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方法論記事

頸動脈体におけるレプチンシグナル伝達と呼吸制御への影響を調べる実験的アプローチ

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DOI:

10.3791/60298

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2019年10月25日

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Johns Hopkins University, 2Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Respiratorias (CIBERES), Hospital Universitario Virgen del Rocío/Universidad de Sevilla

この記事について

サマリー

我々の研究は、頸動脈体内のレプチンシグナル伝達が低酸素換気応答(HVR)に及ぼす影響に焦点を当てている。CB脱窒後のHVRに対するレプチンの効果を測定する「機能喪失」実験と、CBにおけるレプチン受容体の過剰発現後のHVRを測定する「機能のゲイン」実験を行った。

要約

脂肪細胞産生ホルモンレプチンは強力な呼吸刺激剤であり、肥満における呼吸機能を防御する上で重要な役割を果たす可能性がある。末梢低酸素感受性の主要な器官である頸動脈体(CB)は、レプチン受容体(LepRb)の長い機能的同位体を発現するが、呼吸制御におけるレプチンシグナル伝達の役割は完全には解明されていない。ベースラインおよびCB脱窒後のレプチン注入前後のC57BL/6Jマウスにおける低酸素換気応答(HVR)(1)を調べた。(2)LepRb -ベースラインおよびLepRb過剰発現後の欠損肥満db/dbマウスにおけるCB。C57BL/6Jマウスでは、レプチンはHVRを増加させ、レプチンがHVRに及ぼす影響は、CB脱窒によって廃止された。db/dbマウスにおいて、CBにおけるLepRb発現はHVRを増強した。したがって、レプチンは、低酸素症に対する応答を増強するためにCBで作用すると結論付ける。

概要

脂肪細胞産生ホルモンレプチンは、食物摂取を抑制し、代謝率を増加させるために視床下部で作用する。私たちの研究室1、2および他の研究者3、4で行われた研究は、レプチンがレプチンの肥満低換気を予防する高カプニック換気応答(HVR)を増加させることを示した不足している肥満。しかし、肥満者の大半は、高い血漿レプチンレベルを有し、ホルモン5、6、7、8の代謝および呼吸効果に対する耐性を示す。レプチンに対する耐性は多因子であるが、レプチンに対する血液脳関門(BBB)の透過性は限られているが、大きな役割を果たす。我々は、レプチンが末梢低酸素感受性の重要な器官である頸動脈体(CB)でBBB以下に作用し、肥満個体の呼吸を防御することを提案する。CBはレプチン受容体の長い機能的アイソフォームを発現し、LepRb、レプチンの呼吸効果におけるCBの役割は十分に解明されていない9、10である。

我々の方法の目的は、HVRに対するCBにおけるレプチンシグナル伝達の影響を調べることであった。私たちの根拠は、(a)無傷の頸動脈体と変性頸動脈体を持つマウスにレプチンを注入する機能実験の喪失を行い、その後HVR測定を行うことでした。(b) LepRbを欠くdb/dbマウスにおける関数実験のゲインは、CBのみでLepRbのベースラインおよび発現後にHVRを測定した。私たちの技術の利点は、睡眠と覚醒中に拘束されていない無麻酔を受けたマウスですべての実験を行ったことです。以前の研究者は、麻酔9の下で実験を行ったか、睡眠中のレプチンの効果を測定しなかった10.さらに、我々の研究は、上述したCBにおける選択的LepRb発現を用いる機能アプローチのユニークな利益を利用した最初の研究である。

広い文脈において、我々のアプローチは、CBで発現される他の受容体と低酸素感受性におけるその役割に一般化することができる。研究者は、目的の受容体にリガンドを注入し、ベースラインおよびCB脱窒後にHVRを測定することができる。補完的なアプローチとして、関心のある受容体はCBで過剰発現することができ、HVR測定は、この原稿に記載されている当社の技術を使用して過剰発現の前後に行うことができる。

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プロトコル

すべての実験プロトコルは、制度的動物ケアと使用委員会(MO18M211)によって承認されています。

1. レプチン注入

注:呼吸に対するレプチンの影響を調べるために、浸透ポンプによって赤身C57BL/6Jマウスに皮下にレプチンを注入し、肥満マウスで観察されるものに循環レプチンレベルを上げた。

  1. 浸透ポンプの準備
    1. 空のポンプを計量して、ロードされた溶液の正味重量を確認します。
    2. 浸透ポンプにレプチン(5mg/mL)を加えます(3日間1μL/h)。小さな注射器(1 mL)でポンプを満たします。充填後、付属の鈍いチップ27ゲージ充填チューブでポンプを閉じます。
      注:注射器と付属のチューブは気泡を含まない必要があります。
    3. 充填後、ポンプをもう一度計量して溶液の正味重量を確認します。
    4. レプチンポンプを皮間領域に皮下に挿入します。
      注:      すぐに注入を開始したい場合は、37°Cの滅菌生理食塩水に予め充填されたポンプを少なくとも4〜6時間(好ましくは一晩)インキュベートします。

2. 低酸素換気応答(HVR)

注:熱中性条件は、冷たい周囲温度によって課されるストレス要因を排除し、マウスの代謝を有意に変更します。したがって、すべての呼吸測定は、新生児インキュベーター12を用いて熱中性条件(t=30°)で行われるべきである(図1A)。全身プレチスモグラフィーチャンバー(WBP)は、すべての測定に使用されています。すべての動物は、HVR測定の3〜5日前に、気圧プレチスモグラフィー室と、その後のパルスオキシメトリー記録のためのシャムネックカラーに順応する必要があります。HVRは、午前10時から午後5時の間に記録され、HVRは睡眠中に抑制され、従って睡眠中および静かな覚醒13の間に別々に測定することができる。HVR測定中に動物の特定の睡眠覚醒段階を確保するために、EEG/EMG電極は、前述の14としてEEG/EMGヘッドマウントとして移植されるべきである。動物は、ヘッドマウント後少なくとも72時間回復することが許可されるべきである。スリープ ステージングは、5 s のエポックで実行する必要があります。NREM睡眠は、エポックの50%を超える遅波脳波活性によって認識される。静かな覚醒は、動きがない場合にアルファ脳波活性によって現れる。レム睡眠は、EMG上の減少した筋肉の緊張の存在下で優勢なアルファおよびシータ脳波活性によって同定される。通常、レム睡眠はHVRガスの課題の間は観察されない。

  1. HVR 記録プロトコル
    1. 内部直径80mm、高さ50.5mm、体積0.4LのWBPチャンバーを使用します。WBPチャンバーは、2つのチャンバー、密閉室と参照チャンバー、およびマウス14を配置する円形プラットフォームで構成されています(図1B)。チャンバー内の流入と流出は、大気圧を維持する正と負の圧力源によって制御されます。この制御は部屋の安定したバイアスの流れを作成し、CO2の保持を防ぐ。WBP の設定の詳細については、ヘルナンデスと同僚15を参照してください。
    2. WBPにマウスを置く前に、室内の温度と室内の相対湿度を測定します。
    3. 体重と直腸温度を測定します。
    4. オキシメータカラーをマウスの首の周りに置きます(領域は以前に剃る必要があります)。
    5. WBPの中にマウスを置き、空気漏れを避けるためにチャンバーが完全に密封されていることを確認します。
    6. マウスが静かでチャンバーが一定の音量になるまで、約30分間待ちます。
    7. ノルモクシア:30分後、マウスが静かな場合は、LabChart 7 Pro(バージョン7.2)を使用して、ノルモクシア相(圧力1時21%)で呼吸信号および末梢酸素飽和度(SpO2)の記録を開始する。
    8. 低酸素症:静かなノルモキシアの20分後に、急性低酸素症およびSpO2の最初のサイクルの記録を開始する。低酸素相の場合、動物を10%O2と3%CO2で構成する一定の混合ガス流に5分間さらします。
      1. 低酸素症の最初の30秒の間に、混合ガスは21%(圧力の1時)から10%に落ちることを可能にする基盤の2つの小さい側面の港を通って部屋を通って流れる。
      2. 最初の30sの後、WBPチャンバーの小さな側ポートの1つを閉じ、5分間10%FiO2で一定の低酸素で記録を続けます。
        注:低酸素症で10%O2と3%CO2の混合物は、ユーカプネア11を維持するために使用されます。
    9. 低酸素症の5分後、流入源を切り替えてマウスを再び室内空気(1気圧で21%FiO2)にさらします。
    10. 前の低酸素暴露から回復するために次のノルモキシア記録まで少なくとも30分間待って、換気ロールオフ現象を回避する(すなわち、低酸素16時の呼吸の中心的な抑制)。
      注:ノルモクシア/低酸素サイクルを各マウスで3回繰り返し、測定の再現性を保証します。私たちの経験では、人工呼吸器の適応(ロールオフ現象)のために、追加の(特定の日に3回以上)低酸素暴露は避けるべきです。
    11. 実験の終わりに、室内の底部にある小さな側のポートの1つに注射器を差し込んで1 mLの室内空気を3回注入して、WBPチャンバー(マウスがまだ内部にある)をキャリブレーションします。
    12. その中の動物と再びチャンバー内の温度を測定します。
    13. チャンバーを開き、マウスの直腸温度を測定してから、ホームケージに戻します。
  2. HVR計算
    1. 1,000 Hz (チャネルあたりのサンプリング周波数) で HVR 計算のすべての信号をデジタイズします。
      注:WBP潮汐量分析は、Drorbaughとフェン方程式17に基づいてラボチャート7で行われます。必要な変数は、マウス直腸温度とチャンバー温度(HVR測定前後)、相対湿度、およびチャンバガス定数を含みます。この定数は、キャリブレーションフェーズにおける空気の1 mL注入後のWBP圧力偏向に起因する。詳細については、ヘルナンデスと同僚15を参照してください。
    2. Drorbaugh方程式とフェン方程式を計算した後、潮汐体積(Vt)チャンバチャネルに定数を掛けます。
    3. 分析のための記録の選択
      1. ノルモクシア:一定の潮量で安定した呼吸のセクションのみを選択します。マウスの動きに近接するセクションは避けてください。
      2. 低酸素:O2レベルが21%から10%に低下している場合は最初の30sを廃棄し、10%O2暴露(90s間隔)の30sから2分までのセクションを選択する。この間隔内で、一定の潮量で安定した呼吸を持つセクションのみを選択します。マウスの動きに近接するセクションは避けてください。各サイクルで少なくとも10sの低酸素症が選択されている場合、分析は信頼性が高い。
        注:CBによって支配されるケモレフレックスの末梢成分は、暴露16、18、19の最初の1〜2分の間に優勢である。第2段階では、低酸素暴露の2分から5分の間に、末梢成分と中央成分の両方が役割を果たす。最後に、第3段階、>5分は、主に中央化学受容体によって支配される低換気(ロールオフ現象)によって特徴付される。私たちの経験は、マウスがしばしば気流源の手動スイッチのために低酸素の博覧会の間に目を覚ますことを示しています。
    4. 選択後、式VE=呼吸数X潮汐量を用いてノルモキシカルおよび低酸素条件における平均微量換気(VE)を計算する。
    5. ノルモクシアおよび低酸素条件で平均SpO2を計算します。
    6. 式HVR =(V E(10%O2)-V E(21%O2))/(SpO2(10%O2)-SpO 2(21%O2))を使用して手動でHVRを計算します。
      注:C57BL/6Jマウスでは、レプチン注入用の浸透ポンプが首輪による正確なSpO2信号検出を損なう可能性がある。この場合、HVRは、ノルモキシ的および低酸素条件におけるFiO2値に基づいてHVR=ΔVE/ΔFiO2 11として計算される。

3. 頸動脈体脱気または頸動脈洞神経解離(CSND)

注:外科的脱窒だけでは低酸素性のケモレフレックスは廃止されないため、1週間離れて外科的および化学的脱窒を併用した。

  1. 外科的準備
    1. 成人男性C57BL/6Jマウスに対するすべての手順を実行します。すべての手術器具を殺菌する。滅菌手術用手袋、注射器、綿のチップアプリケーターを使用してください。
    2. 鼻コーンを使用して1-2%のイソフルランで男性C57BL/6Jマウスを麻酔し、低体温を防ぐために暖かい毛布を置きます。アイソフルランは、1 Hz(60呼吸/分)で呼吸数を維持するために慎重に滴定されます。手術を開始する前の麻酔の十分さは、呼吸頻度、動きや可聴ノイズの欠如、触覚刺激への応答の欠如、前肢または後肢ペダル離脱反射によって評価される。
    3. 痛みの不快感を防ぐために腹腔内ブプレノルフィン(0.05 mg/kg)を投与します。首の腹部の毛を取り除き、ベタジンとアルコールで領域を消毒します。
    4. 角膜乾燥を防ぐために、麻酔中に無菌眼科軟膏でマウスの目を潤滑する。
  2. CSND 手順
    ステージ 1: 外科的脱証
    1. 中線切開後、結合組織および脂肪組織を除去することによって一般的な頸動脈の分岐を露出させる。
    2. 通常非常に顕著である下垂体神経を特定し、それを持ち上げてすぐ下の舌咽神経を露出させる。微小ばんはさみを用いて両側に頸動脈洞神経を解剖する。
    3. 6-0シルク縫合糸で切開部を閉じます。
    4. 脱水症状を防ぐために、通常の生理膜を皮下に1mL投与する。
    5. マウスを回復室に収容し、マウスが胸骨の残り不全を維持するために意識を取り戻すまで、最初の1時間15分ごとにその行動を監視する。完全に回復した後、マウスを自宅のケージに戻します。次の 3 日間、1 日に 2 回マウスを監視し続けます。マウスが痛みの徴候を示す場合は、追加のブプレノルフィンを与える(例えば、食欲減退、落ち着きのなさ)。
      ステージ 2: 化学脱窒
    6. 手術の1週間後、カロソ咽頭神経からCBの頭蓋極に分岐する点でエタノールで希釈した2%フェノールの溶液で頸動脈を塗装する。外科的脱窒セクションで上述したように、同じ術後ケアを化学的脱気後に提供する必要があります。
      注:シャム手術群の場合、頸動脈洞神経解剖を除いて同じ手順が行われる。
    7. HVR測定の前に5〜7日間、動物を回復させてください。

4. アデノウイルスベクターを用いたCBにおけるレプラーブの発現 (Ad-LepRb)対制御 (Ad-LacZ)

  1. アドレップRbとアドラクZサスペンション
    1. アデノウイルスを用いてマウスをトランスフェクトする(Ad-LepRb-GFP、過剰発現のための2-5x1010 pfu/mL、Ad-Lacz、1 x 1010 pfu/mL制御用)をCB領域に変換する。
    2. マトリゲルマトリックスを解凍し、バイアルを氷に浸して4°Cの冷蔵庫に一晩浸す。
    3. 液体マトリゲルマトリックス中のアデノウイルスを1:5で穏やかに中断する(マトリゲルマトリックスの1μLおよびアデノウイルスの4μLを両側に適用)。
    4. CBに塗布されるまで、常に氷の上にウイルス懸濁液を保持します。
  2. 外科的準備
    1. CSNDプロトコルと同じ手術器具を使用してください。
    2. 鼻コーンを使用して2-2.5%のアイソフルランでLepRb-欠損db/dbマウスを麻酔し、低体温を防ぐために暖かい毛布の上に動物を置きます。アイソフルランは、1 Hz(60呼吸/分)で呼吸数を維持するために慎重に滴定されます。麻酔の妥当性は、呼吸頻度、動きや可聴音の欠如、触覚刺激への応答の欠如、前肢または後肢ペダル離脱反射によって評価される。
    3. 腹腔内ブプレノルフィン (0.05 mg/kg) を投与します。.
    4. 首の腹部の毛を取り除き、CSNDプロトコルのようにベタジンとアルコールで領域を消毒します。
    5. 角膜乾燥を防ぐために、麻酔中に無菌眼科軟膏でマウスの目を潤滑する。
  3. CBのアデノウイルス治療
    1. CSND プロトコルの説明に従って CB を公開し、ウイルス懸濁液の 5 μL を CB 領域に両側に適用します。
    2. 液体マトリゲルマトリックスがゲルになるまで2〜3分待ちます。ウイルス懸濁液が収縮したことを確認した後、6.0シルク縫合糸で切開部を閉じる。
  4. 手術後
    1. マウスを回復室に収容し、マウスが胸骨の残り不全を維持するために意識を取り戻すまで、最初の1時間15分ごとにその行動を監視する。完全に回復した後、マウスを自宅のケージに戻します。次の 3 日間、1 日に 2 回マウスを監視し続けます。マウスが痛みの徴候を示す場合は、追加のブプレノルフィンを与える(例えば、食欲減退、落ち着きのなさ)。
    2. 術後の期間中の痛みの不快感を防ぐために必要に応じてブプレノルフィン(0.05 mg/kg)腹腔内に投与します。
    3. アデノウイルストランスフェクションの9日後にHVRを測定する。

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結果

レプチンの連続的な注入は、リーンC57BL/6JマウスのHVRを0.23mL/分/g/ΔFiO2に有意に増加させた(P< 0.001、図2)11.CSNDはHVRのレプチン誘発増加を廃止した(図2)が、レプチン注入後のシャム手術群ではHVRに対するCSNDの減衰作用は認められなかった。

LepRbの CB における LepRb発現は、欠乏性肥満db/dbマウスが HVR を 0.05 mL/min/g/ΔSpO2に有意に増加させた(図3)。CBでコントロールAd-LacZでトランスフェクトされた動物では、HVRは変化しなかった。

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ディスカッション

我々の研究の主な焦点は、CBにおけるレプチンシグナル伝達の呼吸効果を調べることであった。いくつかのプロトコルは、機械的な方法でレプチンの役割を評価するために開発されています。まず、HVRに対するCBの特異的寄与は、低酸素暴露の最初の2分の間にHVRの慎重な定量によって分析された。第二に、呼吸制御のレプチン媒介性アップレギュレーションにおけるCBの関連性を、2つの相補的なアプローチによって検討した。レプチンレベルが低いリーン野生型マウスでは、HVRをベースラインで測定し、レプチンを連続的に注入した後;実験はCB脱窒後に繰り返した。LepRb-欠損db/dbマウスでは、HVRをベースラインで測定し、CBにおけるLepRb発現の後に測定した。

げっ歯類のHVRを測定するためにいくつかのプロトコルが使用され、動物を低酸素ガスにさらしています。末梢ケモアフレックスにおけるCBの役割と、CBにおけるレプチンが呼吸制御に及ぼす影響を調べるHVRプロトコルを開発しました。CBケモアフレックスは比較的短...

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開示事項

著者は相反する利害や開示を持っていない。

謝辞

R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 mL インスリンシリンジBD Biosciences 309311
1x PBS (pH 7.4)Gibco10010-023500 ml
Ad-LaczDr. Christopher Rhodes (University of Chicago)1 x 1010 pfu/mL
Ad-LepRb-GFPVector BiolabsADV-2633802-5 x 1010 pfu/mL
麻酔カートAtlantic Biomedical
BetadinePurdue Products Ltd.12496-0757-5
ブプレノルフィン(ブプレネックス)レキットベンキーザーヘルスケア株式会社12496-0757-50.3 mg/mL
C57Bl/6Jジャクソン研究室000664マウス株
綿ガーゼスポンジフィッシャーブランド22-362-178
db/dbジャクソン研究室000697マウス株
エタノールPharmco-AAPER111000200
イソフルランベトン502017
研究室チャートデータサイエンス インターナショナル (DSI)ソフトウェア
マトリゲル マトリックスBD バイオサイエンス 356234
マイクロスプリングハサミワールド プレシジョンズ (WPI)14124
マウス オックス プラススター ライフ サイエンス コーポレーションソフトウェア
マウス OX Plus カラーセンサーSTARR Life Sciences Corp.015022-2ミディアムカラークリップスペシャル7 "
マウス全身プレチスモグラフィーチャンバーデータサイエンスインターナショナル(DSI)PLY3211
オハイオケアプラスインキュベーターオーメダHCHD000173
手術用ハサミワールドプレシジョンインスツルメンツ(WPI)501753-Gストレート
浸透圧ポンプアルゼット1003D1 μL/h、3日間
PhenolSigma-AldrichP4557
組換えマウスレプチンタンパク質R&Dシステム498-OB-05M5 mg
生理食塩水RICCAケミカル7210-160.9%塩化ナトリウム
滅菌外科用縫合DemeTechDT-639-1、サイズ6-0
計校正ソリューション(INNOCAL)EW 20250-91
糸シルク温度革新的な

参考文献

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