骨細胞の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るために、レーザー捕捉微細解剖(LCM)プロトコルが開発されました。現在の研究は、マウス大腿骨のセクションに焦点を当てています。しかしながら、ここで報告されるLCMプロトコルは、任意の硬質組織の細胞における遺伝子発現を研究するために使用することができる。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
RNAの収率と完全性は、RNA分析の決定的な方法です。しかし、多くの場合、レーザーキャプチャマイクロディスセクション(LCM)手順全体を通じてRNAの完全性を維持することは技術的に困難です。LCM研究は少量の材料で動作するため、限られたRNA収率に関する懸念も重要です。そこで、骨細胞の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るためにLCMプロトコルを開発しました。染色プロトコルの効果は、凍結切片の厚さ、微分解組織量、RNA抽出キット、および微小解剖骨細胞から得られるRNA収率および完全性に用いられるLCM系を評価した。8μm厚の凍結骨切片を粘着フィルムを用いて作製し、市販のLCM染色のための迅速なプロトコルを使用して染色した。試料をポリエチレンテレフタレート(PET)膜と粘着フィルムとの間に挟み込んだ。サンプル採取に重力を用いたLCMシステムとカラムベースのRNA抽出法を用いて、十分な収率の高品質RNAを得た。現在の研究は、マウス大腿骨のセクションに焦点を当てています。しかしながら、ここで報告されるLCMプロトコルは、生理学的条件および疾患プロセスの両方における任意の硬質組織の細胞におけるその状態遺伝子発現における研究に用いることができる。
概要
組織は、異種および空間的に分散した細胞タイプで構成されています。特定の組織内の異なる細胞タイプは、同じシグナルに異なる反応を示す場合があります。したがって、生理学的および病理学的条件の両方における異なる細胞型の役割の評価のために特定の細胞集団を単離できることが不可欠である。レーザー捕捉微分解子(LCM)は、複雑な組織1から指定された細胞を分離および除去するための比較的迅速かつ正確な方法を提供する。LCMシステムは、レーザービームの力を使用して、酵素処理や培養中の増殖を必要とせずに組織組織切片から目的の細胞を分離します。これは、細胞が自然組織の生息地にあり、異なる細胞間の空間的関係を含む組織構造が保持されていることを意味します。捕捉された細胞と残留組織の両方の形態はよく保存され、複数の組織成分を同じスライドから順次サンプリングすることができます。単離された細胞は、その後、そのRNA、DNA、タンパク質または代謝産物含有量2、3のその後の分析に使用することができる。
異なる細胞集団における遺伝子発現を分析するためには、または異なる処置後に、その後の分析4、5に対して十分な品質および量のmRNAを得る必....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
マウスの骨組織は、動物のケアのための一般的なガイドラインに厳密に従って使用され、動物の苦しみを最小限に抑えるためにすべての努力がなされました。
1. 動物と凍結埋め込み
- 一定の室温(RT;24°C)および食糧および水への自由なアクセスが付いている12時間の光/12 h暗い周期の条件の家の動物。
注:本研究における骨組織は、生後3ヶ月の雄野生型C57BL/6マウスから得られた。 - 壊死では、全身麻酔下の腹部静脈カバからマウスを駆除する(ケタミン/キシラジン、100/6mg/kg腹腔内)。
注:RNAの劣化を避けるために、RNaseフリーの器具や材料を使用し、手袋を着用し、実験全体を通してRTでサンプルの保管を迅速に回避します。 - 大腿骨全体を素早く取り除き、メスとペーパータオルを使用して周囲の軟部組織をきれいにします。最適な切断温度(OCT)化合物を埋め込み金型に注ぎ、大腿骨を埋め込み金型の底部に入れます。液体窒素中のサンプルをスナップフリーズします。OCTはRTで透明で、凍結時は白色です。
- 完全に凍結したら、サンプルをホイルで包み、ドライアイスで-80°Cに移します。さらに処理するまで-80°Cでサンプルを保存します。
注:プロトコルはここで一時停止できます。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
マウス大腿骨の骨細胞における遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るためにLCMプロトコルを開発した。最適化されたプロトコルでは、8 μm厚の凍結骨切片を粘着フィルム上で切断し、市販のLCM凍結部染色のための迅速なプロトコルを使用して染色した。試料をPET膜と粘着フィルムとの間に挟み込んだ。マウス骨細胞は、サンプル採取に重力を用いたLCMシステムを用いて微小分解剖した。カラムベースのRNA抽出法を用い、十分な収率の高品質RNAを得た。単離されたRNAの収率および完全性は、マイクロキャピラリー電気泳動を用いて測定した(図1)。
異なるlysisプロトコルを用いて得られたRNAの質および量の違いは、代表的なゲルおよびエレクトロフェログラムで見ることができる。試料をキャップ内で上下に1分間溶解させた場合、1mm2マイクロ解剖骨組織(8μm厚部)からRNAの約8.5ngを分離することができた。RIN値は8.60(図2)でした。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
RNAの質および量は両方とも、組織操作、LCMプロセス、RNA抽出などのサンプル調製のすべての段階で負の影響を受ける可能性があります。そこで、その後の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るためにLCMプロトコルを開発した。
LCMの場合、ほとんどの実験室ではセクション7−8 μm厚さ2を使用しています。より厚いセクションは、より多くの材料を収穫することを可能にします。しかし、厚すぎると顕微鏡分解能が低下し、レーザーが切り抜けることができない場合があります。最適な組織厚さは、使用されるLCMシステム(およびレーザーおよびスライドタイプ)、ならびに質問8、25の組織に依存する可能性が高い。本研究では、異なる厚さの凍結切片(4、8または12 μm)を試験した。8 μm 厚の断面はLCMに最適であることが判明し、12μmの骨切片はレーザーで切断するのがより困難であり、4μmの断面はRNAの量を少なぞった。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
著者らは、彼らの優れた技術的な助けだけでなく、彼らのサポートのためのVetcoreと動物ケアスタッフのためのUte ZeitzとニコルGinnerに感謝します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2-メルカプトエタノール | Σ | 63689-25ML-F | |
| 無水エタノール EMPLURA | メルク ミリポア | 8,18,76,01,000 | |
| 接着フィルム (LMDフィルム) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 バイオアナライザーシステム | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene 染色溶液 | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| クライオフィルムフィッティングツール | Section-Lab | C-FT000 | |
| クライオスタット ライカ CM 1950 | ライカバイオシステム | ||
| ガラス顕微鏡 スライド、カット カラー つや消しオレンジ | VWR ライフサイエンス | 631-1559 | |
| 組織学 組織金型 PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 レーザー ミクロディセクション システム | ライカ マイクロシステム | ||
| ロー プロファイル ミクロトーム ブレード ライカ DB80 XL | ライカ バイオシステム | 14035843496 | |
| ヌクレアーゼフリー水 | VWR ライフサイエンス | E476-500ML | |
| PET メンブレン スライド 1.4 μm | 分子機械 &Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek 最適切断温度 (OCT) 化合物 | Sakura Finetek | 4583 | |
| キシレン | VWR ライフサイエンス | 2,89,73,363 |
参考文献
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Ca....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
