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方法論記事

上頭頂皮細胞活性化に関与する経路を解析するエクスビボアッセイとしての糸球体成長

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DOI:

10.3791/60324

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2020年8月19日

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1Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Department of Pathology, Radboud University Medical Center, 2Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Amalia Children's Hospital, Department of Paediatric Nephrology, Radboud University Medical Center, 3Radboud Institute for Health Sciences, Department of Nephrology, Radboud University Medical Center, 4Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Department of Nephrology, Radboud University Medical Center

この記事について

サマリー

本稿では、マウス腎臓から分離されたカプセル化糸球体上皮細胞の増殖を培養し、分析する方法について述べている。この方法は、頭頂皮細胞の増殖および移動に関与する経路を研究するために使用することができる。

要約

上頭頂皮細胞(PEC)活性化は、糸球体性動脈硬化症の発症および進行に関与する重要な因子の1つである。したがって、頭頂皮細胞活性化に関与する経路の阻害は、糸球体疾患の進行を減衰させるツールとなり得る。本稿では、マウス腎臓から分離されたカプセル化糸状糸球体の頭頂皮細胞の増殖を培養および分析する方法について述べている。単離マウス腎臓を解剖した後、組織をミンチ化し、糸球体をふるいにかけて単離する。カプセル化糸球体が採取され、単糸球体を6日間培養し、頭頂頭細胞の糸球体伸長を得る。この期間中、頭頂頭上皮細胞の増殖および移動は、細胞数または成長細胞の表面積を決定することによって分析することができる。したがって、このアッセイは、トランスジェニックマウスまたはノックアウトマウスにおける遺伝子発現の変化の影響、または頭頂皮細胞の成長特性およびシグナル伝達に対する培養条件の影響を研究するためのツールとして使用することができる。この方法を用いて、頭頂頭上皮細胞活性化の過程に関与する重要な経路、そして結果的に糸球体性動脈硬化症において重要な経路が検討できる。

概要

糸球体疾患は腎臓障害の重要なグループであり、末期腎疾患(ESRD)の主要な原因を表す。残念ながら、特定の治療オプションは限られており、ESRDへの進行は避けられません。糸球体疾患は、糸球体損傷の存在によって定義され、炎症性および非炎症性疾患でグループ化することができる。最初の侮辱は異なるが、最近の研究では、一般的な細胞機構が糸球体上皮細胞,過形成につながり、最終的には基底原因1、2、3、42に関係なく、すべての糸球体疾患における糸球体性動脈1硬化症につながることが示されている。3,4

具体的には、糸球体硬化性病変が活性化頭頂細胞5,6,6から主に構成されていることを示した。生理学的条件下では、頭頂上皮細胞は、糸球体のボウマンのカプセルに並ぶ平らな静止上皮細胞である。しかし、遺伝子変異(例えば、ポドサイト特異的またはミトコンドリア細胞症)、炎症または過濾過(例えば、腎質量の低下、高血圧、肥満または糖尿病性髄膜)による任意の糸球体損傷は、頭頂上皮細胞の活性化を引き起こす可能性がある。活性化された頭頂皮細胞は細胞外基質を増殖および沈着させ、細胞内三日月または硬化性病変の形成を生じる,5、7、8。87これらのプロセスの進行は腎機能9の損失をもたらす。したがって、頭頂皮細胞活性化は、炎症性および非炎症性糸球,体疾患1、2、3、4、102,の両方における糸球体性硬化症の発症および進行における重要な要因1である。4,103

頭頂上皮細胞の活性化を媒介する分子プロセスは、まだほとんど知られていない。最近の研究では、細胞増殖および移動に関与する異なる経路の活性化に重要な受容体である、ノボ発現CD44を活性化した頭頂頭細胞がCD44を発現することが示されている。さらに、CD44の阻害は、炎症性の動物モデルならびに非炎症性糸球体疾患11,12における三日形成および糸球硬化症の進行を抑制し、12上頭頂皮細胞の活性化を阻害することが示された。

頭頂上皮細胞活性化は糸球体性硬化症および三日月形成の発展のための重要なプレーヤーであるため、これらの細胞の阻害は糸球体疾患の進行を遅らせることができる。頭頂頭細胞活性化を促進する分子経路の解明は、糸球体疾患における過形成および糸球体硬化性病変の形成を減衰させる特定の治療介入の開発につながる可能性がある。

実験動物モデルでは、遺伝子発現の変化(ノックアウトモデルまたはトランスジェニックマウスモデル)や頭頂皮細胞に対する薬物治療の直接的な効果の証拠を提供することはしばしば困難である。従来のノックアウトマウスでは、生体内変化が観察され、頭頂皮細胞の直接的な変化によって説明され得る。しかし、遺伝子発現はマウス内の他の細胞型でも変化するため、他の細胞型によって媒介される間接的な効果を排除することはできません。主に頭頂頭上皮細胞で活性なプロモーターによって駆動される条件付き cre-lox マウスの開発は、場合によっては13の解決策を提供している。それにもかかわらず、条件付きトランスジェニックモデルは複雑であり、より多くの条件線が利用可能になるが、従来のノックアウトまたはトランスジェニックマウスラインの多くにとって、まだ条件付き代替手段はない。

頭頂頭細胞に対する直接的な影響を研究するために、我々のグループは、マウス腎臓から単一のカプセル化糸球体を用いて、頭頂皮細胞の増殖と移動を測定および分析するex vivoアッセイを開発した。この方法により、頭頂頭上皮細胞特異的な効果を決定し、頭頂頭上皮細胞活性化のための責任ある経路を見つけ、この活性化を阻害する治療選択肢をテストすることができます。

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プロトコル

すべての動物実験は、ラドボウド大学ナイメーヘンの動物倫理委員会のガイドラインに従って行われました。

注:未治療の、健康な野生型(WT)マウス(n=4)および cd44-/-(n=4) マウスは12-16週齢で屠殺した。雄マウスと雌マウスの両方を使用した。すべてのマウスはC57Bl/6バックグラウンドにあった。

1. マウス腎解剖

  1. 子宮頸部脱臼により健康なWTマウスまたは遺伝的に改変されたマウスを犠牲にする。
  2. マウスを犠牲にした直後にマウス腎臓全体を解剖する。このためには、腹部はさみを使用して、皮膚を切断し、次に腹筋を切断して、開腹術の中央値を実行します。腸を取り除き、マウスの隣に置きます。
  3. 腎臓を組織に接続してから解放し、外科用鉗子を使用して腎臓を引き抜き、腎動脈、腎静脈および尿管をはさみで切断する。
  4. 外科用鉗子で腎臓を保持することによって腎臓から腎カプセルを取り出し、鉗子の別のペアを使用してカプセルを引き出す。
  5. 腎臓を6ウェル細胞培養プレート(2腎臓/ウェル)に入れ、ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)を井戸あたり2mLで調製し、氷の上に置きます。

2. マウス腎臓からの糸球体の分離

  1. 腎臓を100mmのペトリ皿に移し、2つのメスを使って腎臓を1-2 mmの小片にミンチします。HBSSの1-2 mLを使用して、ひきずみ腎臓片を濡らしてください。
  2. 300 μmの金属ふるいの上にひき肉の腎臓片を置き、20 mLシリンジのプランジャーを使用してふるいを通して腎臓を押します。HBSSを間に入れてふるいを繰り返し洗い流し、血清学的ピペットを使用してきれいなペトリ皿にフロースルーを集める。また、メスでそれを削り取ることによってふるいの底側に残っている/スティックのすべてを収集し、収集されたフロースルー(腎臓ホモジネート)にそれを転送します。
  3. 腎臓ホモゲンをHBSSで75μmのふるいを通してリンスする。フロースルーを収集し、その後、53 μmのふるいを通してこのフロースルーをすすいます。HBSSを使用して両方のふるいを洗浄し、小さな構造をすべて取り除きます。
    注:このステップでは、流れはすすがれるだけですが、75 μmと53 μmのふるいを通して押すわけではありません。HBSSで洗浄することは、ふるいの上の破片や小さな構造を除去するために必要です。したがって、通常は200~300 mLのHBSSが使用されます。
  4. 20%の胎児子牛血清(FCS)を補ったDulbeccoの修飾されたイーグルの媒体(DMEM)でふるいの上面を洗浄することによって、75 μmおよび53 μmのふるいに残る腎臓構造/材料を収集し、材料を6ウェル超低い取り付けマイクロプレートに移します。
    注:ふるいの上面を洗う、傾いた位置(>45°)でふるいを洗い流し、ふるいの端に腎臓材料を集める。収集された材料は、カプセル化された糸球体と同様に濃縮され、少数の管状断片のみを示す。カプセル化された糸球体は非常に粘着性があります。単一の糸球体を収集するには、したがって、ペトリ皿またはウェルプレートの表面に接着する糸球体を防ぐことが重要です。付着を避けるために、20%のFCSで媒体を使用し、このステップには超低い取り付けプレートを使用してください。

3. 糸球体成長の培養

  1. 超低い取り付けマイクロプレートを反転光顕微鏡に持ち込み、カプセル化およびカプセル化解除された糸球体を20 μLピペットで収集します。他の構造物や破片をピペットにすることは避けてください。ピペットチップに単一の糸球体を採取した後、腎臓材料を採取せずに新鮮なDMEM培地を同じピペットチップに20μLの体積に加えます。
  2. 20 μL DMEM培地を用いた単一の糸球体を24ウェルの細胞培養プレートのウェルの中心に移し、37°Cで3時間、5%(v/v)CO2でイン2キュベートし、糸球体をウェルの中心に付着させます。慎重にウェルの下宿人に糸球体の浮きを避けるためにプレートを移動します。
  3. 3時間のインキュベーションの後、糸球体はウェルの中心に付着する。ヒドロコルチゾン、ヒト内皮成長因子、ウシ脳抽出物およびゲンタマイシン硫酸アンホテリシンB(材料表)および追加の5%(v/v)FBSおよび1%(v/v)陰茎/ストレプトミシン(各strepin)を含む成長因子キットを添加した内皮基底培地(EBM)を慎重に加える。
  4. 37°Cで6日間、5%(v/v)CO2で単一の糸球体を2培養する。
    注:6日以内に頭頂頭上皮細胞からなる成長が形成される。特定の化合物または薬物が頭頂頭上皮細胞に及ぼす影響をテストすることを目的とする場合、この6日間以内に培地に添加する必要があります。

4. 頭頂皮細胞増殖の解析

  1. 6日後に糸球体の伸びを分析する。デジタル反転光顕微鏡を使用して顕微鏡画像を撮ります。
  2. 画像解析ソフトウェア(ImageJ/FIJIなど)を使用して、球体の成長の表面積と直径、および成長細胞の数または成長する糸球体の数を決定します。
    1. 糸球体の伸びの表面積を決定するには、tifを開きます。イメージJのスケールバーを持つ糸球体の伸びのファイル。スケール バーに直線を描き、 解析 と測定をクリックして距離をピクセル単位で決定します (たとえば、1 mm = 460 ピクセル)。
    2. 分析でクリックしてスケールを決定し、尺度を設定し、既知の距離をピクセル単位で入力(例えば、460)、既知の距離(例えば、1)および長さの単位(例えば、1mm)を入力する。[OK] をクリックします。
    3. 分析をクリックして結果表に表示される結果を決定し、測定結果を設定します。糸球体の伸びの表面積を決定するには、オプション領域をアクティブにし、ラベルを表示します。[OK] をクリックします。
    4. 糸球体の伸びの表面積を決定するには、糸球体の成長の周りにフリーハンドの選択を描きます。 解析 をクリックして測定すると、以前に決定したスケールでの成長の表面積を示す結果表がImageJにポップアップ表示されます(ステップ4.4、例えば、mm2を参照)。

5. 糸球体細胞の成長の特徴

注:成長の細胞組成を評価するために、t = 6日の糸球体の成長に対して細胞特異的マーカーの免疫蛍光染色が行われる。

  1. 慎重に媒体を取り出し、リン酸緩衝生理食塩(PBS)を使用して糸球体を2回軽く洗います。
  2. PBSで4%(w/v)スクロースを補った2%(w/v)パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して室温で10分間固定し、PBSを使用して2倍慎重に洗浄します。
  3. PBS-ovine血清アルブミン(BSA)1%(v/v)で1%室温で希釈した適切な濃度(材料表)を有する一次抗体と共にインキュベートする。
  4. 抗体溶液を取り除き、PBSで3倍丁寧に洗浄します。
  5. PBS-BSA 1%(v/v)で暗い温度で45分間、2次抗体(材料表)をインキュベートします。
  6. PBSで3倍を慎重に洗浄し、4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)を用いた水性取り付け媒体の1-2滴を使用して取り付け、核を視覚化し、丸いカバースリップでウェルを覆います。
  7. 蛍光顕微鏡を使用して顕微鏡画像を撮ります。

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結果

糸球体伸成長アッセイを実行する方法の系統図を 図1に示す。 図2A-Dは 、光顕微鏡を用いて観察された異なる時点でのカプセル化糸球体の成長を示す。成長は、マウス腎臓からの糸球体分離後の培養における2日目、4日目および6日目(図2B-D)に示される。成長細胞が頭頂上皮細胞であることを検証するために、脱カプセル化糸球体は 図2E,Fに示すように6日間も単離および培養されている。脱カプセル化糸球体は6日以内の培養期間中に細胞の伸びを示さなかった。 図3において、免疫蛍光染色は、異なる頭頂上皮細胞マーカー、ポドサイト特異的マーカーならびに内皮細胞マーカーに対して行った。この結果は、成長...

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ディスカッション

本稿で説明したプロトコルを用いて、単一のカプセル化糸球体を用いて、頭頂頭上皮細胞の増殖を評価することができる。このex vivoモデルは、頭頂皮細胞活性化に関与する分子経路を詳細に研究することを可能にする。記載された方法は、腎臓解剖およびふるい分けの単純な概念に依存して、糸球体を単離および培養し、異なる実験条件下での頭頂皮細胞の増殖および/または移動を比較する。培養で6日後に分析できる結果は、例えば、成長の表面積または直径、または単一のカプシュ状糸球体の成長細胞の数である。このアッセイのもう一つの応用は、頭頂頭上皮細胞活性化に関与する可能性のある分子経路を誘導または阻害する薬物の効果を研究することである。

免疫蛍光染色は、培養6日後の成長細胞が頭頂上皮細胞マーカー(CD44、クローディン-1、SSeCKS)に陽性に染色された上頭頂皮細胞であることを確認したが、シナプトポジン、内皮細胞マーカーCD311もポドサイト特異的マーカーを発現しなかった。染色の結果に沿って、単一の脱カプセル化糸球体の分離および培養の6日後に成長細胞は観察されず、この6日間の期間内に細胞の成長中の他の糸球体細胞...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、オランダ腎臓財団(助成金14A3D104)とオランダ科学研究機構(NWO VIDI助成金:016.156.363)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
24ウェル細胞培養プレートCorning Costar
anti-CD31BD Pharmingen内皮細胞マーカー (使用濃度 1:200)
ニワトリ抗ラット Alexa 647Thermo Fisher (使用濃度 1:200)
DAPI-Fluoromount GSouthern BiotechDAPI
デジタル倒立光学顕微鏡Westburg, EVOS FL顕微鏡
ロバ-抗ヤギ Alexa 568Thermo Fisher (使用濃度 1:200)
ロバ-抗ウサギ アレクサ568サーモフィッシャー (使用濃度1:200)
ダルベッコのモディファイドイーグルの媒体 ロンザ
EBMミディアムロンザ
EBM-MVシングルクォートキットヒドロコルチゾン、hEGF、GA-1000、FBSおよびBBEロンザ
ウシ胎児血清ロンザ
胎児子牛血清ロンザ
蛍光顕微鏡カマイクロシステムズGmbH
ヤギ-抗シナプトポジンサンタクルスポドサイトマーカー (使用濃度 1:200)
ハンクスのバランスの取れた塩溶液Gibco
ImageJ ソフトウェアフィジー 1.51n
ペトリ皿Sarstedtサイズ 100
ウサギ-抗クローディン1アブカム頭頂上皮細胞マーカー (使用濃度 1:100)
ウサギ-抗SSeCKSロズウェルパーク総合がんセンター、バッファロー、ニューヨーク、米国E.ゲルマン博士提供、頭頂上皮細胞マーカー
-抗CD44BDファーミンゲン壁上皮細胞マーカー(使用濃度1:200)
メスルハウゼンサイズ10
ふるい Endecotts Ltdサイズ300&マイクロ;メートル、75&マイクロ;メートル、53&マイクロ;m、スチール
シリンジBD Plastipakサイズ:20 ml
超低アタッチメントマイクロプレート Corning Costar6ウェルプレート
を含む封入剤を含む ライ、ラットダー

参考文献

  1. Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
  2. Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
  3. Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
  4. Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
  5. Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
  6. Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
  7. Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
  8. Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
  9. Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
  10. Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
  11. Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
  12. Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
  13. Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
  14. Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
  15. Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
  16. Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).

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