方法論記事

胚移植による変異ハプロイド肢を用いたキメラ・アクセロリトの生成

DOI：

10.3791/60156

⸱

2020年1月29日

 ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルのこの目標は、胚組織移植技術を用いてCas9変異型ドナー組織に由来するハプロイド前肢を有するキメラ軸アキロルトを産生することである。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

遺伝的技術と資源の成長セットは、研究者がアクドロtlsのようないくつかの種のサンショウウオの能力の分子起源を調べ、大人として手足全体を再生することを可能にする。ここでは、遺伝子機能と四肢再生の忠実度を調べるCas9-変異ハプロイド前肢を用いてキメラ軸索を生成する手法を概説します。我々は、インビトロ活性化によるハプロイド生成、CRISPR/Cas9突然変異誘発、および組織移植を含むいくつかの胚学的および遺伝的技術を組み合わせて、再生のモデル生物におけるハプロイド遺伝子スクリーニングのためのユニークなシステムを作り出す。この戦略は、四肢再生における遺伝子の機能解析に必要な動物、空間、時間の数を減らす。これにより、組織形成、組織形態形成、その他の重要な胚プロセスなど、他の重要なプロセスに必要な遺伝子の再生特異的機能の研究も可能になります。ここで説明する方法は、脊椎動物モデル系におけるハプロイド遺伝子スクリーニングを行うためのユニークなプラットフォームである。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

歴史的に、両生類における胚組織移植は、発生生物学と再生の基本的なメカニズムを探求するための重要な技術であった。サンショウウオの種であるアキソロトルは、怪我や切断後に手足や臓器などの組織や複雑な構造を再生する印象的な能力を持っています。同様に印象的に、それらは、拒絶反応なしに、胚、少年、および成人段階1、2、3で他の個体からの組織移植片を受け取ることができる。手足、尾、目、頭部などの全構造を産生する胚の領域、および神経外膜およびsomiteのようなより具体的な組織を、胚間で移植してキメラ動物1、2、4、5、6を産生することができる。ほぼ1世紀の間、このようなキメラ動物の研究は、再生、組織分化、サイズ制御、およびパターニング1、7、8に関する重要な洞察を提供してきました。

過去10年間で、組織再生の多数の転写研究は、サンショウウオ再生9、10、11、12、13の根底にある遺伝的プログラムに関する洞察を生み出した。これらの研究は、現在までに再生の文脈でほとんど特徴がない候補遺伝子の拡大リストに追加されました。CRISPR/Casなどの標的変異生成技術は、現在、そのような遺伝子の調査を可能にし、そのような遺伝的アプローチは、大規模なアキソロトルゲノム14、15、16の最近のシーケンシングおよび組み立てによって大きく促進される。

我々は、再生のメカニズムを解剖することを目的として、古典的な発生生物学と新しい遺伝技術を組み合わせた技術を開発することを模索した。axolotlsおよび他のサンショウウオのハプロイド胚を生成するための方法は、数十年のために確立されています17.これらの技術は、遺伝的モデル生物18としてサンショウウオの利点であることが長い間注目されてきたが、その後の遺伝学的研究はほとんどハプロイド動物を組み込んでいる。アキソロトルのインビトロ活性化を使用して、移植のための組織ドナーとして機能するハプロイド胚を産生する19.蛍光遺伝マーカーを持つ胚を用いて、ドナー組織からほぼ完全に導出される手足を生成するための信頼できる方法を考案しました(図1A)。これら2つの技術を組み合わせることで、ハプロイディに関連する後期胚性致死をバイパスし、完全に発達した移植されたハプロイド四肢の産生を可能にした(図1B、図1B'、および図2)。

移植前にハプロイド胚にCRISPR/Cas媒介変異を行い、変異型ハプロイド四肢を有するキメラ軸アキロリトを作り出すことで、特に四肢の発達と再生の文脈における遺伝子機能を調べる。これは潜在的に胚死性変異型から四肢の救助を可能にする。CRISPR/Casマイクロインジェクションは高度に変異した動物を生成することができるが、そのような動物は、通常、野生型対立遺伝子の保持度が高く、標的部位14、20で様々な異なる突然変異を有する。ハプロイド細胞におけるCRISPRベースの突然変異誘発は、単一の対立遺伝子喪失機能突然変異の浸透を増加させる。このため、ハプロイド細胞株におけるCRISPRベースのスクリーニングは、多くの細胞プロセス21、22、23の遺伝的基礎を調査するためにますます使用されている。CRISPRベースの系統トレースとハプロイド四肢芽移植プロトコルを組み合わせることで、ここで説明するアプローチは、生きている動物20のハプロイド遺伝的スクリーンのプラットフォームとして役立つ。

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プロトコル

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このプロトコルで使用される実験手順は、イェール大学の動物のケアと使用委員会(IACUC、2017-10557)によって承認され、脊椎動物の使用を規定するすべての連邦政策とガイドラインに従っていました。すべての動物実験は、イェール大学の施設でアンビストマメキシカーナム(axolotls)で行われました。

1. 胚の胚の生成

  1. 1つまたは2つのgfpの親24を使用して自然な交配を通して移植片の宿主として機能するGFP+二倍体胚を得る。
  2. 生きたてのジプロイド卵を集め、金属ふるいに入れます。
  3. 40%ホルトフリッターの溶液(20mM NaCl、0.2 mM KCl、0.8 mM NaHCO 3、0.2 mM CaCl2、4mM MgSO4、pHから7.4)で卵を十分に洗い出します。
  4. 新鮮な40%ホルトフレターの溶液に卵を入れ、12°Cで保管してください。
    注:2002胚は、ハプロイド胚の生成に移る前に常に得られるべきです。

2. ハプロイド胚発生

  1. 女性のゲーマートドナー製剤
    1. 48時間前にインビトロ活性化を行う前に、40%ホルトフリッターの溶液25に1 g/L HEPESバッファーMS-222に浸漬することにより、性的に成熟した白または白/RFP女性のアキソロトルを麻酔する。
    2. 動物が親指と人差し指の間に尾をしっかりと挟んで、浸漬の約30分後に完全に麻酔されていることを確認してください。完全に麻酔された動物は、いかなるピンチにも物理的に反応しません。
    3. 滅菌生理液中に10,000 U/mLを含むヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)の溶液を調製する。
    4. 30Gインスリンシリンジを使用して、脊髄との接触を避けるために、麻酔を受けた女性の後肢に筋管結ードーサルに0.15CC(1,500単位)を正中線に45°角で注入する。
    5. メスを新鮮な40%ホルトフレターの溶液に戻し、8-12 °Cの冷蔵庫に入れます。
    6. 48時間後、女性を室温に戻す。産卵用の表面として、彼女の容器にいくつかの石やプラスチックの植物を置きます。
      注:HCGを注射した女性は、卵を産む前に数時間空のゼリーケースを堆積させることがよくあります。
    7. メスが一貫して卵を産み始めた後、石やプラスチックの植物を取り除きます。
    8. メスが空のタンクに30分から1時間座るようにします。
      注:動物が卵を産むために材料を源泉徴収すると、卵母細胞の収集のより厳しい制御が可能になります。
  2. 男性のゲームコレクション
    1. 女性の産卵が停滞している間、ステップ2.1.1のように、精子提供者として機能する性的に成熟したGFP+男性のアキソロトルを麻酔する。
    2. 完全に麻酔を受けた男性を、虫除け顕微鏡の下の湿ったペーパータオルの上に背中に置きます。
    3. 実験者が右利きの場合は、P1000ピペットの先端を右手でクロアカの基部に置きます。
    4. 左手の左手の親指を骨盤に2〜3cmのロストラルに置きます。精子尿サンプルを洗い流すために後ろ足に向かって指を動かしながら、動物をそっと絞ります。
    5. クロアカから個々のマイクロ遠心チューブに洗い流された各々を収集します。このプロセスを繰り返して、6~10個のサンプルを収集します。
    6. ペトリ皿に各サンプルからピペット5.0 μLを倒した顕微鏡を使用して精子の質を検査する。
      注:濃縮された精子サンプルは乳白色で、通常は5〜20μLの範囲であり、通常、いくつかのより高い体積精子尿サンプルが抽出された後に取り出されます。精子は、邪魔されずに放置すると、よりボリュームの多いサンプルでチューブの底部に集まります。健康な精子の濃縮されたサンプルは非常に運動性であり、その濃度が低下するにつれて活性を失う。健康な男性は、濃縮精子の50 μLまで産生することができる。
  3. 女性のゲームコレクション
    1. 正常な精子サンプルを得て確認した後、HCG注入された女性のアキソロトルを、ステップ2.1.1のように麻酔する。
    2. 彼女の背中に湿ったペーパータオルの上に完全に麻酔を受けた女性を置きます。
    3. 手順2.2.4と同様の手動きを使用して、女性から未受精卵を抽出します。
    4. 濡れた鉗子を使用して卵を収集し、10cmのシャーレに移します。採取から15分以内に照射された精子で卵子を治療する。
  4. 男性の球体調製とインビトロ活性化
    1. P10またはP20ピペットを使用して精子を上下にピペットし、塊を分解して均質な懸濁液を形成する。
    2. シャーレの蓋またはガラススライドに0.5μLの未希釈精子懸濁液を置き、反転顕微鏡で調べることによって、運動精子の割合を近似する。
    3. 0.1xマルクの修正リンガーのソリューション(MMR;材料のテーブル)20x精子希釈を行うために、このサンプルに.軽くピペットを上下に混ぜます。
    4. 逆顕微鏡では、シャーレまたはヘモサイトメーター上の20倍希釈アリコートの3つの1.0 μL滴で精子を数え、希釈されていない懸濁液の精子濃度を推定する。
    5. 原精子サンプルのアリコートを無菌0.1x MMRで約80,000体の運動細胞/mLに希釈して、照射のために精子を調製する。
    6. 過去15分以内に得られた卵の数を数え、卵1個あたりステップ2.4.5からシャーレに希釈したての精子の0.5μLを加える。ピペットチップを使用して、この懸濁液を1mmの厚い層に広げます。
    7. プラスチックリフトを使用して、254 nm架橋機の球根からサンプル4cmを置きます。800,000 uJ/mm2を有する試料を照射することにより、精子を遺伝的に不活性化する。
    8. P10ピペットを使用して、未受精卵に懸濁液をピペットし、照射された精子の0.25〜0.5 μLで各卵子をコーティングする。卵を室温で30分間座らします。
    9. 30分後、卵を0.1x MMRで満たします。すぐに8-10 °Cのインキュベーターに卵を入れ、翌日注射をするか、または7時間以内に注射用18°Cに入れます(hpa)。
    10. 水和後に鋭い鉗子を30分使用して脱ゼリーハプロイド。すぐに注射のために8-10 °Cのインキュベーターに卵を置くか、同じ日に注射のための18 °Cで.

3. ハプロイド・ムタジェネシスとメンテナンス

  1. CRISPR/Cas9マイクロインジェクション
    1. CRISPRscan を使用して sgRNA を設計し、26,27を合成します。
    2. 多重変異の場合は、5つのsgRNA(各sgRNAに対して10 ng/μL)とCas9タンパク質(1μg/μL)のストックを準備します。この株の100倍希釈(sgRNAあたり0.1ng/μL、10 ng/μL Cas9)を注入のために準備します。単一遺伝子の場合、高変異頻度変異誘発は、前に概説したプロトコルに従う28.
    3. 18°Cで保存した場合は単一細胞ステージ7 hpaでハプロイド胚を注入し、翌日2-8細胞ステージで胚を注入する(8-10°Cで保存されている場合)。
    4. 20%ポリ糖400で1.0x MMRに胚を移す。
    5. 単一細胞の場合、全質量0.5 pg/sgRNAと50 pg Cas9タンパク質を含む注射溶液の5 nL滴(卵の半径約1/4)を各胚に注入する。多細胞の場合は、複数の細胞に少量を注入することによって、この質量を分配します。
    6. 胚がポリ糖400で最低4時間、18°Cで最大18時間治癒するようにする。
  2. ハプロイド胚ハウジング
    1. 抗生物質抗血薬で胚を0.1x MMRに移す。
    2. 一部は死ぬか異常に発達するので、24ウェルプレートの個々の井戸に各胚を収容する。16-18 °Cに維持します。必要に応じて、より低い温度を使用して開発を延長することができます。
    3. 1日おきに新鮮な0.1x MMRで培地を抗生物質抗菌薬に交換してください。

4. ジプロイド宿主胚製剤

  1. ゼリーコーティング中の胚をステージ22〜26に達するまで12〜16°Cに保ちます。
  2. 移植の準備ができている胚を収集し、ふるい(4 mmメッシュサイズ)内に置き、40%ホルトフレターの溶液で穏やかにすすいでください。
  3. 最大2分間1.5%の漂白剤を含むフィルター滅菌0.1x MMRに胚を移し、漂白剤溶液中の胚を完全に水没させ、ゼリーコーティングが漂白剤溶液と完全に接触して微生物を殺すことを確実にするために穏やかに渦巻く胚に存在する。
  4. 2分後、胚を含む漂白剤溶液を、0.1x MMRのフィルター滅菌の同じ体積で希釈する。
  5. 漂白剤消毒されたふるい(4mmメッシュサイズ)に胚を穏やかに注ぎ、フィルター滅菌された0.1x MMRで胚を5回すすすります。
  6. 脱ゼリー用の抗生物質(ペニシリン100単位/mL、ストレプトマイシン100μg/μL、0.25 μg/mL、ゲンタマイシン25μg/mL)を含む0.1x MMRを含む無菌10cmシャーレに胚を入れる。
  7. 蛍光型の立体顕微鏡の下で、鋭い鉗子(先端の次元0.05 x 0.01 mm2)を使用してGFP+胚からゼリーコートとビテリン膜を取り除きます。
  8. GFP+胚を新しいシャーレに移します。ペトリ皿から転がされた液体の量を最小限に抑えます。
  9. 汚染物質を除去するために、GFP+宿主胚を無菌0.1x MMRで抗生物質で4〜6回リンスします。
  10. 移植する前に、きれいな胚を4°Cに一晩置きます。
    注:胚を冷却すると、中胚を内皮からより剛性でクリーンに分離できます。

5. ハプロイド-ジプロイドキメラ世代

  1. 外科用皿および媒体準備
    1. 無菌35mmの簡単なグリップペトリ皿に0.1x MMRでオートクレーブ2%アガロースを注ぐことによって、無菌外科手術皿を準備します。アガロースで半分中にシャーレを入ります。
    2. アガロースが冷えた後、無菌メスを使用して、アガロースの長さ25mmの傾斜トラフを切断して胚を所定の位置に保持します。
    3. 滅菌外科用培地(0.1x MMRに抗マイコプラズマ2.5μg/mL、アンホテリシンB 0.25μg/mL、シプロフロキサシン10.0μg/mL)を充填し、4°Cで冷蔵します。
  2. 胚移植手順
    1. 1つまたは2つのステージマッチGFP+二駆体宿主胚を持つ1つの健康なハプロイドドナーを、外科用培地を含むプレチル化手術皿のトラフの内側に置く(図3)。
      メモ:可能であれば、冷却段階(10°C以下)で手順を実行します。
    2. 2 つの超微細なオートクレーブされた鉗子(ストレートチップ、チップ寸法 0.05 x 0.02 mm2)を使用して、中心付近の四肢の芽を持つホストから外皮と中皮の層を取り除きます(図4)。
      注:長方形の組織移植領域は四肢の芽を包含し、第9のサマイトからギルバルジの後半分まで、約2mm、後方軸に沿って延びる。ドーソベントラル軸に沿って、移植された領域は、ジルバルジの腹側縁のすぐ向こう側に至るサミテを含め、約1.5mmに及ぶ。移植された領域は、下層内胚葉を乱すことなく、すべての側面プレート中胚葉およびサミテの側面半分を含む。詳細については、図 4および付属のビデオを参照してください。
    3. 宿主組織を取っておき、同じ方法を用いてハプロイドドナーから同等のサイズの組織シートを取り除く。
    4. ドナー胚の対応する領域にハプロイドドナー組織シートを置きます。
    5. 破砕された顕微鏡カバーガラスからオートクレーブされた長方形のガラス片で覆い、それをホスト胚の体にそっと押し込んで組織を固定します。
    6. ハプロイドドナー胚を反対側にひっくり返して、第2宿主胚の四肢芽を収穫する。手順 5.2.2 ~ 5.2.5 を繰り返します。
    7. 残りの余分な宿主組織とドナー胚を慎重に皿から取り除きます。
    8. ガラスの破片のアンカーを60~75分間所定の位置に置いて、20分ごとにグラスが滑り落ちていないかどうかを確認します。
    9. 組織移植片が完全に接着した後、鉗子を使用してゆっくりとガラスの破片アンカーを剥がします。
  3. キメラメンテナンス
    1. 生着した胚を新鮮な外科用培地に移し、治癒するために一晩8-12°Cに維持する。12または24ウェルプレートに生着した胚を個別に収容する。
    2. 36-48時間後、生着した胚を無菌0.1x MMR抗生物質抗血菌薬に移す。外科用培地の強い抗生物質は、3日後に生着した胚に毒性を引き起こす。
    3. 2~3日ごとに、新鮮な0.1x MMRと抗生物質でメディアを交換してください。
    4. 生着した胚を28°Cに保つ。
    5. 開発とケアの1〜2ヶ月後、ハプロイド四肢は、蛍光解剖顕微鏡を使用して移植片の純度についてスコアすることができる。
      注:手足に非神経または非血液宿主由来GFP組織の存在は、不純移植の指標であり、しばしば異常な四肢の発達に関連している。これらの動物は、さらなる分析から除外されるべきです。

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結果

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ハプロイド胚の発達は、その「ハプロイド症候群」表現型29によって二重胚と区別することができる。移植片段階では、ハプロイド胚は、卵黄プラグの前後軸および不完全な囲いに沿って減少した曲率を示す(図3A)。蛍光顕微鏡を使用して、ハプロイド胚が父親由来のGFP発現を確実に含まないようにすることができます(図3B)。

移植片がきれいである場合、GFP発現は主に、図2に見られるように、宿主の脊髄に由来する神経ネットワークである上腕神経叢に限定されるべきである。また、Punctate GFP発現は、感覚ニューロンおよび血液由来宿主細胞と思われる単一細胞にも存在し、発達中の四肢...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

当社のプロトコルには、操作技術者が一貫したグラフト処理結果を考慮する必要があるハプロイド-二倍体キメラを生成するためのいくつかの重要なステップがあります。

ハプロイド生成が失敗する最も可能性の高い理由は、インビトロ活性化条件が悪いためである。卵子を活性化するために、適切な量の運動精子を使用する必要があります。運動性を延長するために、精子サンプルは常に4°Cに維持されるべきである。精子サンプルを卵に適用する前に、逆顕微鏡を用いて精子の生存率を確認してください。完全に非運動性精子は使用しないでください, 濃度は80,000の運動細胞/mLに調整する必要があります.活性化ステップであまりにも多くの精子はまた、正常な卵の発達を防ぐことができます。卵子の表面に小さく暗いくぼみとして現れる精子ピットは、精子細胞が卵子を貫通し、通常精子を適用した後に20〜60分現れるという物理的徴候である。10個以上の精子ピットを持つ卵子は、正しく活性化しない場合があります。

未受精卵は、水の下に置かれた後15分以内に採取し、乾燥シャーレに入れ、精子塗布前...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者たちは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、アキソロトルコロニーの彼女の世話のためにキャサリン・ロバーツに感謝したいと思います。この研究のための資金は、コネチカット州イノベーション再生医療研究基金(15RMA-YALE-09および15-RMB-YALE-01)とユーニス・ケネディ・シュリバー国立小児保健人間開発研究所(個人博士研究員)によって提供されました。フェローシップF32HD086942)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
#55 Dumont ForcepsFine Science Tools11295-1Dumostar材料のみを使用(オートクレーブ可能)
Amphotericin BSigma AldrichA2942-20ML20 mL
Antibiotic-Antimycotic 100xThermo Fisher15240062
CiprofloxacinSigma Aldrich17850-5G-F
Ficoll 400 (polysucrose 400)bioworld40600032-3Ficoll 400
GentamicinSigma AldrichG1914-250MG
加熱/冷却インキュベーターRevSciRS-IF-233
ヒト絨毛性ゴナドトロピンMerkChorulon
Megascript T7 転写キットサーモフィッシャーAM133440 反応
Miroscope 冷却ステージBrook Industriesカスタムカスタム
NLS Cas9タンパク質PNAbioCP01-20050 & microの4バイアル;g タンパク質各
PlasmocinInvivogenant-mpt-1治療レベル
レシピ
1.0x マーク修飾リンゲル液 (MMR)0.1 M NaCl、2 mM KCl、1 mM MgSO4、2 mM CaCl2、0.1 mM EDTA、5 mM HEPES (pH 7.8)、 ph 7.4
40% ホルトフレッター溶液20 mM NaCl、0.2 mM KCl、0.8 mM NaHCO3、0.2 mM CaCl2、4 mM MgSO4、pH 7.4

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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