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方法論記事

アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析

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DOI：

10.3791/60230

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2019年8月28日

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、マウスアストロサイトにおけるオルガネラの細胞内輸送と血漿膜タンパク質の取引を可視化するインビトロライブイメージング法について述べる。このプロトコルはまた、貨物輸送の旅程と運動学を決定するための画像分析方法論を提示する。

要約

アストロサイトは、成人の脳の中で最も豊富な細胞型の一つです, 彼らは機能の多重性で重要な役割を果たしています.脳恒常性の中心的なプレーヤーとして、アストロサイトは重要な代謝産物と緩衝細胞外水、イオン、グルタミン酸をニューロンに供給します。「三分詞」シナプスの不可欠なコンポーネントは、アストロサイトもシナプスの形成、剪定、メンテナンス、および変調において重要です。これらの高度にインタラクティブな機能を可能にするために、アストロサイトは、細胞を含む多数の特殊な膜タンパク質を介して、他のグリア細胞、ニューロン、脳血管系、および細胞外環境と通信します。接着分子、アクアポリン、イオンチャネル、神経伝達物質トランスポーター、ギャップ接合分子。この動的フラックスをサポートするために、星状細胞は、ニューロンと同様に、緊密に調整され、効率的な細胞内輸送に依存しています。細胞内人身売買が広範囲に減少しているニューロンとは異なり、アストロサイトにおける微小管ベースの輸送はあまり研究されていない。それにもかかわらず、細胞膜タンパク質および細胞内オルガネラ輸送の外細胞および内嚢胞性人身売買は、アストロサイトの正常な生物学を調整し、これらのプロセスはしばしば病気または傷害に反応して影響を受ける。ここでは、高品質のマウスアストロサイトを培養し、目的の星状タンパク質および小器官を蛍光的に標識し、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いて細胞内輸送ダイナミクスを記録するための簡単なプロトコルを提示する。また、利用可能な画像解析ソフトウェア(ImageJ/FIJI)プラグインを使用して、取得したムービーから関連するトランスポートパラメータを抽出および定量化する方法についても説明します。

概要

アストロサイトは、成人中枢神経系で最も豊富な細胞であり、そこではユニークな発達および恒容性機能1を実行する。アストロサイトは、シナプス形成を促進する神経伝達物質受容体、トランスポーター、および細胞接着分子を含む三分詞シナプスの一部として、前および後の末端との直接接触を通じてシナプスの発達を調節するとニューロン-星状細胞通信2.さらに、アストロサイトはシナプス伝達を積極的に制御し、シナプス裂から興奮性神経伝達物質を迅速に除去し、神経伝達物質をリサイクルし、シナプス剪定に参加することにより、神経興奮毒性を防ぎます3,4,5,6.これらの非常にインタラクティブな機能を可能にするために、アストロサイトは、他のグリア細胞と、細胞接着分子、アクアポリン、イオンチャネルを含む特殊な膜タンパク質を介してニューロンと、自分自身の間で通信します。神経伝達物質トランスポーター、およびギャップ接接点分子。アストロサイトは、細胞内および細胞外環境の変動に応じて、これらのタンパク質の表面レベルを積極的に変化させる7.さらに、ミトコンドリア、脂質液滴、分解およびリサイクルオルガネラのレベルと分布の変化は、エネルギー供給、代謝物の利用可能性、および星状細胞機能に不可欠な細胞クリアリングプロセスを調節し、生存。

アストロサイトにおける膜タンパク質およびオルガネラの人身売買および位置の動的変化は、貨物運動性を促進する運動タンパク質およびアダプターの協調機能によって促進される8、9。同様に、膜タンパク質の表面レベルは、内部化およびリサイクルイベント10を通じて変調される。これらの貨物は、アクチン、微小管、およびおそらく中間フィラメントトラック8の複雑なネットワークを介して輸送されます。成長する微小管プラス末端に蓄積する末結合タンパク質1(EB1)の免疫蛍光染色に基づく研究は、微小管の鎖束が末端から放射し、そのプラス端を向いて拡張することを示唆している。周辺11.しかし、生細胞イメージングを用いて微小管やその他の細胞骨格素子の組織と極性を総合的に調べると、まだ不足している。オルガネラや膜タンパク質のダイナミクスの基礎となるメカニズムの多くは、ニューロンやその他の細胞型で広く研究されているが、アストロサイトの貨物運動性はあまりよく理解されていない。アストロサイトにおけるタンパク質およびオルガネラ分布の変化に関する我々の現在の知識のほとんどは、貨物ダイナミクス7の正確な空間的および時間的検査を妨げる固定製剤の従来の抗体ベースの標識に基づいている。 12.

ここでは、高純度の一次マウス星状細胞培養におけるライブイメージング用膜タンパク質および小器官に標識する方法について説明する。このプロトコルを使用して、ギャップ接合タンパク質コネキシン43(Cx43-GFP)および興奮性アミノ酸を含むトランスフェクト星状細胞における緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付き膜タンパク質の動的局在を追跡する例を提供します。トランスポーター1(EAAT1-GFP)。また、蛍光酸性プローブを用いて酸性小器官を可視化し、生きた星状細胞におけるその人身売買のダイナミクスに従うことも説明する。最後に、タイムラプスデータを分析して、個々の貨物の輸送パラメータを抽出して評価する方法を示します。

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プロトコル

すべての動物の手順は、チャペルヒル動物ケアと使用委員会(IACUC)でノースカロライナ大学の承認を得て行われました。

1. 一次マウス星細胞の脳解剖と培養

注:以下のプロトコルは、マッカーシーとデベリス13、14、15によって開発された元の手順に従って、公開された方法から適応されました。マッカーシー/デベリス(MD)アストロサイトの混合細胞培養は、生後2−4(P2−P4)マウス皮質から調製され、抗有化因子で処理し、最終的に濃縮された星細胞培養物を得るために精製される。いずれかの性別のマウスの子犬からの4つの皮質は、1つのT75組織培養フラスコ培養を生成するのに十分である。

  1. T75フラスコの底部(100%斜めの首のアクセス、0.22 μm疎水性通気フィルターキャップ)をポリD-リジン(0.1Mトリスバッファーで1mg/mL、pH 8.5)でコーティングし、解剖開始前に24時間37°Cでインキュベートします。
  2. 解剖手順を開始する前に、アストロサイト培養培地の温かい30 mL(ダルベッコの修飾イーグル培地[DMEM]高グルコース、10%熱不活性化胎児ウシ血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)を37°Cで解凍し、5mLのアリコートを2.5%の試料で解凍する。Ca2+または Mg2+なしでハンクのバランス塩溶液(HBSS)の6 mLで満たされた氷の上に2つの解剖皿(直径60ミリメートル)を準備します。
  3. すべての外科用具(細かい先端ピンセット、解剖はさみ、ヴァンナスはさみストレート、曲がった先端を持つGraefe鉗子)を各解剖の前および間に70%のエタノールで消毒する。
  4. 70%のエタノールでP2−P4マウスの頭と首をスプレーしてから、外科的なはさみで首を切り落とすことによってそれらを素早く安楽死させます。頭皮に沿って前中間線切開に後部を行い、頭蓋骨を露出させる。頭蓋骨を首から鼻まで慎重に切り取る。
  5. 目より優れた2つの追加の横切開を行う。細かい先端ピンセットを使用して、頭蓋骨のフラップを横にそっと反転します。脳を削除し、Ca2+またはMg2+なしで氷冷HBSSで満たされた最初の解剖皿に置きます.氷の上に皿を維持し、脳の残りの部分を収穫し続けます。
    注: 解剖スコープの下で解剖手順の残りの部分を実行します。
  6. バンナスはさみや細かいピンセットを使用して嗅球を取り外します(図1Ai)。横方向と半球間の裂け目の交点に曲げられた先端の鉗子を使用して、皮質と二脳症の間に2番目の曲面先端鉗子を静かに挿入し、ゆっくりと鉗子を開いて、残りの部分から大脳半球を分離します。脳(図1愛井、愛井)。不要な組織を取り除く(図1Aiv)。
  7. 皮質半球ごとに、細かい先端ピンセットで髄膜を慎重に取り除きます。必要に応じて、皮質から海馬を取り除きます。解剖したマウスコルティスをCa2+またはMg2+なしで氷冷HBSSで満たされた第2の皿に移し、残りの脳を解剖しながら氷の上に保管してください。
    注:層流フードの無菌条件下で次のステップを行います。
  8. 滅菌した皮質を、無菌の鋭い外科はさみまたはメスを使って小片(約2−4mm)に切る。解剖した組織を酵素溶液を含む50 mL円錐管に移す(Ca2+またはMg2+なし、2.5 mL 2.5%トリプシンなし)。37 °Cで30分間インキュベートし、10分ごとに穏やかな反転を行います。
  9. 消化された組織を300 x gで5分間遠心分離して回収し、デカンテーションにより酵素溶液を除去する(真空吸引器を使用しないでください)。10 mLのアストロサイト培養培養培養剤を添加し、10mLの血清ピペットを用いて溶液20−30xをピペッティングして組織を単一細胞に解離する。
  10. 70 μmの細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液をろ過し、細胞の塊および未消化組織を最小にする。きれいな50 mL円錐形チューブで濾液を収集し、アストロサイト培養培養物で総体積を20mLに調整します。この時点で、細胞懸濁液の10μLを10μLのトリパンブルーと混合し、細胞をヘモサイトメーターで計数することにより、皮質解離の効率を評価する。
    注:4つのP2−P4マウス皮質からの1つの調製物は10−15 x 10 6の単一細胞を得る。
  11. T75培養フラスコからポリD-リジンコーティング液を吸引し、無菌水で2回洗浄します。20 mLセル懸濁液をプレートし、37 °Cおよび5%CO2でインキュベートする。

2. アストロサイト培養の精製と維持

注:無菌濾過(0.22 μmフィルター膜)アストロサイトメディアを37°Cに温めたアストロサイト培地を使用して、層流フード内の無菌条件下ですべてのメディア変更を行います。

  1. めっき後48hの細胞媒体を交換する(インビトロ2、DIV2で1日)。
  2. DIV5では、10μMシトシンアラビノシド(AraC)を補充した新鮮なアストロサイト培養培養培養培養培養培養物で培養する。
    注:このステップは、線維芽細胞および他のグリア細胞を含む汚染物質細胞の除去を容易にする。長いインキュベーション時間がアストロサイトの生存率を減少させるので、AraCで培養を48時間より長く扱う必要があります。
  3. DIV7では、AraCを持たないアストロサイト培養メディアにメディアを変更し、毎日文化合流をチェックし始めます。細胞が80%の合流点に達したら、ポリD-リジンで各未精製星細胞培養フラスコに2-T75フラスコを塗り、37°Cで37°Cで一晩に少なくとも8時間インキュベートします。
  4. 翌日、培養フラスコを37°C軌道揺振りインキュベーターで30分間180rpmで振ってアストロサイト精製を開始する。メディアを取り外し、新鮮なアストロサイト培養メディアに置き換えます。37°Cの軌道振盪インキュベーターで6時間240rpmで細胞を振る。予め1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)、アストロサイト培養培養培養物、および0.25%トリプシン-EDTAを37°C 20−30分に振盪期間の終了前に。
    注:揺れのステップの間にCO2のインキュベーションは要求されない。 必要に応じて、30分および6-h振盪ステップの後に収集された培養物は、それぞれミクログリアおよびオリゴデンドロサイトを培養するために使用され得る。しかし、混合培養のAraC処理は、他のグリア細胞の豊富さを減少させる。
  5. シェーカーから培養フラスコを取り外し、すぐにフラスコあたり10 mLの暖かい1x PBSでメディアを交換します。PBSを取り出し、フラスコあたり0.25%トリプシン-EDTAの3 mLを追加します。37 °C および 5% CO2でインキュベートし、5 分ごとに剥離を確認します。
  6. 細胞がフラスコから切り離されたら、10mLのアストロサイト培養培養培養培養を加えてトリプシン化を停止する。切り離されたアストロサイトを50mLの円錐形チューブとペレット細胞に300 x gで5分間遠心分離して移管し、上清上清を吸引し、40mLの星細胞培養培養培養培養培養物で細胞を再中断する。
  7. ポリD-リジンコーティングされたT75フラスコを滅菌水で2回洗浄し、精製されたアストロサイト懸濁液のプレート20 mLを洗浄します。37 °C および 5% CO2インキュベーターに戻します。アストロサイト培養培養培養剤を2日おきに交換し、アストロサイトが成熟するまでさらに10日間使用します。
    注:精製された星状細胞の各T75フラスコは、めっきでそれぞれ3 x 105細胞を持つ2つの新しいT75フラスコを生成するのに十分であるべきです。
  8. 後続のパスの手順 2.5−2.7 を繰り返すか、顕微鏡検査用のアストロサイトをプレートします。
    注:AraCの添加後のアストロサイト培養物の純度と以下の精製は、明視野顕微鏡を通じて、またはグリア線維性酸タンパク質(GFAP)陽性の割合を定量化することによって、より正確に定性的に評価することができる。蛍光画像における視野ごとの細胞(図1B,C)。

3. 蛍光タグ付きプラスミドのトランスフェクション

  1. トランスフェクションまたは標識の前日に、トランスフェクション後24−48hポストトランスフェクションを撮像するための所望の密度で種アストロサイト。24ウェルプレートまたは14mmガラス底部ウェルの推奨密度は、2 x 104セル/ウェルです。
    注:このプロトコルは、リポフェクションベースの方法を使用して、24ウェルプレートまたは14mmガラス底部ウェル上の12mmガラスカバーリップにめっきされたアストロサイトのトランスフェクション用に最適化されています。試薬は、アストロサイトが成長している培養皿の大きさに応じて拡大する必要があります。
  2. リポフェクション試薬(材料の表)を還元血清媒体(材料の表)で希釈する。リポフェクション試薬とDNAの比率を最適化するには、適切な希釈の範囲をテストします。例えば、このプロトコル(材料の表)で用いられる試薬を用いれば、リポフェクション試薬の2、3、4、および5μLを還元血清培地の50μLで希釈する。
  3. 還元血清培中の250μLの高純度DNAを5μg希釈する。リポフェクションエンハンサー試薬(材料の表)の5 μLを追加します。リポフェクション試薬を含むチューブを、DNAリポフェクションエンハンサーミックスの等しい体積と組み合わせます。ピペッティングで混合し、室温(RT)で15分間インキュベートします。
  4. アストロサイト培養培養物を取り除き、トランスフェクションミックス(ステップ3.3)を細胞にドロップワイズに加えます。37°Cおよび5%CO2で6時間のインキュベーションを行った後、トランスフェクション複合体を適切な体積のアストロサイト培養培地(14mmガラス底皿用2mL)に置き換えます。画像取得に進む前に、さらに24~72時間インキュベートしてください。タンパク質発現と細胞生存率の最適なバランスを達成するために、インキュベーションステップの持続時間を注意深く監視します。

4. 蛍光プローブを用した後期エンドソーム/リソソームの標識

注:一部の貨物は、貨物特異的タンパク質に対して親和性の高い蛍光色素を使用して標識することができます。次の例は、蛍光酸性プローブを使用した後期エンドソーム/リソソームの標識を可能にする。

  1. アストロサイト培養培地の200μLのリソソーム標識プローブ(材料表)を1μMの作動濃度に希釈し、2 x 104細胞/ウェルの密度でステップ3.1からアストロサイトに適用します。37°Cで30分間インキュベートします。
  2. 温かい星状細胞培養培地で細胞を一度洗い、イメージング培地(材料の表)に置き換えます。すぐにライブイメージングに進みます。

5. タイムラプスイメージングシステムを用いた画像集録

注:タイムラプスライブイメージングは、高速カメラ、明確な焦点、インキュベーションチャンバー、および高い数値絞り(例えば、Plan-Apochromat 1.4NA)を備えた40倍の油目的を備えた蛍光顕微鏡を使用して行う必要があります。タイムラプスイメージングには、さまざまな集録ソフトウェアが用意されています。顕微鏡検査システムと取得ソフトウェアの選択は、特定の研究の目標に対する可用性と適合性に基づいて行う必要があります。一般的なガイドラインを以下に示します。

  1. 培養室または皿を顕微鏡ステージの適切なアダプターに置きます。エピ蛍光光を使用して、蛍光タンパク質またはプローブを発現する細胞を選択して記録します。蛍光サンプルイルミネーションを調整して、デジタルカメラを使用して選択したセルを視覚化します。光漂白や光毒性を引き起こす可能性のある高い照明の使用は避けてください。フォーカスとズームを調整します。
  2. ズームと明確なフォーカス機能を使用して、300秒から500秒の間の時間間隔のために、2秒ごとに1フレームの周波数で単一のZスタックタイムラプスシリーズを取得します。
    注:人身売買のダイナミクス(速度、運動周波数など)は、目的のタンパク質によって異なるため、取得の時間経過には調整が必要な場合があります。例えば、ミトコンドリアはリソソームよりもモチ性が低く、頻繁に休止を示す。この場合、取得パラメータを 800 s の場合は 5 s ごとに 1 フレームに調整する方が適切です。
  3. タイムラプス画像を保存し、AVIまたはTIFFスタックファイルとしてエクスポートします。

6. 画像解析

注:画像解析は、ImageJ/Fiji16用のKymoToolBoxプラグインを使用して行いました。詳細なステップバイステップの書かれた指示は、オンライン17で利用可能です。次の省略された手順は、キモグラフを作成し、パーティクル トランスポート パラメータを抽出するのに十分である必要があります。

  1. ImageJ/Fiji ソフトウェアでタイムラプスイメージシーケンスを開きます。ファイルメニューから AVI または TIFF スタック ファイルとしてイメージをインポートします。[イメージ]メニューから[タイプ]ツールを使用して、これらの種類の 1 つを選択して、イメージを 8 ビットまたは 16 ビットに変換します。RGB ファイルを操作する場合は、[イメージ]メニューの [色]機能で使用可能なチャンネル分割ツールを使用してチャンネルを分割します。
  2. キモグラフ(パーティクル軌道の位置と時間の表現)を生成するには、セグメント化された線ツールを使用してパーティクルの軌道に沿った線をトレースして、パーティクルが移動している各トラックを描画します。ムーブメントの方向性を正しく割り当てるには、すべてのムービーに同じ目的の方向規則を使用してポリラインを描画し、調査対象のすべてのセル間で極性が一貫するようにします。たとえば、セルの中心から周辺に向かってポリラインを描画したり、ポリラインを描画したりできます。[ライン]ツールをダブルクリックして、トラックの太さに合わせて線幅を調整します。
  3. 10の線幅を使用してKymoToolBoxプラグインの描画Kymoマクロを実行します。画像を時間(フレーム数、フレームレート)とスペース(x,Y解像度)で調整するよう求めるプロンプトが表示されます。キャリブレーションが完了すると、キモグラフが生成され、データ表示やさらなる粒子解析のためにTIFFファイルとして保存できます。
  4. 集録の全期間、セグメント化された線ツールを使用して、カイモグラフ内の各パーティクルを手動で追跡してパーティクル軌道を割り当てます。[分析/ツール]メニューにあるROI マネージャツールを使用して、各パーティクル 軌道を対象領域 (ROI) として記録します。さらなる分析のために、各タイムラプスビデオごとにすべてのROIsを保存します。
    注:輸送パラメータの最も正確な計算を達成するためには、キモグラフ上の個々の粒子に正しい軌道を割り当てすることが重要です。
    1. KymoToolBoxプラグインの分析Kymoマクロを実行します。ドロップダウン メニューからパーティクル モーションの"外側"方向(左から右へ、またはその逆)を定義するように求めるウィンドウが開きます。この選択は、ステップ6.2で確立された核または細胞周辺に対して画像化された蛍光貨物の位置に依存する。たとえば、核が貨物の左側に配置され、ステップ 6.2 のポリラインが核から離れて描画された場合、外側のパーティクルモーションを「左から右へ」と定義します。
    2. [Kymoの分析] ウィンドウで制限速度 (貨物がモチルと見なされる最小速度) を定義します。細胞内輸送速度が速い貨物の場合、0.1 μm/秒が適切な選択です。この値を変更して、対象の各貨物に対するソフトウェアの感度を調整します。各パーティクル軌道の厚さに合わせて線幅を調整します。
    3. [kymoの分析] ウィンドウで[すべてのデータをログに記録]を選択し、外挿された座標をログに記録します。これは、平均速度、内向き速度、外向き速度、累積距離、内向きまたは外側の方向に移動した距離、各粒子のスイッチ数、時間のパーセンテージを含む様々な貨物輸送パラメータを計算します。各方向に移動したり、一時停止したりする場合個々のトラックに対して計算されたデータは、kymograph ごとにプールされ、各画像に固有のテキスト ファイルに保存されます。
      注:分析Kymoマクロの[色付きKymoを表示]オプションは、元のキモグラフ上のパスの色分けされたオーバーレイを生成します。外側に移動するパーティクルは緑色、内側は赤色、静止したパーティクルは青色で表示されます。Kymoの分析マクロの[元のスタックのレポート座標] オプションは、元のタイムラプス ビデオとキモグラフ上の外挿されたオブジェクトの位置の色分けされたオーバーレイを生成します。

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結果

上記で概説した一次マウスMDアストロサイトを確立するためのプロトコルは、再現性の高い高品質の培養物を生み出す必要があります。培養物は当初、アストロサイト、線維芽細胞、およびミクログリアおよびオリゴデンドロサイトを含む他のグリア細胞の混合物を含むが(図1Bi,Biv;赤い矢頭)、DIV5-DIV7間の混合培養物へのAraCの添加は最小化するこれらの汚染物質細胞の増殖。AraC処理と揺れベースの精製戦略を組み合わせることで、精製工程のみを含む従来のプロトコル(図1Bv;青)よりもアストロサイト培養の純度を豊かにします(図1Bv;青)。矢印)13.アラCまたは未処理で処理された精製星細胞培養物の期待形態および組成物(GFAPおよび4'、6-ジアミディーノ-2−フェニリンドール[DAPI]染色)を図1

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ディスカッション

ここでは、高純度一次マウス皮質MDアストロサイトにおけるタイムラプスビデオ顕微鏡を用いて、蛍光タグ付きオルガネラおよび目的の膜タンパク質を発現、視覚化、追跡する実験的アプローチについて説明する。また、粒子ダイナミクスを測定する方法論についても概説する。一次星状細胞におけるタンパク質および小器官ダイナミクスの直接可視化は、インビトロでこれらの細胞における細胞内輸送の調節を研究するための強力なツールを提供する。

上記のマウスMDアストロサイト培養を確立するための方法論は、他の公開プロトコル13、14、15からのステップを組み合わせたものであり、より単純な方法と高純度と品質の両方をもたらす文化。AraC15処理と振盪ベースの精製13、14の組み合わせは、98%(GFAP+細胞総細胞の比率によって評価される)と高い純度を有する星状細胞培...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

DNLは、シモンズ学者としてチャペルヒル(UNC)医学部のノースカロライナ大学によってサポートされました。TWR は UNC PREP グラント R25 GM089569 によってサポートされました。UNC神経科学センター顕微鏡コア施設を用いる研究は、NIH-NINDS神経科学センター支援助成金P30 NS045892及びNIH-NICHD知的発達障害研究センター支援助成金U54の助成を受け、一部支援を受けた。HD079124

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2.5% トリプシン (10倍)Gibco15090-046
卓上遠心分離機Thermo Scientific75-203-637Sorvall ST8 遠心分離機
細胞培養グレード WaterGen Clone25-511
細胞培養顕微鏡ZeissWSN-AXIOVERT A1Vert.A1 倒立スコープ、蛍光機能を備えた
倒立組織培養顕微鏡シトシンアラビノシドシグマC1768-100MG(AraC) 凍結乾燥粉末を滅菌細胞培養グレードの水に溶解して10mMのストックを作り、分注して長期保存のために凍結
DAPIシグマD9542-5MG凍結乾燥粉末を最大濃度20mg/mlまで脱イオン水に溶解し、必要に応じて加熱または超音波処理します。300 nMで対比染色に使用してください。
解剖顕微鏡ZeissStemi 305
解剖ハサミF.S.T14558-09
ダルベッコの改変イーグル ミディアムジェンクローン25-500
ウシ胎児血清ジェミニ100-106熱不活性化
フィジー (フィジーはただのイメージです J)NIHバージョン 1.52i
ファインチップピンセットF.S.T11254-20Style #5
Fluorescence light sourceExcelitas012-63000X-Cite 120Q
GFAP antibodyCell Signaling3670SGFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom DishesMattek corporationP35G-1.5-14-C35 mm ディッシュ |No. 1.5 カバースリップ |ガラス径 14 mm |コーティングされていない
グレーフ鉗子F.S.T11054-10湾曲した先端を持つグレーフアイリス鉗子
酸性コンパートメント(後期エンドソームおよびリソソーム)を染色する緑色蛍光染料ライフテクノロジーL7526LysoTracker グリーン DND 26.DMSOSに1mMストック溶液にあらかじめ溶解しています。選択した増殖培地またはバッファーの最終使用濃度まで希釈します。
Hank's Balanced Salt Solution (10x)Gibco14065-056マグネシウムおよびカルシウムフリー
イメージングメディアLife TechnologiesA14291DJライブセルイメージングソリューション
倒立共焦点顕微鏡ZeissLSM 780
KymoToolBoxhttps://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagentライフテクノロジー11514015プラス試薬
リポフェクション試薬ライフテクノロジーズ 15338100リポフェクタミン LTX 試薬
オービタル振とうインキュベーターニューブランズウィックサイエンティフィック8261-30-1008イノーバ 4230 、温度と速度を制御できるオービタル振とうインキュベーター
ペニシリン/ストレポマイシン溶液 (100x)Gen Clone25-512
リン酸緩衝生理食塩水 (10x)Gen Clone25-507x
Poly-D-Lysine HydrobromideSigmaP7405、pH 8.5 のトリス緩衝液に 1mg/mL で溶解します。長期保存のために凍結してください。凍結と解凍のサイクルを避ける
血清培地の減少Gibco31985-062OPTI-MEM
組織培養フラスコオリンパス プラスチック25-20975 cm^2. 100% 角度付きネックアクセス、0.22um 疎水性ベントフィルターキャップ
組織培養インキュベーターThermo Scientific51030285HERAcell VIOS 160i、温度、湿度、CO2制御
を備えた組織培養インキュベーターTris-BaseSigmaT15038.402 g を 1 リットルに溶解し、4.829 g の Tris HCl を水に溶かして 0.1 M Tris バッファーを作製し、pH 8.5
Tris-HClSigmaT32534.829 g を 1 リットルに溶解し、8.402 g の Tris Base で 0.1 M Tris バッファー、pH 8.5
トリプシン EDTA (0.25%)、フェノールレッドGibco25200072
Vacuum-Driven Filter SystemsOlympus Plastics25-227を作製500 ml、PESメンブレン、0.22 µm
VannasハサミストレートロボズRS-5620
します ズ ズ は

参考文献

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