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方法論記事

水動紡錘摂動後のメタフェイズタイミングと細胞運命のダイナミクスを評価するライブ細胞イメージング

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DOI:

10.3791/60255

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2019年9月20日

 ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、スピンドル形成と人工的進行のダイナミクスを評価するプロトコルを提示する。当社のタイムラプスイメージングの応用により、ユーザーは、人芽細胞の様々な段階で細胞を同定し、人芽細胞の欠陥を追跡および同定し、抗マイト薬への曝露時にスピンドルダイナミクスと人工細胞の運命を分析することができます。

要約

ライブセルタイムラプスイメージングは、固定細胞分析によって見落とされたり、誤解されたり、誤解されたりする細胞プロセスに関する洞察を提供する細胞生物学における重要なツールです。固定細胞イメージングと解析は堅牢で、細胞の定常状態を観察するのに十分ですが、細胞レベルでイベントの時間的順序を定義する際に制限され、動的プロセスの一時的な性質を評価する能力が不十分です。水和性の進行。対照的に、ライブセルイメージングは、時間の経過とともに単一細胞レベルで細胞プロセスを観察するために使用できる雄弁なツールであり、固定細胞イメージングでは不十分に表現されるプロセスのダイナミクスをキャプチャする能力を有する。ここでは、クロマチンと微小管の蛍光標識マーカーを運ぶ細胞を生成するアプローチと、メタフェイズ染色体の整列と有形出口を監視するライブ細胞イメージングアプローチでの使用について説明する。人工的な様々な段階での細胞の同定、ミトシス欠陥の同定と追跡、紡錘のダイナミクスの解析など、スピンドル形成と人力の進行のダイナミクスを評価するイメージングベースの技術を説明し、人芽細胞の運命は、人工阻害剤による治療に続く。

概要

固定細胞の画像ベースの分析は、一般的に様々な摂動に応じて細胞集団レベルの変化を評価するために使用されます。細胞同期と組み合わせると、シリアルタイムポイントの収集とイメージングが続き、このようなアプローチを使用して、細胞配列のイベントを示唆することができます。それにもかかわらず、固定細胞イメージングは、時間的関係が集団に対して暗示され、個々の細胞のレベルで実証されないという限られたものである。このように、固定細胞イメージングと解析は、堅牢な型と定常状態の変化を観察するのに十分ですが、時間の経過に伴う一時的な変化や細胞の亜集団のみに影響を与える変化を検出する能力は不完全です。対照的に、ライブ細胞イメージングは、単一の細胞内の細胞および細胞集団内の細胞および細胞内のプロセスを、時間の経過とともに、それ自体が細胞行動に影響を与える可能性のある同期アプローチの助けを借りずに観察するために使用できる雄弁なツールです。1,2,3,4,5,6.

双極性人型のスピンドルの形成は、細胞分裂中の適切な染色体分離に不可欠であり、その結果、2つの遺伝的に同一の娘細胞が生じる。有人性スピンドル構造の欠陥は、有人性の進行を破壊し、染色体分離の忠実性を損なう可能性があり、壊滅的な細胞分裂と細胞生存率の低下をもたらす可能性があります。このため、スピンドル形成を変化させる有人毒は、癌細胞7、8、9の急速な増殖を制限する有望な治療法である。それにもかかわらず、有毒毒の添加後の紡錘構造の固定細胞分析は、スピンドル形成の動的過程を評価する能力に限られており、スピンドル構造の観察された変化が永続的であるか、またはあるかを示さないかもしれない代わりに一時的であり、成功した細胞分裂を可能にするために克服することができる。

このプロトコルでは、生細胞イメージングによるスピンドル摂動後のミトシスのダイナミクスを評価するアプローチについて述べた。RFPタグ付きヒストン2Bを発現するように設計されたhTERT不死化RPE-1細胞株を使用してクロマチンを可視化し、EGFPタグ付きαチューブリンと共に微小管、メタフェーズ染色体アライメントのタイミング、アナセ相発症、そして最終的には人体細胞の運命は、染色体の動き、圧縮、および核形態の視覚的手がかりを使用して評価される。

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プロトコル

1. RFP-ヒストン2B(RFP-H2B)およびα-チューブリン-EGFP(浴槽-EGFP)を安定して発現するhTERT-RPE-1細胞の生成

注:すべてのステップは無菌技術に従い、バイオセーフティレベルII+(BSL2+)安全キャビネットで行われます。

  1. 脂質ベースのトランスフェクション送達システムのメーカーの指示に従って、適切なレンチウイルスプラスミドを有する293T細胞のトランスフェクションにより、目的の遺伝子(α-チューブリン-EGFPおよびRFP-H2B)を運ぶレトロウイルスを生成する。
    1. 1日目:使い捨てガラスパスツールピペットを使用して、サブコンフルエント293T細胞のプレートから細胞培地を吸引し、PBSの5 mLを加えることによってリン酸緩衝生理食生(PBS)で残留培地を洗い流します。プレート底部にPBSを分配するために旋回し、その後、無菌使い捨てガラスパスツールピペットでPBSを吸引します。
    2. 予め温めた0.05%トリプシンの2mLを37°Cに加温し、37°Cの加湿インキュベーターに2~5分間CO2を入れ、細胞培養皿表面から付着細胞を放出できるようにします。
    3. トリプシンを含むプレートに10%の胎児ウシ血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した新鮮なダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)の8 mLを追加します。
    4. 穏やかにピペッティングして細胞を再懸濁し、無菌の15 mL円錐形チューブに懸濁液を移します。円錐形のチューブをバランスのとれた遠心分離機に入れ、室温で5分間161 x gで回転させ、細胞を穏やかにペレットします。
    5. ペレット細胞から培地/トリプシン溶液を吸引し、10%のFBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEMの10 mLで細胞を再中断する。ヘモサイトメーターを使用して、293T細胞懸濁液を数え、6ウェルプレートのウェルあたり2 x 106 293T細胞を数えます。
    6. ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)の総体積2mLの培養細胞は、10%のウシ血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充し、5%CO2で37°Cの加湿インキュベーターで維持する。
    7. 2日目:脂質系トランスフェクション送達試薬のピペット7μLと100μLの減らされた血清培地を1.5mLマイクロ遠心分離管に入れ、室温で5分間インキュベート(チューブ#1)。
    8. 別の1.5 mLマイクロ遠心分離管では、RFP-H2B発現ベクターのピペット1 μg(またはα-チューブリン-EGFP発現ベクターの1 μg)と、5 μLエンハンサー試薬(メーカーのガイドラインに応じて必要)、0.5 μg pMD2.G、および1μg psPAX2および100 μLの減少血清媒体(チューブ#2)。
    9. ステップ1.1.7とステップ1.1.8の内容物を慎重にチューブ#1にチューブ#2を配管し、室温で20分間インキュベートします。
      注:反応は、追加のウェル内の細胞のトランスフェクションのために必要に応じてスケーリングすることができます。
    10. 2mLの培地に293T細胞を含む所望のウェルに対するトランスフェクション反応を滴下し、5%CO2で37°Cで加湿インキュベーターに皿を戻す。
      注:RFP-H2Bとα-チューブリン-EGFPの両方を発現する細胞を生成するには、発現構築物ごとに別々のウイルスを生成する(ステップ1.1.7- 1.1.9)。
    11. 3日目:10%FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した新鮮なDMEMの2 mLで培地を吸引し、置き換えます。5%CO2で37 °Cで加湿インキュベーターに皿を戻します。
  2. 4日目:発現したウイルス粒子を含む培地を回収し、293T細胞を破壊または除去しないように注意する。5 mLシリンジに取り付けられた0.45 μMフィルターを通してウイルス粒子を含む培地をフィルタリングします。アリコウイルスは、4°Cでの短期保存、または-80°Cでの長期保存用です。
    注:この方法で得られたウイルス粒子は、~1 x 10 7〜1x108トランスデュース単位/mLの範囲で存在する。感染するウイルス産生細胞と細胞はいずれも同じ培地で培養されているので、培地を置き換えるウイルス濃度は不要であり、濾過されたウイルス粒子を細胞に直接感染させるために使用することができる。
  3. 種子2 x 105 hTERT-RPE-1細胞は、ウイルス感染に備えて6ウェル皿の井戸当たり。DMEMの2mLの培養細胞を10%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンで補充し、5%CO2で37°Cで加湿インキュベーターで維持する。
  4. 5日目:ヘキサジメトリン臭化物(例えば、ポリブレン)をhTERT-RPE-1細胞に8μg/mLの最終濃度に加える。500μLの細胞培養培地で希釈したウイルスの混合物で細胞に感染する。
    注:ヘキサジメトリン臭化物ストック溶液は、無菌蒸留水で調製され、0.45 μmフィルターを通して濾過される。
  5. 6日目:使い捨てガラスパスツールピペットを使用して、ウイルス感染細胞を含むウェルから培地を吸引する。細胞培養培地を10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMの2mL、プラスミドの統合および発現のために選択する抗生物質の適切な濃度に置き換える。
    注:記載の実験で使用されるα-チューブリン-EGFP発現プラスミドは、ピューロマイシン耐性遺伝子を運び、RFP-H2B発現プラスミドはブラシシジン耐性遺伝子を運ぶ。従って、10 μg/mLのピューロマイシンと2μg/mLのブラスチシジンが、hTERT RPE-1細胞を発現するα-チューブリン-EGFP、RFP-H2Bの選択に用いられる。選択に使用される抗生物質の濃度は、使用される様々な細胞株について異なる場合がある。
  6. 5〜7日間抗生物質選択の下で細胞を維持し、適切な選択試薬を含む新鮮な培地で3日ごとに培地を置き換える。
    注: セルは選択中にサブコンフルエンスで維持し、手順 1.1.1 から 1.1.4 に従って、必要に応じて展開する必要があります。
  7. タグ付き構成物の発現を確認するには、免疫蛍光イメージングを使用します。
    注: 必要に応じて、単一細胞クローンを導出して、細胞集団内で均一な発現レベルを得ることができます。安定したクローンが確認されると、抗生物質の選択がない場合に標準的な培養条件下で細胞を維持することができる。

2. 人工スピンドル摂動後の生細胞イメージング用細胞の調製

注: 無菌技術を使用し、BSL2 安全キャビネットで手順を実行します。

  1. 無菌使い捨てガラスパスツールピペットを用いて、発現物組を運ぶ細胞株を含む培養板から培地を吸引する(ステップ1.7から)。無菌PBSの10 mLで細胞を簡単に洗浄します。プレート底部にPBSを分配するために旋回し、その後、無菌使い捨てガラスパスツールピペットでPBSを吸引します。
  2. 10cmプレートに0.05%トリプシンの2 mLを加えます。2~5分間、または細胞がプレート表面から切り離されるまで、37°Cでプレートをインキュベートします。
  3. トリプシンを含むプレートに8mLの新鮮な培地を加えます。穏やかにピペッティングして細胞を再懸濁し、無菌の15 mL円錐形チューブに懸濁液を移します。円錐形のチューブをバランスのとれた遠心分離機に入れ、室温で5分間161 x gで回転させ、細胞を穏やかにペレットします。
  4. 慎重に上清を吸引し、10 mLの血清ピペットで穏やかにピペッティングすることにより、PBSの10 mLで再中断します。円錐形のチューブをバランスのとれた遠心分離機に入れ、室温で5分間161 x gで回転させ、細胞を穏やかにペレットします。
  5. 慎重に上清を吸引し、10 mLの血清ピペットで穏やかにピペッティングすることにより、新鮮な媒体の10 mLで再中断します。
  6. 細胞をカウントし、次いで血球計を用いて細胞数を計算し、細胞培養培地中の1-2 x 105細胞/mLの濃度に希釈する。無菌12ウェルイメージング底板の各ウェルに細胞懸濁液の種子500μL。細胞培養インキュベーターにプレートを入れ、細胞がプレート表面に付着できるようにします。
    注:ライブセルイメージングでは、画像集録中にイメージングプレーンに関連付けられたままにしておく必要があります。細胞が次のめっきに付着するのに必要な時間の持続時間は、ある細胞株から次の細胞株に異なる場合があり、研究対象の細胞株に最適化する必要があります。
  7. タイムラプスイメージングを始める前に最大30分、細胞を播種した1つ以上のウェルに有する有価有量の有価濃度を加える。有機溶媒が細胞行動に及ぼす潜在的な影響を考慮に入れるため、阻害剤の希釈剤の量を対照として細胞に加えます。例えば、糸くずキナーゼオーロラAの特異的阻害剤の100nMの添加が、同量のDMSOと平行していることを確認し、この薬剤の希釈剤は、細胞のコントロールウェル内にある。
    注:水動性進行における動的変化の比較分析では、実験条件と並行して正常なツトースのイメージングを可能にするために、摂動がない場合に細胞の井戸を調製する必要があります。

3. RFP-H2B、α-チューブリン-GFP発現細胞のタイムラプスイメージング用に設置された顕微鏡(図1、図2)

  1. RFP-H2Bを含む細胞培養プレートを配置し、hTERT RPE-1細胞を発現するα-チューブリン-GFPを、高解像度カメラ(20xで0.67μmのピクセルサイズ)を搭載した反転上蛍光顕微鏡上に適切なステージインサートに画像化し、環境室は37°Cに予熱し、加湿された5%CO2のための配達システム。
    注:密閉された環境室または温度制御段階の挿入物は、加湿5%CO2を提供し、得られる安定した温度制御を提供することができる場合に適していてもよい。
  2. 0.5の数値絞りを持つ20倍の空気目的を使用し、高コントラスト蛍光と位相コントラストまたはブライトフィールドイメージング用に装備されています。位相コントラストまたは明るいフィールドを持つ細胞を表示し、顕微鏡のコースと細かい焦点を調整して細胞に焦点を合わせます。
  3. 画像化される蛍光色素に対して適切な励起と発光を持つそれぞれのフィルタキューブを選択して、ブライトフィールド、GFP、RFP画像集録に最適な露光時間を特定して設定します。または、自動露出ボタンをクリックして、所定の露光時間を入力します。信号が十分に強くない場合は、[ピクセルビニング] を選択して、[ビン分割]タブをクリックし、ドロップダウン メニューから2 x 2 ピクセルのビニングを選択して、露出時間を短縮します。
    注:光毒性は、有線の進行および細胞の生存率を損なう可能性がある。コントロール集団における配合細胞の障害は、通常のマイトスを完了するために、露光時間および/またはイメージング期間をさらに最適化する必要があることを示している可能性があります。
  4. マルチ座標、マルチウェルイメージングを同時に取得し、画像取得のパラメータを定義する集録および解析ソフトウェアを使用します。
    1. メーカーの指示に従って、顕微鏡ステージをマルチウェル皿に選択して校正します。画像取得ソフトウェアを使用して、使用されているプレート形式の図の関連する井戸をクリックして、画像化されるウェルを強調表示または選択します。
    2. [生成ポイント]コントロール パネル (図 2)の下で、[ポイント配置]タブをクリックし、[ポイント配置]タブをクリックし、定義済みまたはランダムな座標の配置を選択してイメージされる各ウェル内の座標を定義します。ドロップダウンメニュー。[作業領域]タブを選択し、[ドロップダウン] メニューから[制限]を選択して、ウェルの境界を除外する座標選択領域を制限します。[カウントと分布]タブをクリックして、それぞれウェルごとにキャプチャするポイントの数と分布を選択します。
      注: 5 分のタイムポイントの増分内でウェルごとにイメージできる座標の数は、イメージするウェルの数と各チャンネルの露出時間によって制限されます。典型的には、ウェル当たり5〜8座標は、4時間以内に人芽細胞を介して進行する各条件で少なくとも50個の細胞を観察するのに十分である。
    3. TimeSequenceコントロール パネルで値をクリックして入力して画像を収集するには、時間間隔と期間を選択して入力します。
      注:1~5分ごとに画像を取得することは、水動語の進行のダイナミクスを監視するのに適しています。イメージングの全体的な持続時間は、細胞株の所望のエンドポイントおよび増殖速度を反映する必要があります。例えば、4時間は多くの細胞が人芽細胞を通して進行するのを見るのに十分であり、16時間は、人芽細胞を介して非同期集団の進行におけるほとんどのRPE-1細胞を見るのに十分である。

4. 経位相タイミングと、ツチメスピンドル摂動後の水位細胞の運命を決定するタイムラプス画像解析

注:画像集録ソフトウェア(材料表)、ImageJ、または同等の画像解析ソフトウェアを使用して画像解析を実行します。

  1. RFPフィルタキューブで撮影した画像を選択して、RFP-H2Bラベルのクロマチンを可視化します。初期クロマチン圧縮(図2C、青い矢印)と核エンベロープ分解(α-tubulin-EGFPが核境界によって除外されなくなった場合)によって示される、人芽細胞に入る細胞を特定する。
  2. 個々の細胞におけるメタフェイズアライメントとアナセズ発症の点数タイミングを決定する:取得したムービーの連続したタイムポイントを通してセルを追跡し、RFP-H2B標識クロマチンまでの点数/分数を決定するメタフェーズ中のセル赤道での位置合わせを完了します(図 2C、黄色の矢印)。
  3. 有線のタイミング、有線忠実度、および細胞の運命を監視するには、連続したタイムポイントを通じて細胞を追跡し続け、アナフェイズ染色体の分離が明らかな時間座標を特定します(図2C、白い矢印)。クロマチンの非コンパクションと核封筒の改変(核からのチューブリン排除によって示される)が起こった場所。
    注:スピンドルアセンブリまたはミトチック進行における摂動は、双極性点線スピンドルを得て完全な染色体アライメントを達成するか、またはアナフェーズ染色体分離を完了するために必要な時間の関数として評価することができる。
  4. RFP-H2Bを可視化し、アナフェイズ染色体分離中に遅れ染色体やクロマチン橋などのミトチック欠陥を示す各集団の細胞を同定する。
    注:妥協された人工的な忠実度はまた、多核または微核化された娘細胞をもたらし、図3のように、細胞ポストの細胞で視覚化することができる。

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結果

紡錘摂動の存在下での水疱性進行の評価
スピンドル極集の調節は、適切な双極スピンドル形成に不可欠なステップです。タンパク質枯渇、薬物阻害、またはセントロソーム数の変化を介したこのプロセスにおける破壊は、紡錘構造を破壊し、有人進行を遅延または停止させる10、11、12、13。それにもかかわらず、一部の摂動は、最終的にアナフェイズ染色体分離14を完了するために人体を介して進行する細胞とのスピンドル形成を一時的に遅らせるだけである。細胞同期アプローチが存在しない場合、その過程自体が間接的に有人プロセス1、2に影響を与える可能...

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ディスカッション

タイムラプスイメージングによって提供される時間分解能は単一細胞内の連続した細胞事象の視覚化および評価を可能にする。細胞同期を利用したアプローチは、連続した時点での細胞の収集と固定に続くアプローチは、最終的に細胞の集団間で比較が行われるために制限される。摂動に対する細胞応答が不均一であるか、または視覚化されるプロセスが動的である状況では、生細胞のタイムラプスイメージングは、単一細胞のダイナミクスと不均一性の両方を追って分析する能力が優れています。細胞集団内で。このように、タイムラプスイメージングは、有人化の動的段階を通じて細胞の進行を監視し、この進行に対する摂動が最終的に有分裂細胞分裂およびその後の細胞運命の忠実性にどのように影響するかを評価するのに特に有用である。

生細胞イメージングには多くの利点がありますが、可能な限り考慮して軽減する必要がある重要な課題が関連しています。1つの課題は、イメージング中に細胞の生存率と増殖を確保するために、適切な環境条件を維持することです。これを達成するために、イメージングセットアップには、温度とCO2の両方を調節する環境室を含める必要があ...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

DLM は NSF GRFP によってサポートされます。ALMは、生物医学研究の卓越性のためのスミス家族賞からの資金によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.05% トリプシンGibo-Life sciences25-510A セリンプロテアーゼ 培養皿から付着細胞を放出するために使用される
15ml 遠心分離管Olympus Plastics28-101
20x CFI Plan Fluor 対物レンズ ニコン明視野と蛍光の両方を可視化する生細胞イメージング
293T細胞ATCCCRL-3216レトロウイルストランスフェクション用; ステップ1.1で使用
a-tubulin-EGFP addgenevarious numbersExpression vector for alpha tubulin for a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors
AlisertibSelleckchemS1133Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentrationは、DMSO中に10mMで調製され、100nMの最終濃度で使用される。
BlasticidinInvitrogenA11139-03抗生物質選択剤; a-tub-EGFP発現細胞の選択に使用
C02エアガス細胞培養およびライブセルイメージングに使用
Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)Chroma49005シングルバンドフィルターセット; 励起波長545nm、帯域幅25nm、波長605nm、帯域幅70nm、H2B-RFP
の可視化Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)Chroma49002シングルバンドフィルターセット; 励起波長 470nm と 40nm 帯域幅、波長 525nm と 50nm 帯域幅; GFP-tubulin
使い捨てガラス パスチュアーピペットの可視化、滅菌済み フィッシャーサイエンティフィック13-678-6A吸引細胞用 
ダルベッコs Modified Eagle Medium (DMEM)Gibo-Life sciences11965-084RPE-1および293T細胞の増殖用細胞培養培地
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibo-Life sciences10438-026Cell culture culture medium supplement
Lipofectamine 3000 and p3000InvitrogenL3000-015Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4
Multi well Tissue Culture dishes細胞培養、トランスフェクション/感染、およびライブセルイメージングに使用するためのコーニング各種
ニコンTi-E顕微鏡コン生細胞イメージングに使用する倒立脱射蛍光顕微鏡
NIS Elements HC Nikonバージョン 4.51画像取得および解析ソフトウェア; セクション 3 & 4 で使用
OPTI-MEMGibo-Life sciences31985-070細胞トランスフェクション用の還元血清培地; ステップ 1.1.3
ペニシリン/ストレプトマイシンで使用 Gibo-Life sciences15140-122細胞培養培地で使用される
抗生物質 リン酸緩衝液 生理食塩水 (PBS)Caisson labsPBP06-10X1LT無菌生理食塩水 細胞培養用
pMD2.GAddgene12259レンチウイルス VSV-G エンベロープ発現コンストラクト; ステップ 1.1.4
で使用 PolybreneSigma-AldrichH9268ウイルス感染効率を高めるために使用されるカチオン性ポリマー。ステップ 1.1.10
で使用 psPAXAddgene12260第 2 世代レンチウイルスパッケージングプラスミド; ステップ 1.1.4 で使用
PuromycinInvitrogenant-pr-1抗生物質選択剤; RFP-H2B 発現細胞の選択に使用
RFP- ヒストン 2B (H2B)Addgeneさまざまな番号赤色蛍光タンパク質タグ付きヒストン2Bの発現ベクター;生細胞イメージングにおけるクロマチンの可視化に使用するため: Addgeneおよび他のベンダーを通じて市販
RNAi MaxInvitrogen13778-150siRNAコンストラクトRPE-1細胞のトランスフェクションのための脂質ベースのトランスフェクション試薬
ATCCCRL-4000ヒト網膜色素上皮細胞株
組織培養皿 100x20mmコーニング 接着細胞の培養に使用する353003
Zyla sCMOSカメラ ニコンカメラは、細胞の画像を取得するために使用されます
用 ニマイクロスコープに取り付けられた

参考文献

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水動紡錘摂動後のメタフェイズタイミングと細胞運命のダイナミクスを評価するライブ細胞イメージング
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