためのインビトロモデルとしての3Dスフェロイド
- 6mg/mLメチルセルロース溶液の1部および細胞培養培地の3部を混合し、MEMは熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンの1%を補充し、スフェロイド形成溶液を得た。
- 新たに解凍された不死化された正常線維芽細胞(iNF)、不死化CAF(iCAF)またはインテグリンα3β1 KO iCAF(通路25まで)をスフェロイド形成溶液中で再中断する。1つの96ウェルプレートを調製する場合は、過剰なスフェロイド形成溶液を調製し、10mLを加え、75,000個の細胞を加え、各スフェロイドが750個の細胞によって構成され、プレートの各ウェルごとに100μLが分布することを念頭に置く。
- サイトカインまたはインテグリン阻害剤が研究に含まれている場合は、それらの形成中にスフェロイドにそれらを埋め込むために、細胞懸濁液にこれらの化合物を追加します。iNFは、分化をトリガするためにTGF-β1の10 ng/mLで刺激されることに注意してください。必要に応じて、20 μg/mL BM2 または 10 μg/mL のレビン 1 などの TGF-β1 と共に阻害剤化合物を追加します。
- CAFホモスペロイドは、すでに分化されているので、TGF-β1刺激なしで同じ方法で調製する。任意の化合物を添加することなく、インテグリンα3 KO CAFホモスペロイドを調出す。
- 各ウェルに溶液の100μLを加えて丸底96マルチウェルプレート上にスフェロイド形成溶液を分配する。スフェロイド溶液が井戸に分布するたびに、上下にピペッティングしてよく混ぜます。
- 24時間の細胞培養インキュベーターにプレートを置き、各ウェルに1つのスフェロイドを形成できるようにします。
- 約24時間後にスフェロイドを収集し、異なる下流の目的のためにそれらを使用する:免疫蛍光染色、リアルタイム(RT)q-PCRおよびフローサイトメトリー。スフェロイド内のECMタンパク質の沈着を含む細胞内および細胞外抗原の発現を検出するには、免疫蛍光染色を使用する。スフェロイドを単一細胞に崩壊させた後、フローサイトメトリーにより膜アンカー受容体を定量する。遺伝子活性化と転写変化を検出するには、スフェロイド細胞から単離されたmRNAのRT q-PCRを使用します。
2. スフェロイドの免疫蛍光染色
- 約24時間後に、分析する実験条件またはタンパク質ごとに1本の1.5mL反応管にスフェロイドを集める。例えば、TGF-β1で刺激したiNFのスフェロイドを、処理されなかった対照iNFとは異なるチューブに入れます。せん断力が強すぎるためにスフェロイドが破裂しないように、ピペット先端の端を切ってオリフィスを拡大します。1つの反応管に少なくとも5〜10のスフェロイドを含め、反復を可能にし、洗浄工程中に起こりうる損失を考慮に入れる。
- 1,000 x gで約30-60 sのためのベンチトップ遠心分離機でスフェロイドを遠心分離します。ペレット化されたスフェロイドを邪魔することなく、ピペッティングによってメチルセルロース含有上清を慎重に取り除きます。
- 1x PBSの50 μLで洗浄します。遠心分離ステップを繰り返し、2.2 に記載されているように、ピペッティングによって PBS を慎重に取り外します。
- 染色するタンパク質に応じて、室温で20分間PBSで50 μLの4%パラホルムアルデヒドを固定し(αSMA、NG2およびインテグリンα3β1)、または-20°Cで10分間50μLのメタノールを10分間(ラミニン-332サブユニットの場合)に固定します。
- 手順 2.2-2.3 で説明されているように、洗浄手順を繰り返します。
- 室温で4分間PBSで0.1%のトリトン-Xで細胞を透過化します。
- 手順2.2-2.3で説明されているように、洗浄手順を3回繰り返します。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
この実験計画の結果は、マーティンス・カバコら13に掲載されており、これらの実験から得られた結論をさらに読むことをお勧めします。
図1は、免疫蛍光スフェロイドの代表的な画像で、不滅正常線維芽細胞と不死化CAF(図1A)の両方のインテグリンα3サブユニットの免疫染色と免疫蛍光を示す。qPCRによるインテグリンα3サブユニット遺伝子の定量化(図1B)および転写レベル(図1C)。この結果のパネルは、インテグリンα3が通常の対応と比較して、iCAFでアップ規制であることを示しています。これは、インテグリンα3β1が膵繊維芽細胞分化のマーカーと考えることができることを証明した。これ...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
CAFの分化を研究するための適切なインビトロモデルを開発することは困難な作業です。異なるアプローチを採用した後、我々は、3Dスフェロイドモデルは、不死化されたCAFを持つ膵癌細胞間の相互作用を研究することができる、より実用的で生理学的および臨床的に関連するモデルであると結論付けた。このモデルは、少なくとも短期的な培養条件(最大48時間)において、細胞培養プラスチックの剛性などの動脈性ストレスに起因する線維芽細胞の自発的分化を防止した。これらの研究で用いられるスフェロイドの正確な剛性は測定されなかったが、伊藤らはロボット統合マイクロ流体チップ22を用いてヒト臍静脈内皮細胞および間葉系幹細胞ヘテロスフェロイドの剛性を評価した。ヘテロスフェロイドの平均剛性指数を、組み立て後1、3日目に測定した。スフェロイドの大きさは異なり、MSCは集約容量を増加させたようで、時間の経過とともにサイズが減少した(135.5 μmから99.8 μm)21、22。その結果、スフェロイドの剛性も 5.0...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は利益相反を宣言しない。この資料は著者の見解のみを反映し、欧州連合は、そこに含まれる情報を使用する可能性のあるいかなる使用についても責任を負いません。
謝辞
我々は、BM2とlebein-1を準備するバーバラ・シェディングの助けを認める。私たちは、スフェロイドアッセイにおける彼女の専門知識を共有するためのアグネス・ノエルを認めます。我々は、S2条件下でレンチウイルストランスフェクションを処理する彼らの助けにソーニャ・シェルハースとマイケル・シェーファーズに感謝します。我々は、膵臓癌組織からCAFを準備するサビーヌ・フォン・リューデンの支援を認める。
これらの結果につながる研究は、欧州連合の第7フレームワークプログラムFP7/2007-2013/REA交付協定n◦(316610)のJ.A.E.に基づき、人民プログラム(マリー・キュリー・アクション)から資金を受け取りました。さらに、J.A.E.とA.C.M.C.は、セル・イン・モーション・クラスター・オブ・エクセレンス(EXC 1003-CiM)内のドイツ・フォルシュチュンゲインシャフト(DFG)によって財政的に支援されました。このプロジェクトは、ヴィルヘルム・サンダー・スティフトゥン(助成金:2016.113.1からJ.A.E.)によっても支援されました。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩 (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3サブユニットマウス(モノクローナル) | 自家製 | ||
| A3IIF5抗-&α;3 インテグリンサブユニット マウス (モノクローナル) | Courtesy by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone SIGMA-ALDRICH | 32201 | ||
| Albumin Fraction V - BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 ヤギ(ポリクローナル)抗マウス | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 ヤギ(ポリクローナル)ウサギ | Invitrogen | A11034 | |
| アンチラミニン&ガンマ;2サブユニットマウス(モノクローナル) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | スプラウト |
| BM2アンチラミニン&アルファ;3 サブユニット マウス (モノクローナル) | Courtesy by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| 塩化カルシウム (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, ラットテール | Gibco | A10483-01 | |
| 共焦点顕微鏡 | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| ゲル化マトリックス | ThermoFisher Scientific | A1413202 | マトリゲル、ゲルトレックス |
| ヤギ IgG、アイソタイプ | DAKO | X 0907 | |
| 馬血清 | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| ヒト原発性膵臓線維芽細胞 | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| インキュベーター | ヘレウス | B6060 | |
| ラミニン-332 | バイオラミナ | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| マイクロプレート、96ウェル、U底 | Greiner Bio-One | 650101 | |
| 顕微鏡スライド | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| マルチアクスル回転ミキサー | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | ヨルグ教授よりご好評をいただきました。ハイアールの研究室 | |
| パラホルムアルデヒド | Riedel-de Haën | 16005 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect 逆転写キット | Qiagen | 205310 | |
| ラット IgG, アイソタイプ | Invitrogen | 10700 | |
| 反応チューブ, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| リアルタイム PCR サイクラー | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | グルコースを 4.5 g (0.2 um フィルター) と 1% ピルビン酸ナトリウムに加え |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | サイエンティフィックインダストリー | ズボルテックス-Genie 2 | |
| μ-スライド血管新生、コーティングされていない | 同上 | 81501 |
参考文献
- Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
- Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
- Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355(2017).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
- Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
- Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
- Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
- Martins Cavaco,, C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14(2019).
- Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
- Goldberg, M. T., Han, Y. -P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
- Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
- Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
- Huang, C. -C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
- Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
- Makizumi, R., Yang, W. -L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
- Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
- Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
- Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
- Lin, R. -Z., Lin, R. -Z., Chang, H. -Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
