新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル

サマリー

骨細胞の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るために、レーザー捕捉微細解剖(LCM)プロトコルが開発されました。現在の研究は、マウス大腿骨のセクションに焦点を当てています。しかしながら、ここで報告されるLCMプロトコルは、任意の硬質組織の細胞における遺伝子発現を研究するために使用することができる。

要約

RNAの収率と完全性は、RNA分析の決定的な方法です。しかし、多くの場合、レーザーキャプチャマイクロディスセクション(LCM)手順全体を通じてRNAの完全性を維持することは技術的に困難です。LCM研究は少量の材料で動作するため、限られたRNA収率に関する懸念も重要です。そこで、骨細胞の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るためにLCMプロトコルを開発しました。染色プロトコルの効果は、凍結切片の厚さ、微分解組織量、RNA抽出キット、および微小解剖骨細胞から得られるRNA収率および完全性に用いられるLCM系を評価した。8μm厚の凍結骨切片を粘着フィルムを用いて作製し、市販のLCM染色のための迅速なプロトコルを使用して染色した。試料をポリエチレンテレフタレート(PET)膜と粘着フィルムとの間に挟み込んだ。サンプル採取に重力を用いたLCMシステムとカラムベースのRNA抽出法を用いて、十分な収率の高品質RNAを得た。現在の研究は、マウス大腿骨のセクションに焦点を当てています。しかしながら、ここで報告されるLCMプロトコルは、生理学的条件および疾患プロセスの両方における任意の硬質組織の細胞におけるその状態遺伝子発現における研究に用いることができる。

概要

組織は、異種および空間的に分散した細胞タイプで構成されています。特定の組織内の異なる細胞タイプは、同じシグナルに異なる反応を示す場合があります。したがって、生理学的および病理学的条件の両方における異なる細胞型の役割の評価のために特定の細胞集団を単離できることが不可欠である。レーザー捕捉微分解子(LCM)は、複雑^な組織1から指定された細胞を分離および除去するための比較的迅速かつ正確な方法を提供する。LCMシステムは、レーザービームの力を使用して、酵素処理や培養中の増殖を必要とせずに組織組織切片から目的の細胞を分離します。これは、細胞が自然組織の生息地にあり、異なる細胞間の空間的関係を含む組織構造が保持されていることを意味します。捕捉された細胞と残留組織の両方の形態はよく保存され、複数の組織成分を同じスライドから順次サンプリングすることができます。単離された細胞は、その後、そのRNA、DNA、タンパク質または代謝産物^{含有量2、3}のその後の分析に使用することができる。

異なる細胞集団における遺伝子発現を分析するためには、または異なる処置後に、その後の^分析4、5に対して十分な品質および量のmRNAを得る必要がある。DNAとは対照的に、RNAは固定に敏感であり、目的がRNAを研究する場合は凍結組織の使用が推奨されます。mRNAはユビキタスリボヌクレアーゼ(RNase)によって急速に分解されるので、試料の取り扱いや調製時の厳格なRNaseフリー条件と室温でのサンプルの保管を回避する必要があります。さらに、長期の水相段階を伴わずに迅速な技術は、RNAの劣化を防ぐために重要^である6.RNAの歩留まりと完全性は、LCMプロセスおよび使用されるLCM^{システム7、8}の影響を受ける可能性もある。現在、動作原理が異なる4つのLCMシステムが利用可能です².RNA抽出の方法は、異なるRNA単離キットがRNA量^{および品質7、8}の有意な差で試験されているので、重要である場合もある。

任意の組織調製方法は、良好な形態コントラストを得ることと、さらなる分析のためにRNAの完全性を維持することとの間のバランスを見つける必要があります。骨から凍結切片を作製するために、粘着フィルムを開発し、継続的に改善^した9.骨のセクションは、粘着フィルム上で直接切断され、染色されます。この粘着フィルムは、多くのタイプの染色に適用可能であり、LCM^{9、10、11、12、13を}使用して骨凍結切除から目的の細胞を分離するために使用することができる、 ¹⁴.外科的除去、埋め込み、凍結、切断および染色を含むすべてのステップは1時間以内に完了することができる。重要なことに、破骨細胞、骨内層細胞、および破骨細胞などの細胞は、9、10、11、12、13、14を明確に同定することができる。この方法は、迅速かつ簡単であるという利点があります。骨凍結切片を生成するための別の方法は、テープ転送^{システム15}を使用することです。しかし、後者の技術は、より時間がかかり、セクションは、紫外線(UV)架橋によって前コーティングされた膜スライドに粘着テープから転送する必要があるため、追加の器械使用を必要とします。テープ転送システムはLCM^{16、17、18、19}と正常に結合されていますが、架橋コーティングは背景パターンを作成できることに留意すべきです。細胞型^識別20を妨害する可能性があります。

典型的には、微小解剖細胞から少量のRNAのみが抽出され、RNAの質および量は、しばしばマイクロキャピラリー電気泳^動21によって評価される。コンピュータプログラムは、RNA整合性番号(RIN)と呼ばれるRNA抽出物に品質のインデックスを割り当てるために使用されます。RIN 値 1.0 は完全に分解された RNA を示し、10.0 の値は RNA が完全に²²であることを示します。通常、5を超えるインデックスはRNA研究に十分と考えられています。RIN値が5.0−10.0のサンプルにおける遺伝子発現パターンは、互^いに23とよく相関することが報告されている。この方法の感度は高いが、総RNAの50pg/μLが検出できるため、試料中のRNA濃度が非常に低い場合に品質評価を得ることは非常に困難である。したがって、RNA品質を評価するために、LCM後に残存する組織部は、多くの場合、^{スライド24}上にバッファをピペッティングすることによってRNAを抽出するために使用される。

LCMは異なる凍結組織に広く使用されていますが、抽出されたRNAのRIN値が報告されることはほとんどありません。さらに、マウスの骨中のRNAを研究するための最も適切な方法を明らかにする比較研究はありません。本研究では、成虫マウス大腿骨からの凍結切片を用いて、高品質のRNAを得るためにサンプル調製、LCMプロトコルおよびRNA抽出を最適化した。本プロトコルは、特にサンプル収集に重力を使用するLCMシステム用に最適化された。

プロトコル

マウスの骨組織は、動物のケアのための一般的なガイドラインに厳密に従って使用され、動物の苦しみを最小限に抑えるためにすべての努力がなされました。

1. 動物と凍結埋め込み

1. 一定の室温(RT;24°C)および食糧および水への自由なアクセスが付いている12時間の光/12 h暗い周期の条件の家の動物。
   注:本研究における骨組織は、生後3ヶ月の雄野生型C57BL/6マウスから得られた。
2. 壊死では、全身麻酔下の腹部静脈カバからマウスを駆除する(ケタミン/キシラジン、100/6mg/kg腹腔内)。
   注:RNAの劣化を避けるために、RNaseフリーの器具や材料を使用し、手袋を着用し、実験全体を通してRTでサンプルの保管を迅速に回避します。
3. 大腿骨全体を素早く取り除き、メスとペーパータオルを使用して周囲の軟部組織をきれいにします。最適な切断温度(OCT)化合物を埋め込み金型に注ぎ、大腿骨を埋め込み金型の底部に入れます。液体窒素中のサンプルをスナップフリーズします。OCTはRTで透明で、凍結時は白色です。
4. 完全に凍結したら、サンプルをホイルで包み、ドライアイスで-80°Cに移します。さらに処理するまで-80°Cでサンプルを保存します。
   注:プロトコルはここで一時停止できます。

2. セクションの準備

1. クライオスタットの温度を-19 °C に設定し、ブロックホルダーの温度を -17 °C に設定します。70%エタノールを使用してクライオスタット内部を拭きます。硬いティッシュ、ガラススライド、フィッティングツールをクライオスタットに入れて冷却します。断面の間、クライオスタットの中に入れておいてください。
2. ドライアイス上の凍結組織ブロックをクライオスタットに移し、少なくとも10分間平衡化させます。
   注:凍結切除のために-80 °Cから-19 °Cまで1ブロックの繰り返し解凍と頻繁なサイクリングを避けてください。
3. 埋め込み金型の底部を押して、OCT ブロックを金型から押し出します。ブロックホルダーに十分なOCT培地を塗布し、ブロックに付着します。OCT メディアが完全に凍結されるまで待ちます。
4. ブロックホルダーをオブジェクトホルダーに入れ、所定の位置に締めます。ブレードの位置を調整し、15 μm の切断増分を使用してブロックをトリムし、サンプルを覆うOCT を除去します。サンプルが以前に切断され、表面が空気にさらされた場合は、ブロックから最初の2−3組織セクションを破棄します。
5. クライオスタットを調整して8 μmの断面を生成し、廃棄される2−3の凍結切片を切断します(最初の数は通常8μmより厚くなります)。粘着フィルムをブロック上に置き、フィッティングツールを使用してフィルムをブロックに付着させます。フィルムによってセクションを保持し、ゆっくりと一定の速度でカットを行います。
6. サンプルの解凍を避けるために、フィルム(サンプルを上向き)をあらかじめ冷却されたガラススライド(クライオスタット内のクライオバー上)に直ちに置きます。テープを使用して、汚れを落としやすくするためにフィルムをガラススライドに固定します。染色プロトコルを直ちに続行します。

3. ラピッド染色プロトコル

1. 50 mLチューブで以下の溶液の40 mLを準備し、氷の上に置きます:95%エタノール、RNaseフリー水、100%エタノール、100%エタノール、100%キシレン。氷上のすべてのステップを実行します(染色を除く)。実験日ごとに、RNaseフリー水で新鮮なすべての水性試薬を準備します。
   注意:キシレンによる中毒を避けるためにフードで作業します。
2. 95%エタノールで30sの切片をインキュベートし、その後、LCMおよび下流のアプリケーションを妨げる可能性があるOCTを慎重かつ完全に除去するために、RNaseフリー水でセクション30sを浸します。
3. 市販のLCM凍結部染色(材料表)を50μLの断面に塗布し、RTで10sをインキュベートし、スライドの端を吸収性ティッシュペーパー上に置いて排水します。100%エタノールで30sをすすいで余分な汚れを取り除きます。
4. 30秒の100%エタノールで第2のチューブに骨片を浸し、30秒の100%キシレンに移します。
5. サポートとして、乾いたガラススライドに粘着フィルム(上向きのサンプル)を置きます。フィルムが影響を受け、可能な限り平らに配置されていないことに注意してください。サンプルを完全に乾燥させないようにしてください。
6. その上にPET膜フレームスライドを置きます。まもなく、フィルム上の手袋の指を押してフィルムに取り付けます。その後、試料を膜と粘着フィルムの間に挟み込みます。粘着フィルムは折りたたんだりしわを付けたりするべきではないし、フィルムと膜の間に気泡があってはならない。LCM に直ちに進みます。

4. レーザーキャプチャマイクロディスセクション

1. 表面デコンタミタン(材料の表)を使用してRNaseからステージとキャップホルダーをきれいにします。スライドホルダーとキャップホルダーにそれぞれスライドとキャップをロードします。
2. フォーカスを調整し、1.25倍の目標でスライドの概要を取得します。40倍の目標に変更し、フォーカスを調整します。スライドの概要を使用して、対象領域を選択します。次のようにレーザーパラメータを調整します: 絞り, 7;レーザーパワー、60;速度, 5;パルス周波数、201;標本バランス、20。これらのパラメータを目的ごとに最適化します。
3. レーザーがサンプルをカットできない場合は、レーザーパワーを上げなさい。あるいは、レーザーを複数回適用することができる。さらに、ターゲットに不完全なカットのスポットがないか調べ、[移動とカット]オプションを使用してこれらのスポットの線を再描画します。後続のスライドの解剖用にレーザー設定を保存します。
4. 形態学的基準に基づいて遠位大腿骨の環状または皮質骨の骨細胞、骨細胞、骨細胞および骨の内層細胞を選択する。UVレーザーによる損傷を最小限に抑えるために、ターゲットセルから遠く離れたレーザーパスの線を引きます。染色後1時間以内にすべての微小切除を行う。
5. 各セルタイプを0.5 mLチューブの別個のキャップに集みます。
   注:液体回収の代わりに乾燥捕捉は、RNAの劣化を回避することができる。さらに、マイクロ遠心管のキャップに含まれる非常に少量のバッファーは、LCM中に蒸発または結晶化(その組成に応じて)することができます。
6. LCM後の回収管キャップを観察して捕獲の成功を確認する。RNA 抽出を直ちに続行します。

5. RNA抽出

1. β-メルカプトエタノールを含むリシスバッファーの50μLを回収管のキャップに分配し、キャップ内で1分間ピペッティングしてサンプルを分解し、ライサートをスピンダウンし、β-メルカプトエタノールを含むリシスバッファーの300μLをチューブに加えます。複数のキャップをプールする場合は、RNA 抽出キット (材料の表)に推奨されるバッファーの総量に注意してください。
   注意:β-メルカプトエタノールは、RNAを分解から保護するために添加する必要がありますが、それは有毒であると考えられています。防護服や手袋を着用し、フードの中で作業します。
2. また、各スライドについて、β-メルカプトエタノールを含む350μLのリシスバッファーを有する1.5mLマイクロ遠心分離管を標識した1本を調製する。LCMの後に残っているセクションを使用してRNAを抽出します。フィルムを膜から慎重に分離し、ゆっくりとセクションにリシスバッファーを数回ピペッティングすることにより、サンプルをlyseします。
   注:リシスバッファーの総量は350 μLでなければなりません。それはスライドから流れ出るように消化のために一度にそれをすべて使用しないでください。
3. ライサテサンプルをドライアイスに入れ、-80°Cに保存します。
   注:プロトコルはここで一時停止できます。
4. RTで溶融物を解凍し、LCM採取細胞から集採取管から1.5mLマイクロ遠心管にリサットを移す。複数のキャップを使用してサンプルを採取した場合は、複数のライサットをプールします。
5. 製造元の指示に従って RNA を抽出します。DNase Iでカラムを処理し、ゲノムDNAを除去します。14 μLのRNaseフリー水を含む溶出RNAを、12μL溶出物を生じる。RNAを-80°Cに保存します。
   注:プロトコルはここで一時停止できます。

6. RNA歩留まりと完全性の測定

1. 湿った氷の上でRNAを解凍します。マイクロキャピラリー電気泳動を用いて、単離されたRNAの収量と完全性を測定します。製造元の指示に従って、総RNA(サンプル1μL)をチップ(材料の表)にロードします。

結果

マウス大腿骨の骨細胞における遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るためにLCMプロトコルを開発した。最適化されたプロトコルでは、8 μm厚の凍結骨切片を粘着フィルム上で切断し、市販のLCM凍結部染色のための迅速なプロトコルを使用して染色した。試料をPET膜と粘着フィルムとの間に挟み込んだ。マウス骨細胞は、サンプル採取に重力を用いたLCMシステムを用いて微小分解剖した。カラムベースのRNA抽出法を用い、十分な収率の高品質RNAを得た。単離されたRNAの収率および完全性は、マイクロキャピラリー電気泳動を用いて測定した(図1)。

異なるlysisプロトコルを用いて得られたRNAの質および量の違いは、代表的なゲルおよびエレクトロフェログラムで見ることができる。試料をキャップ内で上下に1分間溶解させた場合、1mm2マイクロ解剖骨組織(8μm厚部)からRNAの約8.5ngを分離することができた。RIN値は8.60(図2)でした。

ディスカッション

RNAの質および量は両方とも、組織操作、LCMプロセス、RNA抽出などのサンプル調製のすべての段階で負の影響を受ける可能性があります。そこで、その後の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るためにLCMプロトコルを開発した。

LCMの場合、ほとんどの実験室ではセクション7−8 μm厚^さ2を使用しています。より厚いセクションは、より多くの材料を収穫することを可能にします。しかし、厚すぎると顕微鏡分解能が低下し、レーザーが切り抜けることができない場合があります。最適な組織厚さは、使用されるLCMシステム(およびレーザーおよびスライドタイプ)、ならびに^質問8、25の組織に依存する可能性が^高い。本研究では、異なる厚さの凍結切片(4、8または12 μm)を試験した。8 μm 厚の断面はLCMに最適であることが判明し、12μmの骨切片はレーザーで切断するのがより困難であり、4μmの断面はRNAの量を少なぞった。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-メルカプトエタノール	Σ	63689-25ML-F
無水エタノール EMPLURA	メルク ミリポア	8,18,76,01,000
接着フィルム (LMDフィルム)	Section-Lab	C-FL001
Agilent 2100 バイオアナライザーシステム	Agilent Technologies
Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit	Agilent Technologies	5067-1513
Arcturus HistoGene 染色溶液	Applied Biosystems	12241-05
クライオフィルムフィッティングツール	Section-Lab	C-FT000
クライオスタット ライカ CM 1950	ライカバイオシステム
ガラス顕微鏡 スライド、カット カラー つや消しオレンジ	VWR ライフサイエンス	631-1559
組織学 組織金型 PVC	MEDITE	48-6302-00
LMD7 レーザー ミクロディセクション システム	ライカ マイクロシステム
ロー プロファイル ミクロトーム ブレード ライカ DB80 XL	ライカ バイオシステム	14035843496
ヌクレアーゼフリー水	VWR ライフサイエンス	E476-500ML
PET メンブレン スライド 1.4 μm	分子機械 &Industries GmbH	50102
RNase Away surface decontaminant	Molecular BioProduct	7002
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004
Tissue-Tek 最適切断温度 (OCT) 化合物	Sakura Finetek	4583
キシレン	VWR ライフサイエンス	2,89,73,363