ルシファー黄イオン球形成を用いてアストロサイト形態を可視化

サマリー

アストロサイトは形態的に複雑な細胞であり、その複数のプロセスとふさふさした領域によって例示される。彼らの精巧な形態を分析するために、我々は軽く固定された組織で細胞内ルシファー黄色イオントフォレシスを行う信頼性の高いプロトコルを提示する。

要約

アストロサイトは神経回路の必須成分です。彼らは中枢神経系全体(CNS)をタイル化し、神経伝達物質のクリアランス、イオン調節、シナプス変調、ニューロンへの代謝サポート、血流調節を含む様々な機能に関与しています。アストロサイトは、大豆、いくつかの主要な枝、および神経ピル内の多様な細胞要素に接触する多数の微細なプロセスを有する複雑な細胞です。アストロサイトの形態を評価するためには、その構造を可視化する信頼性と再現性の高い方法が必要です。成体マウスの軽く固定された脳組織に蛍光ルシファーイエロー(LY)色素を用いてアストロサイトの細胞内イオントフォレシスを行う信頼性の高いプロトコルを報告する。この方法には、アストロサイト形態を特徴付けるために有用ないくつかの特徴があります。これは、個々の星状細胞の三次元再構成を可能にし、その構造の異なる側面で形態学的分析を行うために有用である。また、LYイオントフォアシスと共に免疫組織化学を利用して、神経系の異なる構成要素とのアストロサイトの相互作用を理解し、標識された星状細胞内のタンパク質の発現を評価することができます。このプロトコルは、光顕微鏡でアストロサイト形態を厳密に調べるために、CNS障害の様々なマウスモデルで実装することができる。LYイオントフォレシスは、特にこれらの細胞が有意な形態変化を受けることが提案されている傷害または疾患の文脈において、星状細胞構造を評価するための実験的アプローチを提供する。

概要

アストロサイトは、中枢神経系(CNS)で最も豊富なグリア細胞です。彼らはイオン恒常性、血流調節、シナプス形成だけでなく、排除、および神経伝達物質の取り込^み1で役割を果たしています。アストロサイト機能の広い範囲は、その複雑な形態^構造2、3に反映されます。アストロサイトには、シナプス、デンドライト、軸、血管、および他のグリア細胞と直接相互作用する何千もの細かい枝とリーフレットに分かれたいくつかの一次および二次枝が含まれています。アストロサイトの形態は、異なる脳領域によって異なり、神経回路4でその機能を差別的に実行する能力を示唆する可能性^がある。さらに、アストロサイトは、発達中、生理的状態の間、および複数の疾患状態3、5、6において形態を変化させる知られている。

アストロサイト形態の複雑さを正確に解決するには、一貫性のある再現性の高い方法が必要です。伝統的に、免疫組織化学は、アストロサイト特異的またはアストロサイト濃縮タンパク質マーカーを使用して星細胞を視覚化するために使用されてきました。しかし、これらの方法は、アストロサイトの構造ではなくタンパク質発現のパターンを明らかにする。グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)およびS100カルシウム結合タンパク質β(S100β)のような一般的に使用されるマーカーは、細胞体積全体で発現しないため、完全な^形態7を解決しない。アストロサイト(ウイルス注射またはトランスジェニックマウスレポーターライン)で蛍光タンパク質をユビキタスに発現する遺伝的アプローチは、より細かい枝および全体的な領域を同定することができる。しかしながら、個々の星状細胞を区別することは困難であり、分析は特定の^{プロモーター8}によって標的となる星状細胞集団によって偏りが生じよい。シリアルセクション電子顕微鏡は、シナプスとの星状細胞プロセスの相互作用の詳細な画像を明らかにするために使用されています。シナプスに接触する何千ものアストロサイトプロセスのため、現在、この^技術9で細胞全体を再構築することは不可能ですが、これはデータ分析のための機械学習アプローチの使用によって変化することが期待されます。

本報告では、CA1層ラジエータムを例にルシファー黄色(LY)色素を用いて細胞内イオントフォレシスを用いてマウスアストロサイトを特徴付ける手順に焦点を当てる。この方法は、エリック・ブソンとマーク・エリス^{マン10、11}による先駆的な過去の作品に基づいています。軽く固定された脳のスライスからのアストロサイトは、その独特のソマ形状によって識別され、LYで満たされます。細胞は、その後、共焦点顕微鏡で画像化されます。LYイオントフォレシスを用いて個々の星状細胞を再構築し、そのプロセスと領域の詳細な形態学的解析を行う方法を示す。また、この方法は、免疫組織化学と組み合わせて、アストロサイトとニューロン、他のグリア細胞、脳血管系との空間的関係と相互作用を同定するために適用することができる。LYイオントフォレシスは、健康または^{疾患状態7、12、13}の異なる脳領域およびマウスモデルの形態を分析するのに非常に適したツールであると考える。

プロトコル

本研究の動物実験は、実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所に従って行われ、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の首相動物研究委員会によって承認されました。全ての実験で混合性の成体マウス(6−8週齢)を用いた。

1. ソリューションの準備

1. 人工脳脊髄液(ACSF)溶液
   1. 各実験の前に新鮮なACSF溶液(135 mM NaCl、5 mM KCl、1mM MgCl 2、14.7 mM NaHCO_3、11mM D-グルコース、1.25 mM Na₂HPO_4、および2 mM CaCl₂₎を調製する。最後のステップで MgCl₂と CaCl₂を追加します。成分を高品質の脱イオン水に溶かします。
   2. ACSF溶液を水浴中35°Cでインキュベートし、実験前に少なくとも30分間95%O 2/5%CO2で泡を入れます。
   3. 塩酸リドカインを2%加え、ACSF(100mL)で0.02%の最終濃度に達します。
2. 固定ソリューション
   1. 10%ホルマリン緩衝リン酸塩を使用します。
3. LY染料溶液
   1. LY CHジリチウム塩またはLY CHジカリウム塩を5mM KCl.渦に完全に溶解して1.5%LY色素溶液を調剤する。1 mL の体積は、いくつかの実験で十分です。
   2. 16,800 x gで10分の遠心分離機。次に、0.2 μmのシリンジフィルターで上清を新しいチューブに濾過します。アリコートは、最大3ヶ月間4°Cで保つことができます。
      注:電極を詰まらせる可能性のある色素粒子の凝集を防ぐために、色素溶液を遠心分離してろ下することが重要です。

2. マウス経膜灌流と脳解剖

1. 心筋灌流のための装置およびマウスの準備
   注:どちらの性別のC57/BL6マウスも使用することができる。この方法が確実に機能するためには、マウスが3ヶ月より古くないことが重要である(生後6−8週間が理想的である)ことが経験的に観察されている。灌流プロトコルを以下に説明する。詳細については、追加のリファレンス¹⁴.
   1. ACSF溶液で灌流チューブをクリアし、ライン内の気泡を除去します。使用順に手術道具(ピンセット、曲がりくねった、鈍いはさみ、虹彩はさみ)を設定します。
   2. イソムラン誘導室に入れてマウスを深く麻酔し、2-3 mLのイソムランをチャンバーに加えた後に。麻酔薬が有効になるために1−2分を許可します。呼吸が止まらないようにしてください。
   3. つま先のピンチ反射をテストします。マウスが痛みの刺激に反応せず、反射が存在しない場合に続行します。酸素中の5%のイソルランと化学ヒュームフードの中にテープで留められた手足と尾の供給と呼吸コーンに置かれた頭部とスピインの位置で動物を固定します。
2. トランスカルダイヤル灌流
   1. ピンセットを使用して、肋骨ケージの下の皮膚を持ち上げます。湾曲した鈍いはさみで5-6cmの切開を行い、腹腔を露出させます。肝臓と横隔膜が見えるまで腹壁を上方に切ります。
   2. 肝臓を図からそっと離します。虹彩はさみで、横隔膜に3〜4cmの横切開を行います。
   3. 胸腔を露出させるために、体の両側に沿って肋骨ケージを切断します。心臓を損傷し、肺を避けるように注意してください。胸骨を持ち上げて心臓を露出させる。
   4. 心臓が見えるようになったら、抗凝固剤として左心室にヘパリンナトリウム溶液(1,000米ドル/mL)を0.05mL注入する。次に、左心室に注流針を慎重に挿入します。針が心室にとどまり、他の心臓室に突き刺さらないようにしてください。虹彩はさみで右のアトリウムに小さな切開を行います。
   5. 既存の体の流体が血液から取り除かれるまで、約10 mL/minの割合でACSF溶液を使用します(1−2分)。
   6. 気泡を導入することなく、ACSFソリューションから固定ソリューションに切り替えます。10−20 mL/分で10分間の固定ソリューションを使用。
      注意:固定溶液が鼻から排出されないように注意してください。これは、針が右心室に達し、固定剤が全身回路を通って体の残りの部分に移動するのではなく、肺に移動していることを示しています。
3. 脳の解剖
   1. はさみでマウスの頭部を取り除き、慎重に頭蓋骨からマウスの脳を解剖します。短い固定期間の室温で1.5時間の固定溶液に置きます。
      注:LYイオントフォレシスを成功させるためには、良好な灌流が必要です。脳は白色で、脳血管系に血液が存在しない必要があります。体と手足が硬く見えるはずです。

3. スライス準備

1. 海馬スライスの調製
   1. 0.1 Mリン酸緩衝生理食生(PBS)で脳を室温で5分間洗浄します。その後、フィルターペーパーで脳を乾燥させ、鋭利なかみそり刃で嗅球と小脳を取り除きます。
   2. シアノクリレート接着剤を使用してビブラートトレイに脳を取り付け、室温でPBSでトレイを充填します。110 μm の厚さの海馬冠切をカットします。
      注:ビブラートムの設定を調整して、スライスの厚さと表面が同じであることを確認します。この実験では、4.5の速度設定と周波数設定8を使用しました。ユーザーは、他のデバイスの設定を試す必要がある場合があります。
   3. トレイからセクションを収集し、氷上のPBSの皿に置きます。

4. 電極製剤

1. 適切な抵抗を持つ鋭い電極を準備します。
   1. フィラメント付きホウケイ酸ガラス単一バレル電極(O.D. 1.0 mm、I.D. 0.58 mm)を使用します。マイクロピペットプーラー(材料の表)に電極を引っ張ります。5 mM KCl で 1.5% LY で満たされた理想的な電極は、PBS の浴槽に入れると 200 MΩ の抵抗を持つ必要があります。
      注:プーラー設定は、装置(使用する機械の種類とプーラーフィラメント)によって異なります。熱設定を高くすると、通常、より長く細かいヒントが与えます。この実験で使用されるマイクロピペットプーラーの場合、設定は熱:317、プル:90、速度:70、遅延:70。トラフ型フィラメントを用いた。
   2. 端にほこりが入らないように、閉じた容器に電極を保管してください。先端が壊れないように、箱の底から電極を上に保ちます。
2. 電極をLY色素溶液で充填します。
   1. 先端を下向きにして垂直位置に電極を配置します。電極の背面にLY溶液のピペット1−2 μLを取り込み、毛細血管作用を介して溶液が先端に移動するのを5−10分間待ちます。
   2. マニピュレータに接続された電極ホルダーの充填電極を静かに固定します。
      注:電極ホルダーの銀線は、電極内部のLYと接触する必要があります。ワイヤの長さに応じて、必要に応じて LY 溶液の体積を調整します。

5. イオントフォレシスでアストロサイトを充填する

1. 電極をテストします。
   1. 室温で0.1 M PBSで満たされたガラス底皿に脳のスライスを穏やかに置きます。スライスをナイロンストリング付きのプラチナハープで所定の位置に保持します。
   2. 電極が電圧源に接続されていることを確認し、脳スライスを含む浴槽にアース電極を入れます。
   3. 目的の脳領域に目的を移動します。
   4. 電極を溶液に下ろします。明るいフィールドの下で、視野の中心に移動し、それが破片や気泡なしで明確に見えることを確認するために、40x水浸漬レンズでそれを慎重に調べます。電極先端に詰まらせるものがある場合は、新しい先端と交換してください。
      注:目詰まりは200 MΩ電極の懸念事項です。すべての実験の前に色素溶液の遠心分離とろ過では、これは頻繁な問題であるべきではありません。しかし、電極の先端が小さいため、組織が開口部に詰まってしまうことがある。著者らはこれを防ぐ方法を見つけていないが、新しい電極を使用するだけで簡単に対処できる。
   5. 488 nmレーザーで共焦点レーザー走査顕微鏡下の電極の先端を観察します。次いで、12Vで刺激器をオンにして試験染料吐出し、刺激器がオンの間に電極の先端の周りに大きな蛍光色素雲を注意する。電圧刺激時に色素が排出されていない場合は、電極を交換してください。
   6. 明るいフィールドの下で、ゆっくりと表面のすぐ上に停止するスライスに向かって電極を下げます。
2. イオントフォレシスで星状細胞を満たします。
   1. 赤外線差動干渉コントラスト(IR-DIC)を使用して、スライス表面の下にある40~50 μmのアストロサイトを同定します。直径約10μmの細長い楕円形のソマタを持つ細胞を探します。アストロサイトを選択したら、視野の中心に移動します。
      注:イオントフォレシスのための良い細胞は、その周りに明確な、定義された境界線を持っています。完全に塗りつぶすことができないため、スライスのサーフェスに近すぎるセルを選択しないでください。染料充填のためのアストロサイトを日常的に識別できるようになるには、数日にわたっていくつかの練習が必要です。実験に使用される脳領域によっては、アストロサイトの数が異なる場合があります。これは、充填前に星状細胞を識別するために必要な時間に影響を与える可能性があります。
   2. 電極先端をスライスにゆっくりと下げ、組織内を移動し、細胞体と同じ平面上に移動します。
      注:組織に損傷を与えないように電極をゆっくりと動かします。
   3. アストロサイトの細胞体がはっきりと見え、輪郭を描いたら、ゆっくりとゆっくりと電極を前方に進めます。先端が細胞のソマを突き刺すまで電極を動かします。電極がソマの中にある場合は、目的の焦点をゆっくりと上下に動かします。
      注:電極先端は細胞体内に入っている必要があり、ソマ上の小さなインデントを観察する必要があります。先端がセルを通過しないように、電極をこれ以上動かさないようにしてください。
   4. 電極先端がセル内に入ったら、刺激器を~0.5−1Vでオンにし、連続的に電流を細胞に放出します。共焦点顕微鏡を使用して、細胞の充填を見ます。デジタルズームを大きくしてセルの詳細を確認し、電極の先端がセル内に表示されていることを確認します。
      注:色素がセルから漏れているか、近くの他のセルを充填しているように見える場合は、電圧を下げなさい。色素がまだ細胞から漏れているように見える場合は、電極をゆっくりと引き出し、別のセルを見つけます。最終的な画像で高い信号/背景比を持つために色素が漏れていないことが重要です。
   5. 細かい枝とプロセスが定義されるまで約15分待ち、電圧をオフにし、静かにセルから電極先端を引き出します。
3. 塗りつぶされたセルをイメージします。
   注:イメージングは、充填後、または免疫組織化学で染色した直後に行うことができます。数値絞り(NA)が高い目的を持つ場合は、解像度が向上します。
   1. セルが元の形に戻るまで待ってから、40倍の目的でイメージング(15−20分)を行います。セルをイメージするには、コンフォーカルの設定を調整して、細かい分岐とプロセスが定義されていることを確認します。
   2. ステップサイズが0.3 μmのZスタックを設定します。イメージング中に、セルからの信号がなくなるまで目的を移動し、それを上部に設定します。次に、信号がなくなるまで目的を下に移動(セルを通してフォーカス)し、それを底部に設定します。
   3. イメージングが完了したら、電極で色素の突出を確認します。大きな色素雲が表示された場合は、次のスライスに使用できます。それ以外の場合は、新しい電極に置き換えます。
      注:単一の星状細胞の染料充填とイメージングは、約45分から1時間かかります。この特異的実験では、マウス当たり約3~6セルを得ることができる。必要に応じて、同じスライスに複数のセルをラベル付けできます。しかし、個々の星状細胞を区別するために、細胞間で約200μmの距離を保つようにしてください。

6. 免疫組織化学染色(任意)

1. イメージングが完了したら、直ちに10%ホルマリンにスライスを氷の上に置き、免疫組織化学のために保存します。脳のスライスを暗闇の中に保管し、一晩4°Cに保存します。
2. 0.1 M PBSで脳切片3xを0.5%のニオニオン界面界面活性剤(すなわち、トリトンX 100)でそれぞれ5分間洗浄する。次いで、0.5%のニオニオン界面活性剤と10%の正常なヤギ血清(NGS)を穏やかな撹拌で室温で1時間の0.1M PBSの遮断溶液でインキュベートする。
3. 0.1 M PBSで希釈した一次抗体の攪拌を用いて断面を0.5%のニオニオン界面活性剤と5%のNGSを4°Cで2日間インキュベートする。
   注:脳スライスの厚さのために、一次抗体のインキュベーション期間を延長する必要があり、より良い浸透のために抗体濃度が増加する可能性があります。この実験では、抗GFAP抗体に1:500希釈を用い、抗アクアポリン-4抗体には1:500希釈を用いた。
4. 0.1 M PBSでセクション3xを0.5%のニオニオン界面活性剤でそれぞれ10分間洗浄し、0.1 M PBSで希釈した二次抗体を0.5%のニオニオニック界面活性剤でインキュベートし、室温で6時間は10%のNGSを使用します。
   注:LY色素を可視化するために使用される波長である488nmによって励起される二次抗体を選択しないでください。この実験では、アレクサフッ素546ヤギのアンチチキンIgG(H+L)とアレクサフルーラ647ヤギの抗ウサギIgG(H+L)に1:1,000希釈を使用しました。
5. 0.1 M PBS でセクション 3x をそれぞれ 10 分間すすいでください。その後、蛍光に適した取り付け媒体でガラス顕微鏡スライドにセクションを取り付けます。スライドをシールします。0.3 μmのステップサイズの画像セル。

結果

本研究で報告されたデータは、各実験における4匹のマウスから7~12個の細胞から採取された。平均データは、必要に応じて図パネルに報告されます。

アストロサイト形態を評価するために、図1に要約されたCA1層ラジエータムのアストロサイトを満たすためにLY色素を用いて細胞内イオントフォレシスを行った。図2は、代表的な星状細胞とその精巧な形態構造を示す。このセルは、488 nmレーザーライン(ステップサイズ0.3μmおよび3.0-3.5xデジタルズーム)を使用して、共焦点レーザー走査顕微鏡上の60倍オイル浸漬レンズを用いてポスト固定を画像化した。共焦点顕微鏡の光増倍管(PMT)、オフセット機能、ゲイン機能を調整し、最終画像に高い信号/背景比を作成した。図2Aでは、異なるZステップからの単一の光学面画像(1−6から順にラベル付けされた10μmごとに示す)は、プロセスの密集したネットワークに分割された中央のソマといくつかの主要な枝を明ら...

ディスカッション

本論文で概説する方法は、LY色素の細胞内イオン球形成を軽く固定された脳スライスで用いてアストロサイト形態を可視化する方法について述べた。このプロトコルで強調されているいくつかの重要な要因は、細胞のLYイオントフォレシスおよび形態的再構成の成功に寄与する。1つの要因は、主にマウスの年齢と灌流の結果によって決定される画像の品質と再現性です。本研究では、生後6~8週齢のC57/BL6Nマウスを用いて行った。成功した灌流(注入針の適切な配置に大きく依存し、白色の脳と脳血管系の血液の欠如によって指摘される)は、最も詳細で明確に満たされた細胞のために必要である。電極による衝撃の後、細胞膜は電極の先端の周りに堅いシールを維持し、色素が漏出するのを防ぐ必要があります。最善の努力にもかかわらず、時折、ピペットが脳組織を介して進むにつれて、細胞外の他の構造が充填されます:我々は分析からこれらの細胞を除外しました。電極の抵抗は、追加の重要な要因です。高い抵抗は電圧刺激の時に電極の先端からの色素の安定した放出を可能にするだけである。より技術的には、細胞のソマを電極で押し付ける際には、穏やかでゆっくりとした動きを維持することが重要です。細胞を通る電極の浸透は、ソ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10% 緩衝ホルマリンリン酸	フィッシャー	SF 100-20	同一の代替品を使用することができます
Pall	4692	を備えた Acrodisc シリンジフィルター
Ag/AgCl 粉砕ペレット	WPI	EP2	同様の代替品を使用することができます
Alexa Fluor 546 ヤギ抗チキン IgG (H+L)	Thermo Scientific	A-11040	同様の代替品を使用できます
Alexa Fluor 647 ヤギ 抗ウサギ IgG (H+L)	Thermo Scientific	A27040	同様の代替品を使用することができます
アンチアクアポリン-4抗体	Novus Biologicals	NBP1-87679	同様の代替品を使用することができます
アンチGFAP抗体	アブカム	ab4674	同様の代替品は、
フィラメント付きのホウケイ酸ガラスピペット	世界の精密機器	1B150F-4
C57BL/6NTac マウス	タコニックストック	B6	同様の代替品を使用可能
塩化カルシウム	シグマ	21108	同一の代替品を使用可能
共焦点レーザー走査顕微鏡	オリンパス	FV1000MPE	同様の代替品を使用可能
D-グルコース	Sigma	G7528	同一代替案を使用することができます
リン酸二ナトリウム	シグマ	255793	同一の代替品を使用することができます
電極プーラー-モデルP-97	Sutter	P-97	同様の代替品を使用することができます
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	同一の代替品を使用することができます
ヘパリンナトリウム注射剤(1mLあたり1,000 USP)	Sagent Pharmaceuticals	400-10	同一の代替手段
が使用できます Imaris ソフトウェア (バージョン 7.6.5)	Bitplane Inc.		同様の代替品を使用することができます
イソフルオラン	ヘンリー・シャイン アニマルヘルス	29404	同一の代替品を使用することができます
リドカイン塩酸塩注射剤 (2%)	クリッパー	1050035	同一の代替品を使用することができます
ルシファーイエロー CH ダイリチウム塩	シグマ	L0259
ルシファーイエロー CH ジカリウム塩	シグマ	L0144
塩化マグネシウム	Σ	M8266	同一の代替品を使用可能
顕微鏡カバーガラス	サーモサイエンティフィック	24X60-1	同一の代替品を使用可能
顕微鏡スライド	フィッシャー	12-544-2	同一の代替品を使用可能
ノーマルヤギ血清	ベクター研究所	S-1000	同一の代替品を使用可能
対物レンズ (40倍)	オリンパス	LUMPLFLN 40XW	同様の代替品を使用することができます
対物レンズ (60倍)	オリンパス	PlanAPO 60X	同様の代替品を使用することができます
PBS錠、100mL	VWR	VWRVE404	同一の代替品を使用することができます
ピペットマイクロマニピュレーター-モデルROE-200	サッター	MP-285 / ROE-200 / MPC-200	同様の代替品は、使用
塩化カリウム	Σ	P3911	同一の代替品を使用することができます
重炭酸ナトリウム	Sigma	S5761	同一の代替品を使用することができます
塩化ナトリウム	Σ	S5886	同一の代替品を使用することができます
刺激装置-モデル Omnical 2010	世界の精密機器	Omnical 2010	同様の代替品を使用することができます
Triton X 100	Sigma	T8787	同一の代替品を使用可能
Vibratome- Model #3000	Pelco	100-S	同様の代替品を使用可能