ここでは、マウスアストロサイトにおけるオルガネラの細胞内輸送と血漿膜タンパク質の取引を可視化するインビトロライブイメージング法について述べる。このプロトコルはまた、貨物輸送の旅程と運動学を決定するための画像分析方法論を提示する。
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方法論記事
アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
アストロサイトは、成人の脳の中で最も豊富な細胞型の一つです, 彼らは機能の多重性で重要な役割を果たしています.脳恒常性の中心的なプレーヤーとして、アストロサイトは重要な代謝産物と緩衝細胞外水、イオン、グルタミン酸をニューロンに供給します。「三分詞」シナプスの不可欠なコンポーネントは、アストロサイトもシナプスの形成、剪定、メンテナンス、および変調において重要です。これらの高度にインタラクティブな機能を可能にするために、アストロサイトは、細胞を含む多数の特殊な膜タンパク質を介して、他のグリア細胞、ニューロン、脳血管系、および細胞外環境と通信します。接着分子、アクアポリン、イオンチャネル、神経伝達物質トランスポーター、ギャップ接合分子。この動的フラックスをサポートするために、星状細胞は、ニューロンと同様に、緊密に調整され、効率的な細胞内輸送に依存しています。細胞内人身売買が広範囲に減少しているニューロンとは異なり、アストロサイトにおける微小管ベースの輸送はあまり研究されていない。それにもかかわらず、細胞膜タンパク質および細胞内オルガネラ輸送の外細胞および内嚢胞性人身売買は、アストロサイトの正常な生物学を調整し、これらのプロセスはしばしば病気または傷害に反応して影響を受ける。ここでは、高品質のマウスアストロサイトを培養し、目的の星状タンパク質および小器官を蛍光的に標識し、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いて細胞内輸送ダイナミクスを記録するための簡単なプロトコルを提示する。また、利用可能な画像解析ソフトウェア(ImageJ/FIJI)プラグインを使用して、取得したムービーから関連するトランスポートパラメータを抽出および定量化する方法についても説明します。
概要
アストロサイトは、成人中枢神経系で最も豊富な細胞であり、そこではユニークな発達および恒容性機能1を実行する。アストロサイトは、シナプス形成を促進する神経伝達物質受容体、トランスポーター、および細胞接着分子を含む三分詞シナプスの一部として、前および後の末端との直接接触を通じてシナプスの発達を調節するとニューロン-星状細胞通信2.さらに、アストロサイトはシナプス伝達を積極的に制御し、シナプス裂から興奮性神経伝達物質を迅速に除去し、神経伝達物質をリサイクルし、シナプス剪定に参加することにより、神経興奮毒性を防ぎます3,4,5,6.これらの非常にインタラクティブな機能を可能にするために、アストロサイトは、他のグリア細胞と、細胞接着分子、アクアポリン、イオンチャネルを含む特殊な膜タンパク質を介してニューロンと、自分自身の間で通信します。神経伝達物質トランスポーター、およびギャップ接接点分子。アストロサイトは、細胞内および細胞外環境の変動に応じて、これらのタンパク質の表面レベルを積極的に変化させる7.さらに、ミトコンドリア、脂質液滴、分解およびリサ....
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プロトコル
すべての動物の手順は、チャペルヒル動物ケアと使用委員会(IACUC)でノースカロライナ大学の承認を得て行われました。
1. 一次マウス星細胞の脳解剖と培養
注:以下のプロトコルは、マッカーシーとデベリス13、14、15によって開発された元の手順に従って、公開された方法から適応されました。マッカーシー/デベリス(MD)アストロサイトの混合細胞培養は、生後2−4(P2−P4)マウス皮質から調製され、抗有化因子で処理し、最終的に濃縮された星細胞培養物を得るために精製される。いずれかの性別のマウスの子犬からの4つの皮質は、1つのT75組織培養フラスコ培養を生成するのに十分である。
- T75フラスコの底部(100%斜めの首のアクセス、0.22 μm疎水性通気フィルターキャップ)をポリD-リジン(0.1Mトリスバッファーで1mg/mL、pH 8.5)でコーティングし、解剖開始前に24時間37°Cでインキュベートします。
- 解剖手順を開始する前に、アストロサイト培養培地の温かい30 mL(ダルベッコの修飾イーグル培地[DMEM]高グルコース、10%熱不活性化胎児ウシ血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)を37°....
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結果
上記で概説した一次マウスMDアストロサイトを確立するためのプロトコルは、再現性の高い高品質の培養物を生み出す必要があります。培養物は当初、アストロサイト、線維芽細胞、およびミクログリアおよびオリゴデンドロサイトを含む他のグリア細胞の混合物を含むが(図1Bi,Biv;赤い矢頭)、DIV5-DIV7間の混合培養物へのAraCの添加は最小化するこれらの汚染物質細胞の増殖。AraC処理と揺れベースの精製戦略を組み合わせることで、精製工程のみを含む従来のプロトコル(図1Bv;青)よりもアストロサイト培養の純度を豊かにします(図1Bv;青)。矢印)13.アラCまたは未処理で処理された精製星細胞培養物の期待形態および組成物(GFAPおよび4'、6-ジアミディーノ-2−フェニリンドール[DAPI]染色)を図1
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ディスカッション
ここでは、高純度一次マウス皮質MDアストロサイトにおけるタイムラプスビデオ顕微鏡を用いて、蛍光タグ付きオルガネラおよび目的の膜タンパク質を発現、視覚化、追跡する実験的アプローチについて説明する。また、粒子ダイナミクスを測定する方法論についても概説する。一次星状細胞におけるタンパク質および小器官ダイナミクスの直接可視化は、インビトロでこれらの細胞における細胞内輸送の調節を研究するための強力なツールを提供する。
上記のマウスMDアストロサイト培養を確立するための方法論は、他の公開プロトコル13、14、15からのステップを組み合わせたものであり、より単純な方法と高純度と品質の両方をもたらす文化。AraC15処理と振盪ベースの精製13、14の組み合わせは、98%(GFAP+細胞総細胞の比率によって評価される)と高い純度を有する星状細胞培.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
DNLは、シモンズ学者としてチャペルヒル(UNC)医学部のノースカロライナ大学によってサポートされました。TWR は UNC PREP グラント R25 GM089569 によってサポートされました。UNC神経科学センター顕微鏡コア施設を用いる研究は、NIH-NINDS神経科学センター支援助成金P30 NS045892及びNIH-NICHD知的発達障害研究センター支援助成金U54の助成を受け、一部支援を受けた。HD079124
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2.5% トリプシン (10倍) | Gibco | 15090-046 | |
| 卓上遠心分離機 | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 遠心分離機 |
| 細胞培養グレード Water | Gen Clone | 25-511 | |
| 細胞培養顕微鏡 | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 倒立スコープ、蛍光機能を備えた |
| 倒立組織培養顕微鏡シトシンアラビノシド | シグマ | C1768-100MG( | AraC) 凍結乾燥粉末を滅菌細胞培養グレードの水に溶解して10mMのストックを作り、分注して長期保存のために凍結 |
| DAPI | シグマ | D9542-5MG | 凍結乾燥粉末を最大濃度20mg/mlまで脱イオン水に溶解し、必要に応じて加熱または超音波処理します。300 nMで対比染色に使用してください。 |
| 解剖顕微鏡 | Zeiss | Stemi 305 | |
| 解剖ハサミ | F.S.T | 14558-09 | |
| ダルベッコの改変イーグル ミディアム | ジェンクローン | 25-500 | |
| ウシ胎児血清 | ジェミニ | 100-106 | 熱不活性化 |
| フィジー (フィジーはただのイメージです J) | NIH | バージョン 1.52i | |
| ファインチップピンセット | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm ディッシュ |No. 1.5 カバースリップ |ガラス径 14 mm |コーティングされていない |
| グレーフ鉗子 | F.S.T | 11054-10 | 湾曲した先端を持つグレーフアイリス鉗子 |
| 酸性コンパートメント(後期エンドソームおよびリソソーム)を染色する緑色蛍光染料 | ライフテクノロジー | L7526 | LysoTracker グリーン DND 26.DMSOSに1mMストック溶液にあらかじめ溶解しています。選択した増殖培地またはバッファーの最終使用濃度まで希釈します。 |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | マグネシウムおよびカルシウムフリー |
| イメージングメディア | Life Technologies | A14291DJ | ライブセルイメージングソリューション |
| 倒立共焦点顕微鏡 | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | ライフテクノロジー | 11514015 | プラス試薬 |
| リポフェクション試薬 | ライフテクノロジー | ズ 15338100 | リポフェクタミン LTX 試薬 |
| オービタル振とうインキュベーター | ニューブランズウィックサイエンティフィック | 8261-30-1008 | イノーバ 4230 、温度と速度を制御できるオービタル振とうインキュベーター |
| ペニシリン/ストレポマイシン溶液 (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | 、pH 8.5 のトリス緩衝液に 1mg/mL で溶解します。長期保存のために凍結してください。凍結と解凍のサイクルを避ける |
| 血清培地の減少 | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| 組織培養フラスコ | オリンパス プラスチック | 25-209 | 75 cm^2. 100% 角度付きネックアクセス、0.22um 疎水性ベントフィルターキャップ |
| 組織培養インキュベーター | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i、温度、湿度、CO2制御 |
| を備えた組織培養インキュベーターTris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g を 1 リットルに溶解し、4.829 g の Tris HCl を水に溶かして 0.1 M Tris バッファーを作製し、pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g を 1 リットルに溶解し、8.402 g の Tris Base で 0.1 M Tris バッファー、pH 8.5 |
| トリプシン EDTA (0.25%)、フェノールレッド | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | を作製500 ml、PESメンブレン、0.22 µm |
| Vannasハサミストレート | ロボズ | RS-5620 |
参考文献
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences<....
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