マウスアイへの生物学的製剤の送達のためのカプセル化された細胞技術

サマリー

ここで提示されるは、齧歯類の目への生物学的製剤の長期配信のための不死化細胞のマイクロカプセル化におけるポリマーとしてのアルギン酸塩の使用のためのプロトコルである。

要約

眼の後極の疾患の開発中の多くの現在の治療法は、生物学的製剤である。これらの薬物は頻繁に投与される必要があります, 典型的には、細胞内注射を介して.選択した生物学的製剤を発現するカプセル化細胞は、局所的なタンパク質産生および放出(例えば、長期薬物送達を介して)のためのツールになりつつある。また、カプセル化システムは、細胞への栄養素、廃棄物、および治療因子の拡散を可能にする透過性物質を利用します。これは、宿主免疫応答から細胞をマスキングする際に起こり、宿主免疫系の抑制の必要性を回避する。このプロトコルは、マイクロカプセル化法と結合したマイクロカプセル化におけるポリマーとしてのアルギン酸塩の使用をマイクロカプセル化技術として説明する。ARPE-19細胞は、ヒトRPE細胞株の自然発生により、その生涯機能により長期細胞療法実験に用いられており、ここではカプセルをカプセル化し、マウスの目に送達するために使用されています。この原稿は、細胞マイクロカプセル化、品質管理、および眼の送達のためのステップを要約する。

概要

細胞ベースの治療法は、医学に広く適用されている革命的な生物学的技術を表しています。最近では、神経変性疾患、眼疾患、がんの治療に応用に成功しています。細胞療法は、細胞置換から薬物送達まで幅広い分野をカバーしており、このプロトコルは後者に焦点を当てています。生分解性アルギン酸マイクロカプセル(MC)は、送達系としての有効性を示しており、生物医学分野で広く使用されつつある。アルギン酸は、その単純なゲル化プロセス、生分解性、優れた生体適合性、および生体内^,条件^{1、2、3、42}の下での¹安定性によるマイクロカプセル化に使用されてきた。^3,4

エレクトロスプレー法は、マイクロカプセル化技術として、アルギン酸(塩基高分子)およびポリ-lオルニチン(二次被覆ポリマー)を用いてペプチドおよびタンパク質をカプセル化するために有効に利用されている。両方のポリマーは自然に発見され、その生体適合性^55、6、76,のために使用^されます。しかし、細胞ベースの治療法における主な課題は、免疫抑制薬によって引き起こされる副作用を避けるために宿主免疫系の抑制である。アルギン酸マイクロカプセルの透過性は、細胞カプセル化に適した性質と考えられており、宿主免疫応答^88、9、109からそれらをマスキングしながら、細胞への栄養素、廃棄物、および治療因子の細胞への注入^を10可能にする。

眼では、封入された細胞は、網膜色素変性症または加齢黄斑変性症の治療のために、生物学的製剤(すなわち、成長因子^{11、12および12}成長因子アンタゴニスト¹³⁾の一定の送達のための臨床試験で使用されてきた。補体阻害剤¹⁴などの他の標的も現在、前臨床設定で検討されている。

プロトコル

すべての実験は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に従って行われ、サウスカロライナ医科大学動物ケアおよび使用委員会によってプロトコルID00399の下で承認されました。

1. 細胞培養

1. ヒト網膜色素上皮細胞(ARPE-19)細胞株を生成し、公表されたプロトコル^14,15,15に従って選択した遺伝子を安定的に発現させる。
2. 10%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベックコの修飾イーグル培地(DMEM)の細胞を維持する。
3. 細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュ₂ベートする。
4. 2~3日ごとに培地を交換してください。
5. 標準的な組織培養手順を使用して、70%〜80%の合流に達した後に細胞を通過させる。

2. 細胞カプセル化

1. アルギン酸ナトリウムと脱イオン(DI)水を混合し、2%w/vの最終濃度を、0.2 μmの滅菌シリンジフィルターで濾過して精製します。
2. トリプシン化、遠心分離、および10 mM HEPES緩衝生理的な生理液(pH=7.4)で洗浄することにより、アルギン酸溶液と混合する細胞を調製する。ヘモサイトメーターを使用して、細胞を数え、最終的な細胞濃度をアルギン酸溶液中の1 x¹⁰⁶に調整する。
   注:カプセル化プロセスは、殺菌されたフードの内部で実行する必要があります。
3. 3 mLシリンジにアルギン酸と細胞混合物の約300μLのアリコートをロードし、シリンジポンプに取り付けます。溶液は、30G鈍い先端針を通して、注射器先端の下の無菌50 mAkerビーカーに入れられた無菌ゲル化浴場に送り込み、針を浴び噴霧する距離にする。
4. ゲル化浴には、100mMの塩化カルシウム_(CaCl2)および0.5%w/vポリL-オルニチン(PLO)を含む10mM HEPES緩衝生理食塩水の40mLの体積が含まれています。PLOは、研究者のニーズに応じて省略または変更することができる二次ポリマーコーティングです。
5. 電圧と流量を調整し、60mm/hの流量でカプセル化プロセス中に一定に保ち、マイクロカプセルサイズを約150μmに保つため、6.0kV初期電圧を維持します。
6. 高電圧発生器針先端のアノードワイヤ(赤)のクリップを針に接続し、地面クリップ(黒)をゲル化槽に中途半端に沈んでいる銅線に接続します。アルギン酸+細胞混合物の1バッチ(1mL)は、カプセル化された細胞(約25,000マイクロカプセル)を調製するのに約30分かかります。
7. 細胞を含む形成されたマイクロカプセルを洗浄液(10 mM HEPES緩衝生理食物2、pH=7.4)で2回洗浄する。₂洗濯にはPBSを使用しないでください。
8. カプセル化した細胞を、37°Cおよび5%CO2で加湿インキュベーターに10%FBS補充DMEM培地でインキュベー₂トする。
   注:カプセル化プロセスの計測器を図 1に示します。

カプセル化が細胞の生存率に影響を及ぼさないという確認

1. 培地中に24時間カプセル化した細胞をインキュベートした後、500μL(〜30マイクロカプセル)の小さなサンプルを調製して染色します。
2. 洗浄液(1.5 mM CaCl2を含む10 mM HEPES緩衝生理食居)を使用してマイクロカプセル_2xを洗浄し、生死性のアッセイキットを使用して生死生存可能に染色します。
3. 2 μMと4 μMの最終濃度で、カルセインAM(アセトキシメチル)とエチジウムホモジマー-1の染色混合物をそれぞれ調製します。
4. カプセル化した細胞に染色混合物2 mLを加え、室温(RT)で暗闇の中で30〜45分間インキュベートします。
5. 慎重な吸引で、染色液を吸引し、マイクロカプセル2倍を洗浄液で洗浄する。蛍光顕微鏡システムを使用して、カプセル化された細胞を観察し、画像化します。
   注:カプセル化のドキュメントを図 2に示します。

4. カプセルが生物学的製剤の送達および送達に適したサイズであることを確認する

1. マウスアイのビトリアル内注射は、通常、2.5 μL ハミルトンシリンジに取り付けられた27G鈍チップ針(内径210 μm)で行われます。
2. 100~200μmのカプセルを生成し、無血清培地で希釈し、慎重にハミルトン注射器に引き上げます。PBSは、適当な車両ではないが、アルギン酸カプセルがPBSに溶解する。
3. カプセルを含む1μLの滴を顕微鏡スライドにゆっくりと排出し、直立した明視野顕微鏡を使用してその完全性を決定します。
4. 電圧と流量を適宜調整して、カプセルサイズ(ステップ2.3を参照)を調整します。小さいマイクロカプセルは、電圧を増加させ、流量をわずかに減少させることによって非線形の方法で生成される^8.私たちの手では、直径150μmのカプセルが最も適していることが判明しました。カプセルサイズの調整は、他のパラメータを変更しながらアルギン酸濃度を一定に保つことにも依存する。
5. 血清フリー培地中の適切なサイズのカプセル内の細胞の別々のセットを維持し、所望の生物学的製剤の分泌量を決定する。上清中の生物学的製剤の濃度を決定するために敏感なELISAまたはウェスタンブロッティングを使用してください。
6. 治療の既知のPK/PD(薬物動態/薬力学)に基づいて注入する必要があるカプセルの必要量を決定する。私たちの手の中で, 10 マウスの目あたりカプセルが最も効果的であることが判明しました。.

5. マウスの炎へのカプセル配信

1. 解剖顕微鏡を用いて、細胞内注射を行う。手順中に使用される外科用セットアップおよび材料については図 3を参照してください。リトラリトラ注射の詳細なプロトコルは、他の場所^{で見つけることができます 16}.
2. キシラジンおよびケタミン(20mg/kgおよび80mg/kg)または特定の施設の動物ケアおよび使用委員会によって承認された他の好ましい麻酔薬の腹腔内注射によってマウスを麻酔する。つま先ピンチ¹⁷を使用して麻酔の適切な深さを確認します。
3. マウスの瞳孔をフェニレフリンHCL(2.5%)で拡張するとアトロピン硫酸 (1%)の膜室の良好な可視性を可能にし、手順の間に水分補給それらを保つために目に潤滑剤の目のゲルを適用する。
4. ガイド穴として26G針を持つ手足の切り身を穿刺し、1)針が目とテーブルと45°の角度であることを確認し、2)ベベリング先端がレンズを穿刺しないように上向きに向けます。
5. 目視検査の下で45°の角度でハミルトン注射器に取り付けられた27G鈍チップ針を使用してカプセルを慎重に注入し、針でレンズに触れないようにしてください。レンズの損傷は白内障形成につながる。カプセルは、解剖顕微鏡を使用して、膜内で見える必要があります (図4A)。
6. 針の引き込み後、デキサメタゾンオフサルミック抗生物質軟膏に加えて、抗生物質軟膏ネオマイシンおよびポリマイシンB硫酸塩で注射部位を治療する。
7. ギョニオテールヒプロメロース脱乳眼液を塗布(2.5%)両方の目に角膜が回復期間中に乾燥するのを防ぐために。
8. 37°Cの加熱パッドにマウスを置き、完全に目が覚まるまで監視します。
9. カプセル化されたARPE-19細胞の注入に成功すれば、光コメレン断層撮影または他の方法で眼を撮像する際に、わずかな量の破片を有するマウスの膜子房内に無傷のカプセルが存在することを明らかにするべきである(図4B)。
10. 注射されたマウスの眼は、手術による数日間の回復の後、手元の実験的パラダイムの準備が整いました。
    注:眼の中のカプセルの外科用セットアップおよびドキュメンテーションは、それぞれ図3および図4に示されている。

結果

ARPE-19細胞は、眼にカプセルを移植した際のカプセル化および長期生存に適性であることが示されている、自然消滅ヒトRPE細胞株である。アルギン酸カプセル化のツールを図 1に示します。本研究では、アルギン酸塩に封入した際に、アルギン酸カプセル内の細胞を明視野イメージングにより確認したことが実証された(図2A)。カプセル内の細胞に対して生死性アッセイを行い、90%の生存率ポストカプセル化を実証した(図2B)。カプセル内の細胞の長期生存率を確保するために、カプセルをクエン酸ナトリウムに溶解し、次いで細胞を再めっきした(図2C)。安定したトランスフェクトARPE-19細胞^{が望まれていた}生物学的製剤を発現し分泌したことを独立実験で確認した後、細胞を安全に封入するためのパラメータを確立した後、眼内注射用にカプセルを製造した。

ディスカッション

この細胞カプセル化技術は比較的迅速かつ容易に実行できます。ただし、特定のポイントは、正確な下流の結果を得るために心に留める必要があります。細胞は、カプセル化する前にペトリ皿の培養中に維持され、適切な合流で保持されるべきである。カプセル化は、可能であれば、規制された空気の流れと適切な換気フードで行われるべきです。空気の流れが強すぎると、特に長期実験においてカプセル形成に影響を与える可能性があります。滅菌器具および溶液は、カプセル内の細胞の長期維持のために重要である。

現在、生死染色は、カプセル内の細胞の生存率を決定するための確認ツールとして使用されています。カプセル1個当たりの細胞数と現在の条件下(すなわち、通常は1カプセル当たり12〜20細胞)も視覚的に決定されます。カプセル化されたセルバッチの各バッチの実行可能性は、このメソッドによって監視されます。細胞の生存率をさらに決定するために、封入された細胞が溶解し、再培養される。これはさらにカプセル内の細胞の生存率および完全性を示し、成功した細胞カプセル化を検証する。

細胞カプセル...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3 mLシリンジ	BD	309656
30 G 1 "鈍い針	SAI注入技術	B30-100
アルギン酸ナトリウム塩、褐藻	グマ	A0682
アトロピン硫酸眼液(1%)	Akorn	NDC 17478-215-15	瞳孔拡張用
BD 1 mLシリンジ26 G x 3/8(0.45 mm x 10 mm)	ベクトン、ディキンソン、会社	DG518105 500029609 REF 309625	、ガイドホールを生成する
塩化カルシウム、無水、粒状	シグマ	C1016
ジェンティール ティアーズ	アルコン	NDC 0078-0429-47	麻酔中に目を滑らかにする
ゴニオテール: ヒプロメロース (2.5%) 眼炎用粘液 (滅菌)	アルタイル ファーマシューティカルズ インク	NDC 59390-182-13	麻酔中に目を滑らかにする
ハミルトン ニードル/シリンジ ヒント: 27 G、スモール ハブ RN NDL、カスタム長 (12 mm)、ポイント スタイル 3、カプセル	の硝子体内送達用	ハミルトン	7803-01
ミルトン シリンジ: 2.5 & マイクロ;L、モデル62 RN SYR、NDL 別売り	カプセルの硝子体内送達用	ハミルトン	7632-01
HEPESバッファー、1 M	フィッシャー バイオ試薬	BP299100
高電圧発生器	ESD EMC テクノロジー	ES813-D20
LIVE/DEAD 生存能力/細胞毒性キット	サーモフィッシャー サイエンティフィック	L3224
L-オルニチン塩酸塩、99%	アルファAesar	A12111ネオ
マイシンおよびポリミキシンB硫酸塩およびデキサメタゾン眼炎軟膏	SANDOZ	NDC 61314-631-36	硝子体内注射後の感染を防ぐための抗生物質
フェノールフリン塩酸塩眼炎溶液(2.5%)	瞳孔拡張用	Akorn	NDC 17478-201-15
ナトリウム	シグマ	S-5886
滅菌注射器フィルター、0.2 μm	VWR	28143-312
シリンジポンプ	GRASEBY	MS16A

シ6/PK ハ塩化