標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮

サマリー

ここでは、標準的な実験装置を用いて不連続な牛血清アルブミン密度勾配を用いて、成人マウス精巣からパチテン精子細胞、円形精子細胞、および細長い精子を濃縮するためのプロトコルを提示する。

要約

精子形成の各ステップを特徴付けるために、研究者は精巣から生殖細胞の異なる亜集団を分離する必要があります。しかし、成人精巣は、体細胞の特定の集団と一緒に精子形成のすべてのステップから生殖細胞の複雑な組み合わせを含んでいるので、離散集団を分離することは困難です。過去数十年にわたり、遠心溶離、蛍光活性化細胞選別(FACS)、STA-PUTなどのさまざまな技術が生殖細胞の単離にうまく応用されてきました。欠点は、彼らはすべて専用のデバイスと専門的なトレーニングを必要とすることです。STA-PUT法の基礎となる原理に従って、パチテン精子細胞、丸精子、およびマウス精巣からの細長い精子の単離のための簡単なプロトコルが開発されました。精巣細胞の単一細胞懸濁液を調製した後、特定の細胞集団は、不連続な牛血清アルブミン(BSA)密度勾配を介して重力堆積によって濃縮される。その後、細胞分画を手動で収集し、顕微鏡的に分析します。ラウンド精子(MDR)堆積プロトコルのためのこの修正密度勾配は、標準的な実験装置のみを必要とするため、広く適用することができます。さらに、プロトコルは最低の出発材料を必要とし、実験動物のコストおよび使用を減らす。

概要

哺乳類の精子形成の間に起こる分子および生物学的事象について多くはまだ知られていないが、精子幹細胞が高度に特殊な^精子1、2に変換する複雑なプロセスである。精子形成は精巣の半卵管内で起こる。管管には、分化の各段階から生殖細胞の混合物が含まれています, 精子幹細胞を含む, ミトチック分割精子を分割, マイオティック精子細胞, およびポストメイオティック精子 (ラウンドからハプロイド分化を受ける)精子を伸ばして精子を伸ばし、最後に成熟した精子にする)。精巣の体細胞には、半卵管内の生殖細胞と混ざり合うセルトリ細胞、管の壁を形成する周腸筋細胞、および管の間の間質空間におけるテストステロン産生ライディグ細胞が含まれる。

精子形成時に分子および生化学的プロセスを研究するには、精巣細胞の複雑な混合物から異なる生殖細胞集団を分離する必要があります。細胞濃縮のために多くの異なる戦略が開発されています。.最も成功した方法は、単位重力3、4、5、6によるSTA-PUT速度堆積、カウンターフロー遠心^分離7、8に基づく遠心溶出、DNA含有量および/または特定のマーカーに応じて細胞を分離する蛍光活性化細胞選別(FACS)。これらの方法は、精子形成研究者の間で一般的に使用され、特定の生殖細胞型の効率的な濃縮を可能にします。ただし、これらの手法には、専門知識を必要とする特殊で高価なハードウェアが必要です。

ここでは、マウス精巣の3つの最も豊富な細胞集団の濃縮された集団を分離するための簡単で安価なプロトコルです:円形精子、パチテン精子細胞、および細長い精子。このプロトコルは、ラウンド精子(MDR)の修飾密度勾配と呼ばれ、ラウンド精子を濃縮するために特にうまく機能するためである。MDRの方法はSTA-PUTの速度の堆積と同じ原理に基づいているが、それは標準的な実験室装置だけを要求する。生きている細胞は、手動で調製された不連続な牛血清アルブミン(BSA)密度勾配を通して、地球の重力場の下の標準的な50 mLチューブ内で堆積物を許可する。大きな細胞は、生殖細胞の異なる集団を分離するグラデーションを通ってより速く移動します。堆積後、3つの細胞タイプの濃縮分画を手動で収集する。これらの濃縮細胞集団の純度は、STA-PUTおよび遠心溶出によって得られたものに匹敵する。

速度堆積のためのBSA勾配の構築および使用をカバーすることに加えて、プロトコルはまた、精巣細胞を精巣の管から放出する消化方法についても説明する。プロトコルは、Romrell^ら9によって開発されたものから変更され、コラゲナーゼIVとトリプシンとの順次消化を含む。重炭酸塩バッファーの使用と組み合わせた順次消化(すなわち、Krebs溶液)は、生殖^細胞9の分離および生存率を大幅に高めることが示されている。

MDR濃縮の間、細胞は半卵管の環境の外で約4時間一緒に過ごし、ストレスの多い機械的力を受け入れられていないため、下流分析のために非常に実行可能な細胞画分の収集が可能になります。さらに、遠心溶出およびSTA-PUTと同様に、MDRプロトコルは細胞の化学処理または標識を必要とせず、生存率を維持するのにも役立ちます。重要なのは、MDR単離には2つの成体マウス精巣がわずかで十分であるため、1匹の成体マウスはRNAとタンパク質分析の両方に十分な濃縮細胞を提供する。標準的なSTA-PUTプロトコルは、細胞単離6のために12匹の成体マウスの使用を推奨^する。しかし、以前の経験に基づいて、成功した単離は3〜4匹の成体マウスから行うことができることが知られている。遠心溶出に十分であると報告された出発物質の最も少ない量は、6匹のマウス精巣(3匹の^マウス)8である。したがって、高価な特殊な装置の必要性を排除することに加えて、MDRプロトコルは必要な実験動物の数を減らす。

プロトコル

実験マウスおよびすべての実験の維持は、実験動物のケアおよび使用に関する関連ガイドラインおよび規則に従って行われた。

1. 機器・試薬のセットアップ

1. 水風呂を37°Cに設定します。
2. 細胞培養インキュベーターを34°C、5%CO2、95%の湿度に設定します。チューブローターをインキュベーターの中に入れます。
   注:インキュベーターは内部温度を変えるために長い時間を必要とする。インキュベーターが常に34°Cに設定されていない場合は、実験の1日前に1つを設定します。
3. 顕微鏡ガラススライドの適切な量を準備し、ラベルを付けます。グリースペンで直径約1cmのリングを描き、グリースを乾かします。
4. 1xクレブスバッファ、pH 7.8(表1)を準備します。ステップ2.5−2.8のために予め暖めるために1x Krebsの50 mLの2つの円錐形の管を34 °Cに置く。残りの1xクレブスを4°Cまたは氷の上に保管してください。
5. BSA ソリューションを準備します。まず、1x Krebsバッファで2.5gのBSAを25mLの最終容積に溶解することにより、クレブスで10%(w/v)BSA溶液の25 mLを調出します。1x Krebsバッファーで10%BSA溶液を希釈し、異なるBSA濃度を得る(表2)。すべての BSA ソリューションを 4 °C に保ちます。
   注:手順の同じ日に溶液を準備し、使用するまで4°Cで保存します。
6. トリプシンとコラゲナーゼの正しい量を50mL円錐管に計量して消化酵素を調製する(表3)。

2. 生殖細胞懸濁液の動物解剖と調製

注:完了までに約 1 時間かかります。

1. 成体の雄マウス(7歳以上、精巣は、子宮頸部脱臼_またはCO2窒息を介して80−120mgの重量を量る)を犠牲にする。
2. 70%のエタノールでマウスの腹部腹部をスプレーします。はさみを使って腹部の空洞を開き、V字型の開口部を作ります。
3. 鉗子で精巣の脂肪パッドを引っ張って、精巣を見つけ、はさみでそれらを取り除きます。チュニカアルブギネアを邪魔しないでください。1xクレブスを含む6 cmペトリ皿に精巣を置きます。
4. 精巣を解凍し、チュニカアルブギネアを廃棄します。鉗子でそれらをそっと引き離すことによって、わずかに半精細管を分散させる。
5. 鉗子を使用して、新たに調製されたコラゲナーゼ溶液の2 mLを含む50 mL円錐管に半精管を移す(表3)。
6. 37°Cの水浴で管を3分間インキュベートし、チューブを揺らして優しく攪拌します。
   注:自由に浮遊する管は間質細胞の除去のために3分以内に起こるべきである。精巣細胞の生理的温度は34 °C;したがって、長い消化は通常、この温度で行われます。しかし、短い3分の消化は37 °C(製造業者によって推奨される温度)で行うことができる。34 °Cを使用する場合は、消化時間を再最適化する必要があります。
7. 暖かい1xクレブの少なくとも40 mLを追加し、室温(RT)で沈砂(〜1分)に管を許可します。上清を取り出し、1xを繰り返します。
8. 作りたてのトリプシン溶液(表3)の25 mLを加え、34°Cインキュベーター内のチューブ回転子にチューブを置き、15−20分(〜15rpm)インキュベートします。散発的に管の状態を確認します。溶液が曇り、小さなチューブだけが残ったら、チューブを氷の上に置き、すぐに次のステップに進みます。
   注:過消化と細胞リシスを避けるために、次の洗浄手順に迅速に移動します。いくつかのプロトコルは、胎児ウシ血清(FBS)によるトリプシンの不活性化を含む。このプロトコルでは、FBS治療は省略され、代わりに、トリプシンは即時遠心分離によって除去され、その後の冷たい1xクレブで洗う。
9. 40 μmセルストレーナーを通して溶液を氷上の新しい50 mL円錐管に濾過します。
10. 遠心分離機600 x gを4°Cで5分間ペレットする。
    注:力が強すぎると遠心分離が細胞に害を与える可能性があります。
11. 慎重に注いで上清を取り除きます。
12. セルペレットをタップして、1xクレブスの残りの部分で細胞を再中断します。
13. 再懸濁した細胞に少なくとも40 mLの冷たい1xクレブスを加える。
14. 手順 2.10 と 2.11 を繰り返します。
15. 細胞ペレットでチューブをタップして、細胞を再サスペンドします。1xクレブスに0.5%BSAの1 mLを追加し、カットピペット先端で溶液を上下にピペッティングしてセルを再中断します。気泡を作ることを避けてください。
16. 最後に、最終容積が~3 mL になるように、1x クレブスに 0.5% BSA の 1−3 mL を追加します。40 μmセルストレーナーを介して生殖細胞懸濁液を濾過し、BSA勾配に細胞をロードするために直ちに進みます。

3. 不連続BSA勾配による生殖細胞の分離

注:このセクションが完了するまでに約 2 時間かかります。洗浄ステップ(ステップ2.10−2.14)中に不連続なBSA勾配の準備を開始し、前処理の準備が整い次第、細胞をロードします。

1. チューブの片側を見ることができるように、氷の上に垂直に50 mLチューブを収容します。または、4 °Cのコールドルームでプロトコルを実行し、その場合は氷は必要ありません。
2. 先端から10mLの血清ピペットの先端を約5−10mm切り取り、より大きな絞りを得る(図1A)、ピペットコントローラ(図1C)に取り付けます。
   注:これにより、ピペッティング中の速度が低下し、さまざまな BSA ソリューションの積み重ねが容易になります。または、滑らかなピストンを持つ1 mLの機械ピペットを使用し、直径約3mmの開口部でピペットの先端を切断します(図1B)。
3. 50 mLチューブの底部に5%BSA溶液の5 mLをピペッティングから始めます。
4. 5%溶液の上に4%BSA溶液の5 mLをゆっくりとピプトする。ピペットのカット先端で5%溶液の表面に優しく触れ、2つの溶液を重ね、慎重に表面との接触を維持し、ピペットの先端が浸漬しないようにします。
   注:この手順の最後に、2 つのレイヤー間に明確な線が表示される必要があります。
5. 他の BSA ソリューションと共にステップ 3.4 を繰り返し、5% から 1% までの不連続な勾配を得ます (図 1D)。
6. グラデーションの上に、邪魔することなく、単一セルサスペンションを慎重にロードします。4°Cまたは氷の上で1.5時間の勾配を通して細胞を堆積させてください。

4. 濃縮生殖細胞画分の収集

注:このセクションの所要時間は約 30 分です。

1. 1 mL ピペット先端を 1 mL のメカニカル ピペットに取り付け、開口部が直径約 3 mm であるように先端を切ります (図 1B)。
2. BSA勾配の上から始まる別々の1.5 mLチューブに~1mL分画を慎重に収集し、氷の上に保管します。分数と同じ順序でチューブに番号を付けます。
   注:この時点で、細胞懸濁液を含む一連の〜28本のチューブが存在する必要があります。滑らかなピストンと1 mLの機械ピペットを使用し、BSAの勾配を乱すリスクを最小限に抑えるためにピペットの先端をカットします。
3. 生殖細胞の画分を600xgで遠心分離し、4°Cで10分間使用します。
4. ペレットを邪魔しないように注意し、上清のほとんどを廃棄し、チューブをフリックして細胞ペレットを再懸濁させます。各チューブに1mLの氷冷1xクレブスバッファを追加し、遠心分離を繰り返します。
   注:BSA がダウンストリーム解析に干渉する場合は、洗浄手順を繰り返します。
5. 上清の大部分を廃棄するが、最終洗浄後に~100μLを残す。細胞ペレットを慎重に再中断します。
   注:細胞を慎重に再中断すると、この溶液から採取されたサンプルが与えられた分数のすべてのセルを表していることを確認します。スライドを準備しながら、氷の上にセルサスペンションを保持します。

5. 細胞画分の解析

注:分析が完了するまでに 2 時間かかります。

1. 一度に1つずつ、番号付き顕微鏡スライド上の各グリースペンリング内に4%パラホルムアルデヒド(PFA)のピペ20 μLを含む。
2. 直ちに、対応する分画から再懸濁した細胞懸濁液の2 μLを加える。分数ごとに繰り返します。
   注:スライドの準備中は、すべてのセルサスペンションを氷の上に保管してください。
3. RTでスライドを1時間から一晩(O/N)乾燥させます。
   注:このステップでは、各画分からサンプルを採取した後、セルをダウンストリーム分析または保存用に処理することができます(セクション6)。
4. スライドを1x PBSで一度すすいで、4',6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)(材料の表)で取り付け媒体で取り付けます。
5. 蛍光顕微鏡下のスライドを分析し、各画分でどの特定の生殖細胞タイプが濃縮されているかを推定します。
   注:異なる細胞型は、DAPI染色によって可視化された特徴的な核形態によって認識することができる。図 2Aは、細長い精子、丸精子およびパチテン精子細胞で濃縮された代表的な分画を示す。丸い精子核は小さく(直径6~7μm)、丸い(図2A)。マウス丸精子核はまた、クロモセンターと呼ばれる単一の丸いヘテロクロマチン構造によって特徴付される。細長い精子の核は、典型的な細長い形状を持ち、クロマチン凝縮による核サイズの減少を示す(図2A)。パチテン精子細胞核は、はるかに大きく(直径10μm以上)、より不規則な形状であり、密に詰められたクロマチンの領域が全体に分布している(図2A)。
6. 必要に応じて、異なる細胞型の認識をサポートするためにDAPI染色に加えて免疫染色を行う。
   1. この場合、グリースペンリング内に固定液(PBSでは4%PFAおよび0.1%のニオニオン界面活性剤)の20μLで2μLの細胞懸濁液を広げます。スライドを乾燥させた後、RTで10分間4%のPFAで細胞を接頭辞を付けた。
   2. PBSですすし、次いでPBSで0.1%のニオニオニック界面活性剤を5分間透過し、100 mM NH₄Clでスライドを5分間インキュベートして残りのPFAを無効にする。
   3. PBSですすいで、特定の一次抗体およびフルオロクロム標識二次抗体によるブロッキングおよびインキュベーションからなる標準的な免疫蛍光プロトコルに進みます。DAPI(材料の表)でアンチフェードマウントでスライドをマウントし、24時間に設定することができます。
      注:一次抗体インキュベーションに有用なマーカーの例としては、アクロソームを丸く細長い精子で染色するピーナッツアグルチニン(PNA;ブロッキング溶液中の1:2,000)、単一の標識を付加する抗DDX4抗体(ブロッキング溶液中の1:200)が挙まれる。丸精子中の細胞質顆粒、およびパチテン精子細胞内の性体を認識する抗γH2AX抗体(ブロッキング溶液中1:100)。分画の免疫蛍光分析の例については、代表的な結果と図2C,Dを参照してください。

6. ストレージの残りのサンプルの処理

注:セクション6は完了までに約20分かかります。

1. 各画分のサンプルを顕微鏡スライド用に採取したら、各画分に1mLの氷冷1x Krebsを加え、細胞を600−13,000 x gで10分間遠心分離し、4°Cで10分間使用します。
   注:低速遠心分離は緩いペレットを生み出し、1x Krebsを完全に除去することは困難ですが、高速遠心分離は細胞に害を与える可能性があります。ダウンストリーム プロトコルの特定の要件に従って遠心分離速度を選択します。
2. 上清を取り除いて廃棄し、優先する下流分析を続けます。
   注:この時点で、細胞は液体窒素中でスナップ冷凍し、-70°Cで保存することができます。この技術に慣れたら、直接好みの下流プロトコルを続行することは可能ですが、常にサンプルを採取し、各画分の純度を確保することをお勧めします。全RNAは、逆転写性ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびRNAシーケンシングなどの方法によって抽出、定量、および分析することができる。全タンパク質抽出物は、免疫沈殿またはウェスタンブロッティング分析を行うことができるから調製することもできる(図3)。

結果

生殖細胞型の十分な濃縮は、通常80%6を超えると考えられる。MDRプロトコルは、ラウンド精子を豊かにするために特にうまく機能します。この技術を用いて、90%の純粋な丸い精子の数が多く、日常的に得ることができます。パチテン精子細胞および細長精子の最適な画分は、それぞれ〜75%および〜80%に濃縮される。伸長精子は、勾配の上にとどまる傾向があり、最初の分数で収集されます。図示された実施例では、画分1は細長い精子の約80%を含有していた(図2B)。この技術で得られたほとんどの伸長精子は核を凝縮しているが、凝縮されていない早期細長精子は乏しい(図2A)。以下の分数は、濃縮された丸精子を含む。この例では、丸精子の濃縮は分数2、3、および4で90%以上であり、80%以上の濃縮は7分画(2−8)で完全に見られた(図2B)。その大きなサイズのために、パチテン精子細胞は、より速く堆積物を収集し、最後に収集されます。精製例では、濃縮は分数14および15で約75%であった(図2B)。

核形態は、DAPI染色によって可視化されるが、通常は細胞の認識に十分であるが、免疫蛍光分析は分析をサポートするために行うことができる。PNAは、円形および細長い精子の発達アクロソームを染色し、アクロソーム外観は、分^化10のステップ1−8にラウンド精子をさらに分類するために利用することができる。PNA染色された細長さと丸い精子を区別することは、核形状の違いに依存する(図2C、左パネル)。抗DDX4抗体は、各ラウンド精子の細胞質において、単一のDDX4陽性周核顆粒、クロマトイド体(CB)を可視化するので、丸精子画分分に有用なマーカーである。このCB特異的染色は、精子細胞細胞におけるより広く分布する細胞質染色と区別しやすい(図2C、中間パネル)。パチテン精子細胞は、第1のマイオティック分裂のパチテン相に特異的に現れる核性体に標識する抗γH2AX抗体によって認識することができる(図2C、右パネル)。この精製において、PNA染色は、MDR濃縮ラウンド精子画分分が分化の様々なステップで丸精子の混合物を含んでいたことを明らかにし、その全てにそのシグネチャ構造、DDX4陽性CB(図2D、RS分数)。抗γH2AXは、分数16(図2D、PSpc画分)における濃縮パチテン精子細胞をさらに検証した。

細胞計数は、円形精子およびパチテン精子細胞画分の細胞数が様々な下流分析に十分であることを明らかにした。円形精子画分画(5−8)はそれぞれ2.5 x 10^6細胞の周りに含まれていた。したがって、これらの画分をプールすることにより、1000万個以上の細胞を得ることができる。パチテン精子細胞画分(14および15)は、通常、やや少ない細胞を含んでいた。この単離では、分数あたり約1.5−2.0 x 10^6細胞をカウントした。最初の分画は0.75 x 10⁶細長い精子を含んでいた。

図3Aに示すように、大部分の画分から得られた総RNA量は0.5~2.5 μgの範囲であり、これは、逆転写PCR、RNAシーケンシング、またはゲル上のRNAの可視化などの下流RNA分析に十分である。各画分から得られるタンパク質の量は、通常、20−140 μg(図3B)の範囲であり、これはいくつかのウェスタンブロットに対して十分である。採取した画分から全細胞溶離物を調製し、ウエスタンブロット分析は、パチテン精子細胞および丸精子およびユビキタスで高発現されたDDX4、PIWIL1、およびPIWIL2を検出する抗体を用いて行われた。発現グリセラルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)。

このプロトコルでは、単一画分に由来するタンパク質の10%が、標準的なウェスタンブロット設定上でこれらのタンパク質をすべて明確に検出するのに十分であった(図3C)。1分の1のタンパク質の量は、PIWIL1に対する抗体を用いた免疫沈殿、ならびに共免疫沈殿PIWIL2の検出のために十分であることが示された(図3D)。さらに、このプロトコルは、定量的逆転転写PCR 11などの下流アプリケーションの制御および遺伝子組み換えマウスからパチテン精子細胞および丸精子の濃縮画分を得ることに成功した。および高スループット RNA シーケンス¹².

図1:不連続BSAグラデーションの調製。(A)勾配の調製のための5 mLの血清ピペット先端。(B)堆積後の生殖細胞画分のグラデーションおよび収集の調製のための1 mLピペット先端。(C)グラデーションの調製に必要な機器。(D)5%(下)から1%(上)BSA溶液への不連続BSA密度勾配の横図。2%および4%のBSAソリューションは、より良い視覚化のために青色です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:収集した細胞画分及び濃縮分析の代表的な画像。(A)DAPI染色精巣細胞。上の行は、PFA固定、パラフィン埋め込み精巣セクション(左)または懸濁液(右)の無傷の半精巣上皮の精巣細胞を示す。下の行は、濃縮細長精子(ES)、円形精子(RS)、またはパチテン精子細胞(PSpc)の分画を示す。スケールバー = 上段は20μm、下段のインセットは10μmです。(B)各分画における異なる生殖細胞型の相対定量。細胞をImageJソフトウェアを使用して手動でカウントし、RS、ES、PSpc、セルトリ細胞、および他の細胞に分類した。グラデーション内の BSA の分数とそれぞれのパーセンテージが X 軸に示されます。(C)精巣細胞の免疫蛍光分析左パネル:ロダミン標識PNAは、ES(黄色の矢印)とRS(白い矢印)の両方でアクロソームを染色する。中間パネル:DDX4抗体はRSで単一の核顆粒を染色し、精子細胞細胞質(青色矢印)でより拡散性細胞質シグナルと区別しやすい。ES(オレンジ色の矢印)でDDX4信号は検出されません。右パネル:γH2AX抗体は、パチテン精子細胞(白アスタリスクでマークされたγH2AX陰性細胞)にのみ存在する特徴的な核性体を認識する。スケールバー= 10 μm.(D)MDR濃縮細胞画分をPNA(RS画分)、抗DDX4(RS画分)、および抗γH2AX(PSpc画分)で標識し、各画分における細胞濃縮をさらに検証した。スケールバー = 10 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3: MDR 細胞濃縮後のダウンストリーム解析。(A)代表的なMDR細胞濃縮後に各画分からRNAを抽出し、定量した。グラデーション内の BSA の分数とそれぞれのパーセンテージが X 軸に示されます。(B)タンパク質を、放射性免疫沈殿アッセイ(RIPA)バッファー中の細胞ペレットをlyslysして各画分から抽出し、次いで定量した。(C)全細胞タンパク質抽出物を、DDX4、PIWIL1、PIWIL2、GAPDHに対する抗体を用いてウェスタンブロッティングにより調製・分析した。ライサトの10%は、示された各分画からロードされた。(D)免疫沈殿は、抗PIWIL1および抗PIWIL2抗体を用いたウェスタンブロッティングに続いて、抗PIWIL1を用いて示された画分から行った。入力試料は、異なる画分からのタンパク質の混合物を含み、ウサギIgGを用いた対照免疫沈殿(IP)も混合リサートから行った。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4: MDR プロトコルの概略表現と、各ステップの完了に必要な時間。開始材料は、成体マウスからの2つの精巣から構成される。細胞の平均数と1分画から得られるRNAおよびタンパク質の量が示される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

バッファー	試薬	準備	ストレージ
クレブス バッファ (10x)	3.26 g KH2PO4	H2O で 2 L に持ち込み、0.22 μm とオートクレーブをフィルターします。	数ヶ月間4°Cで保存可能
	139.5 グラムナクル
	5.89 g MgSO4•7H2O
	50 g デキストロース
	3.78 g カクル2•2H 2O
	7.12 g KCl
クレブス バッファ (1x)	4.24 g ナフコ3	H2OのNaHCO 3~100mLを溶解し、10倍クレブスバッファーの200mLを加え、H2Oで2Lにする。	新鮮な準備をする
	200 mL 10x クレブスバッファ

表1:クレブスバッファの準備

BSA濃度(w/v)	10% BSA ソリューション	1x クレブス バッファ
0.50%	0.5 mL	9.5 mL
1%	1 mL	9 mL
2%	2 mL	8 mL
3%	3 mL	7 mL
4%	4 mL	6 mL
5%	5 mL	5 mL

表 2: BSA ソリューションの準備

消化ソリューション	作業集中	試薬	準備
コラゲナーゼ	1 mg/mL	コラゲナス IV	50 mL円錐管にコラゲナーゼIVの2mgの重量を量り、消化の直前に暖かい1xクレブスバッファーの2 mLを加える(ステップ2.3)。
トリプシン	0.6 mg/mL	トリプシン	50 mL円錐管に15mgのトリプシンを重量を量り、消化直前に25mLの温かい1x KREBSバッファーと40 μLのDNase Iを加える(ステップ2.6)。
	>3.2 ku/mL	ドナス1

表3:消化酵素の調製。

ディスカッション

ここでは、標準的な実験装置を使用して、円形精子、パチテン精子細胞、および細長い精子の濃縮集団を分離するための簡単で安価なプロトコルです(図4に示すプロトコルの概要)。専門知識や高価な機械は必要ありませんが、組織の消化、勾配の構築、および勾配への細胞懸濁液のロードの際に考慮しなければならないいくつかの重要なステップがあります。

生殖細胞は、2つの連続した酵素消化によって精管管から放出される。コラゲナーゼIVを用した最初の消化は、間質細胞を除去することによって半静脈管を分離する。長時間の消化時間は、(このステップ中に管から放出された場合)次のステップで廃棄されるとして、管を損傷し、精子の損失につながる可能性があります。トリプシンを用した第2の消化ステップは、半卵管から生殖細胞を放出する。時折細胞のリシスがあり、通常、放出されたゲノムDNAによるいくつかの塊が形成される。消化の推奨期間または温度を超えると、生存率の低下、細胞のリシスの増加、および凝集につながる可能性がありますので、お勧めしません。軽度の束が発生した場合、束は無視できます。しかし、細胞の重要な集まりや損失の場合には、トリプシン消化時間または濃度を減少させる必要があります。また、トリプシンの酵素活性は、バッチ間および保存の長期時間中に変化しうる。トリプシン消化中のDNase Iの量はまた、余分な塊を除去するために増加することができます, しかし、これは二次的な解決策と考えられるべきです.束化された細胞はより速く堆積し、分画を汚染し、勾配を破壊するので、前処理の終わりに均質な単一細胞懸濁液を得ることが重要です。

グラデーションを構築するには、いくつかの練習が必要な場合があります。ピペットコントローラで5mLピペットチップを使用して不快感がある場合は、滑らかなピストンで通常の1 mLメカニカルピペットを使用し、ピペットの先端を直径約3mmの開口部にカットすることをお勧めします(図1B)。BSAソリューションの絞りとスムーズなローディングにより、グラデーションを混合するリスクが減少します。適切に準備すると、屈折指数が異なるために隣接する BSA 溶液間の境界を確認できます。グラデーションは、使用する直前に作成する必要があります。また、小さな揺れや振動がグラデーションを乱す可能性があるため、グラデーションが乱れない環境に設定する必要があります。

セルサスペンションをグラデーションにロードするには、慎重に行う必要があります。ロード後、細胞懸濁液はグラデーションの上にとどまり、そこから細胞はゆっくりと最初の層を通して堆積し始める。大きな細胞群がグラデーションを通って速く移動しているのが見られる場合、細胞は慎重に再懸濁しなかったり、過剰な束たりする可能性が高い。セルが荷重時に不連続な BSA グラデーションの上に留まらず、すぐに 1% と 2% の BSA 層の間に沈む場合(ステップ 3.6)、セル懸濁液が密度が高すぎる可能性があります。このプロトコルは、出発材料として成体マウスの2つの精巣(80-120 mg/精巣)を使用して最適化されています。ただし、開始材料の量を減らして分離が成功しました。プロトコルをアップスケールし、より多くの精巣からより濃縮された生殖細胞を得るためには、勾配を持つより多くの50 mLチューブを導入する必要があります。

プロトコルは当初、成人マウス精巣からハプロイド丸精子を濃縮するために開発され、最適化され、ラウンド精子画分の純度は90%以上になると予想される。非常に純粋な丸精子画画に加えて、パチテン精子細胞および伸長精子の濃縮に対する満足のいく結果が得られた。赤血球は、細長い精子の分画を汚染する可能性があり、それらの存在が下流の分析を妨げると予想される場合は、それらを排除するためのさらなるステップが取られるべきであることに留意すべきです。MDRプロトコルを用いて成体マウスから前発細胞や初期のマイオティック細胞(パチテン期以前)などの他の細胞型を濃縮することはできていません。

さらに、STA-PUT堆積は、出生^後13の所定の時点で採取された若年精巣を用いて精子またはプレプトテン、レプトテン、およびジゴテン精子細胞の濃縮画分を得るために成功した。このアプローチは、精子形成の最初の波の間にこれらの細胞型の出現を利用する。同じアプローチが MDR エンリッチメントにも適用される可能性が高いですが、実際にはテストされていません。分化の特定の段階で前平細胞とマイオティック細胞を精製するための良い選択肢であるもう一つの方法は、存在特異的マーカーに基づいて特定の細胞タイプの単離を可能にするという重要な利点を有するFACS^{である14 ,15,16,17}.

全体的に、MDR速度堆積は生殖細胞濃縮のための有用な方法として機能する。この方法は、濃縮細胞の純度または量の面で他の確立された方法よりも優れていますが、その明らかな利点は、そのシンプルさと低いセットアップコストです。これは、必要な出発材料の少量と一緒に、このプロトコルは、精子形成分野の研究者や特殊なハードウェアや動物の大規模なグループに投資したくないかもしれない他の分野の研究者のための素晴らしいオプションをレンダリングします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
		4%パラホルムアルデヒド	の好み
AlexaFluor488ロバ抗ウサギIgG	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-21206
AlexaFluor647ロバ抗マウスIgG	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-31571
シ血清アルブミン(BSA)	シグマ	A9647
CaCl2·2H2O	研究者
コラゲナーゼIV	シグマ	C5138
完全プロテアーゼ阻害剤	ロシュ	11836145001
DDX4 抗体	アブカム	ab13840
デキストロース	研究者
DNase I	ワーシントン	LS006355
GAPDH	HyTest	5G4
HRP結合抗マウスIgG	GEヘルスケアライフサイエンス	NA931
HRP結合抗ウサギIgG	GEヘルスケアライフサイエンス	NA934
KCl	研究者
KH2PO4	研究者		の好み
MgSO<サブ>4·7H2O	研究者
NaCl	好み
NaHCO3	研究者の
NH4Cl	研究者
Pierce BCAタンパク質アッセイキット	Life Technologies	23227
PIWIL1	Cell Signaling Technology	G82
PIWIL2, clone 13E-3	Millipore	MABE363
Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36962	for Alexa Fluor 免疫染色
ウサギ IgG	ネオマーカー	NC-100-P
ローダミン標識ピーナッツ凝集素 (PNA)	Vector Laboratories	RL-1072
RIPA バッファー			50 mM Tris-HCl、pH 7.5、1% NP-40、0.5% w/v デオキシコール酸ナトリウム、0.05% w/v SDS、1 mM EDTA、150 mM NaCl、1x プロテアーゼ阻害剤カクテル、0.2 mM PMSF および 1 mM DTT
トリシュア	バイオライン	BIO-38033
Triton X-100	研究者		非イオン性界面活性剤
トリプシン	ワージントン	LS003703
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	for standard DAPI analysis of cell fractions
&γ;H2AX抗体	ミリポア	05-636
0.22 µmフィルター	ザルトリウス	サルトラボ BT 180C6	または同等の
1 mL メカニカルピペット	研究者
1.5 mL または 2 mL チューブ	研究者
40 & マイクロ;50 mLチューブ用m細胞ふるい	Greiner Bio-One	542040	または同等の細胞ストレーナー
5 mL血清ピペット	Sarstedt	86.1254.001	または同等の
50 mLコニカルチューブ	研究者
6 cmシャーレ	研究者
細胞培養インキュベーター	研究者
50mLチューブ用遠心分離機	研究者
顕微鏡ガラススライド用のグリースペン	研究者
HulaMixer サンプルミキサー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15920D	または同等の細胞回転子
マイクロダイセクション鉗子	研究者
マイクロダイセクションハサミ	好み研究者
顕微鏡ガラススライドとカバースリップ	研究者
Nanodrop 1000	Thermo Scientific
Pipetboy Acu 2	Integra	155 000	または同等のピペットコントローラー
1.5mLチューブ用の冷蔵遠心分離機	研究者
1mLメカニカルピペットのヒント	研究者
ウォーターバス	研究者
広視野蛍光顕微鏡	研究者