ホルマリン固定組織からのリサウイルス抗原検出のための免疫組織化学試験

サマリー

ここでは、ホルマリン固定組織の代替診断試験として狂犬病ウイルス抗原の検出のための免疫組織化学試験プロトコルを紹介する。

要約

狂犬病の主要な診断モダリティの1つは、感染した組織サンプル中のウイルス性リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体(抗原)の検出である。直接蛍光抗体(DFA)試験または直接迅速な免疫組織化学検査(DRIT)は、抗原検出のために最も一般的に利用されるが、両方のテストは、抗体を使用して抗原検出前のスライド上の印象のために新鮮な組織および/または凍結組織を必要とする。サンプルをホルマリンで収集して固定する場合、いずれの試験も抗原検出に最適ではないが、パラフィンブロックおよび切除に埋め込んだ後に、通常の免疫検査(IHC)によって試験を行うことができる。このIHC法により、組織は抗狂犬病抗体で染色され、切片は脱パラフィン化され、抗原は部分タンパク質分解または他の方法によって取り出され、一次および二次抗体と共にインキュベートされる。抗原は、ホサビペルオキシダーゼ/アミノエチルカルバゾールを用いて染色され、光顕微鏡を用いた可視化のためにヘマトキシリンでカウンター染色される。特異的抗原検出に加えて、ホルマリン固定は、組織学的変化の決定、標本の貯蔵および輸送のための緩和された状態(周囲温度下)、遡及症例をテストする能力、および感染性物質の不活性化による生物学的安全性の向上などの他の利点を提供する。

概要

狂犬病は、リサウイルス属に属するRNAウイルスの負の感覚によって引き起こされる急性進行性脳炎^である。狂犬病ウイルス(RABV)による感染によって生じた全人類の死亡のほぼ99%は、属の型メンバーである、犬²によって伝染する。疑わしい動物の狂犬病診断は、脳組織³におけるゲノムRNA(リボヌクレオタンパク質複合体、RNP)と複合体中の抗原(主にウイルスコード型核タンパク質、Nタンパク質)の検出に依存する。直接蛍光抗体(DFA)検査による抗原検出は狂犬病診断⁴のゴールドスタンダードと考えられている。この方法は、新鮮または新鮮な凍結脳材料を利用して、スライド上のタッチ印象、アセトンでの固定、モノクローナルまたはポリクローナル抗体(mAbs/pAbs)と蛍光顕微鏡^法5で読み取られる市販の蛍光イソチオシアネート(FITC)を用いて染色する。DFA試験は、新鮮な脳組織における狂犬病抗原検出に対して、迅速、感受性、および特異的である。最近、直接迅速な免疫構造化学検査(DRIT)、修飾免疫体化学(IHC)技術は、DFAと同様の感受性を示すことが実証されたが、可視化⁶のための光顕微鏡の利点を提供する。DRITで使用される検出方法は、IHCに似ていますが、最初のステップで....

プロトコル

IHCプロトコルはホルマリン固定組織で実施されたが、RABVが存在する場合は不活性化するが、適切なバイオセーフティプロトコルに適切に従うべきである。すべてのバイオセーフティ手順は、適切な個人用保護具(PPE)を着用する、および¹²に記載されているワクチン接種要件を含む、微生物学および生物医学研究所(BMBL)第5版(https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm)におけるバイオセーフティに記載されている。さらに、有害化学物質(ホルマリン、AEC、キシレンなど)の適切な封じ込めと取り扱いが続く必要があります(例えば、ヒュームフード)。

1. 組織のホルマリン固定

1. 壊死¹³ の後に採取した3〜5mmの脳組織を10%リン酸緩衝ホルマリン溶液(1:20〜1:50組織/ホルマリン比)に24〜72時間置く。
   注意:ホルマリンは有毒な固定剤です。
2. おおよその組織重量(サイズ)、組織タイプ(脳領域)およびホルマリンの体積を記録する。研究所は、固定時間に記録を文書化し、維持することが重要です。
3. ホルマリン固定後および処理前に組織貯蔵を長くするために、70%エタノールに組織を入れる。

2. 組織処理

結果

図2 は、テストされた異なる脳組織における陽性および陰性対照サンプルの代表的なIHC染色結果を示す。 図2A,D,G は200xで陽性サンプルを表し、 図2B、E、H はそれぞれ400倍の倍率に相当します。 図 2A-C は 脳幹に対応します。 図2D-F は小脳細胞とプルキンイェ細胞に対応している。 そして図2G-Iは 海馬に対応している。 図2C,F,I .......

ディスカッション

症状の発症後の狂犬病の死亡率が高いため、RABV感染の疑いのある動物の診断は、適切な暴露後予防治療にとって極めて重要です。狂犬病の診断は、主にDFA、DRIT、および新鮮な組織または凍結組織を使用したPCRベースの技術に依存します。ホルマリン固定組織の検査では、IHC試験はRABV抗原の敏感かつ特異的な検出のための代替方法を提供します。ホルマリンに固定された組織は、架橋のような側鎖の改変によりタンパク質が安定化する一方、サンプルは抗原検出前に処理する必要がある。このプロトコルでは、エピトープをプロテアーゼによる部分タンパク質分解消化(例えばプロナーゼ)を介して回収し、RNP複合体への一次抗体の結合を可能にした。Nタンパク質に対して反応性mAbsはDFAおよびDRITにおいて主に依存しているが、Nタンパク質上の複数のエピトープに対して反応性を持つpAbsはIHC試験に好まれるであろう。さらに、反応性またはpAbsは、mAbsと比較して、異なるRABV変異体に対して、および非狂犬病リサウイルスに対して広くすることができる。

IHCテストの主な制限の1つは、プロトコルがいくつかの連続した.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3% 過酸化水素	Pharamacy ブランド		既製 3% H2O2
3-アミノ-9-エチルカルバゾール (AEC)	ミリポア シグマ	A6926
アセテート緩衝液 pH 5.2	Poly Scientific R&Dコーポレーション	s140
衝ホルマリン10%リン酸緩衝フィ	ッシャーサイエンティフィック	SF100-4	認定
カバースリップコーニング	フィッシャーサイエンティフィック	12-553-471	24 X 50 mm
エタノール190プルーフ	Pharmco-AAPER	111000190
エタノール200プルーフ	Pharmco-AAPER
ギルのヘマトキシリン製剤#2	Fisher Scientific	CS401-1D
HistoMark ビオチン-ストレプトアビジンペルオキシダーゼキット	セラケア	71-00-18	マウス一次抗体
ImmunoHistoMount	Millipore Sigma	i1161	封入剤
N,N, ジメチルホルムアミド GR	Fisher Scientific	D119
リン酸緩衝生理食塩水	HyClone	RR14440.01	01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 対物	レンズ Multiple vendors
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective	Multiple vendors
Pronase	Millipore Sigma	53702	Protease, Streptomyces griseus
>Scott's Tap Water	ポリサイエンティフィックR&Dコーポレーション	s1887
Tissue-Tek スライドステインセット	フィッシャーサイエンティフィック	50-294-72
TWEEN-80	Millipore Sigma	P1754
Xylene	Fisher Scientific	X3S-4	Histological Grade
Zeiss Axioplan 2 イメージング - 顕微鏡	複数のベンダー

緩 111000200