腸と肝オルガノイドを有する微小生理学的システム(MPS)をアセトアミノフェン(APAP)に曝露した。本稿では、MPSにおけるオルガノイド産生法およびAPAP薬物動態学的および毒性学的特性評価法について説明する。また、結果を検証するために必要な組織機能分析についても説明します。
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この記事について
サマリー
要約
ヒトオルガノイドを栽培する最近導入された微小生理学的システム(MPS)は、遺伝的にヒトであり、組織間の相互作用を再現するため、薬物開発プロセスの前臨床試験段階で動物よりも優れたパフォーマンスが期待されています。本研究では、ヒト腸バリア(Caco-2およびHT-29細胞の共培養によってエミュレートされる)と肝臓等価物(分化されたHepaRG細胞およびヒト肝星状細胞で作られたスフェロイドによってエミュレートされる)を、2臓器チップ(2-OC)微小流体装置に統合し、アセトアミノフェン(APAP)薬能的反応薬基性(PK)および毒性特性を評価した。MPSには、腸のみ2-OC、肝臓のみ2-OC、腸/肝臓2-OCの3つのアセンブリがあり、両方のオルガノイドを介する同じ培地が付いていました。PK評価では、腸の障壁(経口経路をエミュレートする)または媒体(静脈内経路をエミュレートする)をそれぞれ12μMおよび2μMで投与した後、事前設定された時点でメディアにAPAPを投与した。培地サンプルを、逆相高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析した。オルガノイドは、遺伝子発現、TEER値、タンパク質発現および活性について分析し、次いで収集、固定、および形態学的評価のセットに提出した。MTT技術はオルガノイドの生存率を評価する上で良好な成績を発揮したが、高含量分析(HCA)はAPAP治療に応答して非常に初期の毒性事象を検出することができた。我々は、培地流量がAPAP吸収に有意に影響を及ぼさないのに対し、肝臓と同等の機能を有意に改善することを検証した。APAPヒト腸管吸収および肝代謝は、MPSでエミュレートすることができる。MPSデータとインシリコモデリングとの関連は、インビトロ法の予測可能性を向上させ、薬物動態および毒物学的研究における動物モデルよりも優れた精度を提供する大きな可能性を秘めています。
概要
ゲノムとプロテオミクスの違いにより、動物モデルはいくつかの人間の結果に対して予測値が限られています。さらに、彼らは時間がかかり、高価で倫理的に疑わしい1です。MPSは、予測力の向上を目的とし、前臨床試験に費やされるコストと時間を削減することを目的とした比較的新しい技術です。オルガノイド(臓器の人工模倣機能単位)を、オルガノイドとオルガノイドのコミュニケーションを促進する媒体流れの下で育成する微小流体デバイスです。ヒト細胞から作られたオルガノイドは、翻訳関連性を2、3、4に増加させる。MPSは、遺伝的にヒトであり、組織間の相互作用を再現するため、動物実験よりも優れたパフォーマンスを発揮することが期待されています。完全に機能すると、MPSはより高い速度と低コストとリスク4で、より有意義な結果を提供します。多くのグループは、いくつかの目的のためにMPSを開発しています, 特に薬物の有効性をテストするための疾患モデル.
暴露レベルは、薬効と毒性5、6、7、8、9、10、11、12
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プロトコル
1. 2-OCでの栽培に使用する組織等価物の製造
- 小腸バリア同等生産
- 腸に相当する培地を使用してCaco-2およびHT-29細胞を維持する:DMEMは10%FBS、1%ペニシリンおよびストレプトマイシン、および1%非必須アミノ酸を補充し、この原稿では「DMEM S」と名付けられました。
- 培地を取り出し、1x DPBSで2回洗浄し、0.25%トリプシン/EDTAの8 mLを加えて、細胞培養フラスコで増殖させたCaco-2細胞を解化する(175 cm2)。37°Cで5分間インキュベートし、少なくとも2倍のトリプシン阻害剤を添加して反応を停止する。HT-29細胞に対して同様の手順を実行し、これらの細胞の少量が必要であり、それらがより小さなフラスコ(75cm2)で維持されるので、試薬の体積を調節する。
- 遠心分離機を5分間250xgで、両方のチューブから上澄み剤を取り除き、細胞ペレットを10 mLのDMEM S.Count細胞に再懸濁し、80%以上の細胞生存率を保証する。 無菌的にバソラテラサイド(人間の血流を表す)のウェルあたりDMEM Sの400 μLで満たされた24ウェルプレートに細胞培養挿入物を統合する。
- 9:121の比率でCaco-2とHT-29細胞を共同栽培する。DMEM Sの最終容積200μLで各腸に相当する2.25 x 105
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結果
2-OC MPSでPKAPAP検査を行うために、第一のステップは、ヒトの腸および肝臓等価物(オルガノイド)を製造することです。それらはPK APAPのアッセイを開始する前に2-OCのマイクロ流体装置(図1A)24時間に統合される。翌日、メディアが変更され、モデルが APAP に公開されます。図1は、2-OC装置内に配置された腸および肝臓等価物(図1B)およびAPAP PK実験時間経過(図1C)を示す。MTTアッセイ、TEER測定、HCA、リアルタイムPCR、ウェスタンブロッティング、組織学、共焦点蛍光顕微鏡を2D培養および3Dオルガノイドで行い、組織の生存率を確認し、APAP毒性の可能性を検出しました。共焦点蛍光顕微鏡画像において、DAPIとファロイジンで染色された腸の同等のサンプル(それぞれ核およびアクチンについて)を非処理サンプル(図2A)
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ディスカッション
次の開発ステップでリスクを低減するためには、調査用新薬の薬理学的特性の正確かつ信頼性の高い評価が不可欠です。MPSは比較的新しい技術であり、予測力を向上させ、前臨床試験に費やすコストと時間を削減することを目的としています。私たちのグループは、主に鉛最適化に必要な薬物動態および毒物学的特性の評価を進めています。私たちは、2つの部屋を持つ2-OCマイクロ流体デバイスと協力して、2つのオルガノイドの統合を可能にしました。APAPは、高品質の人間のデータをたくさん持っているので選ばれました, 主に肝臓によって代謝されています, また、肝毒性特性を表示します.研究プロトコルは、薬物がボランティアに経口投与されるヒト第I相臨床試験のいくつかのステップをエミュレートすることを目的とし、薬物動態特性を知るために薬物の濃度を評価するために定期的な血液サンプルを採取し、生化学的および臨床的パラメータを収集して安全性と耐容性を評価する。したがって、MPS が十分に進化して信頼性の高い予測を提供できる場合、第 1 段階の試行で障害が発生するリスクが大幅に軽減されます。将来的に疾患モデルを追加することにより、同じ仮定がフェーズIIおよびIII臨床試験にも適用され.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
クリスティ・グゲン=ギロウゾ博士、522号機INSERMのフィリップ・グリポン博士、インセルム271号機271 INSERMのクリスチャン・トレポ博士に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1x DPBS | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 14190235 | カルシウムなし、マグネシウムなし |
| 2-OC | TissUse GmbH | 2 臓器チップ | |
| 384ウェルスフェロイドマイクロプレート | コーニング | 3830 | ブラック/クリア、丸底、超低 付着 |
| 4% パラホルムアルデヒド | 細胞の固定に使用 | ||
| アセトアミノフェン | Sigma Aldrich | A7085 | MPSアッセイに使用 |
| アセトニトリルテ | ディア | HPLCの実施に使用 | |
| アレクサフルオア 647ファロイジン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 共焦点実験 | |
| シグマ・アルドリッチ | HPLCの実施に使用 | ||
| Caco-2細胞 | シグマ・アルドリッチ | 86010202 | |
| カコジル酸緩衝液 | |||
| 細胞培養フラスコ | Sarstedt | ||
| 共焦点蛍光顕微鏡 | ライカ | DMI6000 | |
| クライオスタット | ライカ | CM1950 | |
| DMEM 高グルコース | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12800017 | サプリメントを追加:10% ウシ胎児血清、100 単位/mL ペニシリン、100 µg/mL ストレプトマイシン、および 1% 非必須アミノ酸 |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | HepaRG 培地に 2% 添加 |
| エタノール | シンセ | ||
| シ胎児血清 | サーモフィッシャー サイ | 12657029 | |
| 凍結培地 OCT | Tissue-Tek | ティッシュテック® O.C.T.™コンパウンドは、水溶性グリコールと樹脂の配合物であり、-10°Cの温度でのクライオスタット切片作成に便利な試料マトリックスを提供します。C以下。 | |
| ヘマトキシリン&Eosin | |||
| HepaRG細胞 | Biopredic International | HPR101 | 未分化細胞 |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | 細胞およびすべての培養サプリメント |
| Hoechst 33342 | HCA実験 | ||
| HT-29細胞 | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Human Insulin | Invitrogen -サーモフィッシャーサイエンティフィ | 12585014 | |
| ヒドロコルチゾン | Sigmaアルドリッチ | H0888イ | |
| ソプロパノール | メルク | 278475 | |
| カルノフスキー'固定剤 | |||
| L-グルタミン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A2916801 | |
| Luna C18 ガードカラム SS | フェノメネックス | HPLC | |
| 顕微鏡 | ライカ | DMi4000 | |
| ミクロトーム | ライカ | RM2245 | |
| ミリセル 0.4 µm孔径インサート | メルク | PIHP01250 | |
| ミリセル ERS-2メーター | メルク | MERS00002 | TEER測定に使用 |
| MitoTracker ディープレッド | HCA実験 | ||
| MTT | サーモフィッシャーサイエンティフィック | M6494 | |
| MX3000Pシステム | アジレントテクノロジー | ||
| ズ ノイバウアーチャンバー | 細胞を数える | ||
| オペレッタハイコンテントイメージングシステム | パーキンエルマー | ||
| ルシフェリン-IPA | プロメガ | Cat.#V9001 | |
| ニシリン/ストレプトマイシン | サーモフィッシャーサイエンティフィック15070063サーモフィッシャーサイエンティフィック | 細胞培養 | |
| パーマウント | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 組織学 | |
| プライマー | RT-qPCR | ||
| PVDF メンブレン | BioRad | ||
| PVDF シリンジフィルター | 0.22 μm孔径 | ||
| 逆相Luna C18カラム | Phenomenex | HPLC | |
| シェーカー(IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH &Co | 2819000 | MTTアッセイを改善するためにスフェロイドに使用 |
| Stellate Cell Media(STeC CM) | ScienCell | 5301 | STeC CMサプリメントを追加 |
| SuperScriptITM 逆転写酵素 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| SYBRグリーンPCRマスターミックス | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| TRizol TM試薬 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | トリゾールは、フェノールとグアニジンイソチオシアネートの単相溶液です。 | |
| トリプシン/EDTA溶液 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | R001100 | |
| 超低アタッチメントプレート | コーニング | CLS3471-24EA | 6ウェル |
| Vectashield plus DAPI封入剤 | |||
| 白色不透明 96ウェルマイクロプレート | PerkinHelmer | ||
| ワイドボアチップ | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | サプリメントの追加:10%ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、1mlペニシリンあたり100単位、100 & micro;g / mLストレプトマイシンおよび5 µg/mL ヒトインスリン |
参考文献
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
- Hynds, R. E., Giangreco, A.
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再版と許可
