方法論記事

逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法による無細胞タンパク質合成代謝の絶対定量

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DOI：

10.3791/60329

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2019年10月25日

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1Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、無細胞タンパク質合成反応において中枢炭素およびエネルギー代謝に関与する40種類の化合物を定量するための堅牢なプロトコルを提示する。無細胞合成混合物は、逆相液体クロマトグラフィーを用いて効果的な分離のためにアニリンで誘導体化され、同位体標識内部標準を用いて質量分析法によって定量される。

要約

無細胞タンパク質合成(CFPS)は、タンパク質のインビトロ産生のためのシステムおよび合成生物学における新しい技術です。しかし、CFPSが研究室を超えて、時間の製造技術の中で普及し、標準になる場合は、これらのシステムの性能限界を理解する必要があります。この問題に対して、CFPS反応における糖分解、ペントースリン酸経路、トリカルボン酸サイクル、エネルギー代謝および補因子再生に関与する40の化合物を定量する堅牢なプロトコルを開発しました。この方法では、13個の C-アニリンでタグ付けされた内部標準を使用し、サンプル内の化合物は12個の C-アニリンで誘導体化されます。内部標準および試料を混合し、逆相液体クロマトグラフィー質量分析(LC/MS)によって分析した。化合物の共溶出によりイオン抑制が排除され、平均相関係数が0.988であった2~3桁以上の代謝物濃度の正確な定量が可能となった。40個の化合物のうち5種はアニリンでタグ付けされていないが、CFPSサンプルで検出され、標準的な曲線法で定量された。クロマトグラフィーの実行は、完了するまでに約 10 分かかります。まとめると、CFPSに関与する40の化合物を単一のLC/MSランで分離し、正確に定量する高速で堅牢な方法を開発しました。この方法は、無細胞代謝を特徴付ける包括的かつ正確なアプローチであり、最終的には、無細胞システムの歩留まり、生産性、エネルギー効率を理解し、改善することができます。

概要

無細胞タンパク質合成(CFPS)は、タンパク質や化学物質の製造に有望なプラットフォームであり、従来は生きている細胞のために予約されてきました。無細胞系は、粗細胞抽出物に由来し、細胞増殖1に関連する合併症を排除する。さらに、CFPSは細胞壁の干渉なしで代謝産物および生合成機械への直接アクセスを可能にする。しかし、無細胞プロセスの性能限界に関する根本的な理解が欠けている。代謝物定量のための高スループット法は、代謝の特性評価に貴重であり、代謝計算モデル2、3、4の構築に不可欠である。代謝産物濃度を決定するために使用される一般的な方法には、核磁気共鳴(NMR)、フーリエ形質転換赤外分光法(FT-IR)、酵素系アッセイ、質量分析(MS)5、6、7などがあります。 、8.しかし、これらの方法は、多くの場合、一度に複数の化合物を効率的に測定できないことによって制限され、多くの場合、典型的な無細胞反応よりも大きいサンプルサイズを必要とします。例えば、酵素ベースのアッセイは、多くの場合、実行で単一の化合物を定量するためにのみ使用することができ、無細胞タンパク質合成反応(通常は10〜15°Lスケールで実行される)のように、サンプルサイズが小さい場合に制限されます。一方、NMRは、検出および定量のための代謝産物の高い量を必要とします5. これらの欠点に対して、質量分析法(LC/MS)と連像のクロマトグラフィー法は、高感度および複数の種を同時に測定する能力を含むいくつかの利点を提供する9;しかし、測定される種の数と多様性に伴い、分析の複雑さが大幅に増加します。したがって、LC/MSシステムの高スループットポテンシャルを十分に実現する方法を開発することが重要です。試料中の化合物は液体クロマトグラフィーで分離され、質量分析によって同定される。化合物のシグナルは、その濃度およびイオン化効率に依存し、そこでイオン化は化合物間で変化し得るし、また、サンプルマトリックスに依存し得る。

LC/MSを使用して分析物を定量する場合、サンプルと規格の間で同じイオン化効率を達成することは課題です。また、プロトン親和性および極性10におけるシグナル分割および不均一性による代謝産物多様性に伴う定量化がより困難となる。最後に、試料の共溶出マトリックスは、化合物のイオン化効率にも影響を与え得る。これらの問題に対処するために、代謝産物を化学的に誘導体化し、LC/MSシステムによる分離分解分解分解と感度を高め、場合によっては信号分割を10、11に減少させることができる。化学誘導体化は、代謝産物の特定の官能基をタグ付けして、電荷や疎水性などの物理的性質を調整してイオン化効率を11上げることによって機能する。種々のタグ付け剤は、異なる官能基(例えば、アミン、ヒドロキシル、リン酸塩、カルボン酸など)を標的とするために使用することができる。アニリンは、そのような誘導体化剤の1つが、一度に複数の官能基を標的とし、親水性分子に疎水性成分を加え、それによってその分離分解能およびシグナル12を増加させる。共溶出マトリックスイオン抑制効果に対処するために、ヤンと同僚は、標準が13Cアニリン同位体でタグ付けされ、サンプルと混合されるグループ固有の内部標準技術(GSIST)ラベリングに基づく技術を開発しました。12、13.代謝産物および対応する内部標準は、共溶成以来同じイオン化効率を有し、その強度比を使用して実験試料中の濃度を定量することができます。

本研究では、CFPS反応における糖分解、ペントースリン酸経路、トリカルボン酸サイクル、エネルギー代謝および補因子再生に関与する40の化合物を検出し、定量するプロトコルを開発した。この方法はGSISTアプローチに基づいており、12のC-アニリンと13のC-アニリンを使用して、逆相LC/MSを使用して代謝産物をタグ付け、検出、定量しました。すべての化合物の線形範囲は、平均相関係数0.988の2〜3桁に及んだ。したがって、この方法は、無細胞代謝、および場合によっては全細胞抽出物を問い合わせるための堅牢で正確なアプローチです。

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プロトコル

1. アニリンタグ付け用試薬の調製

  1. pH 4.5で6Mアニリン溶液を調製します。フードで働き、550 μLのアニリンとLCMS等級水の337.5°L、12M塩酸(HCl)の112.5°Lを遠心管に組み合わせます。ボルテックスウェルと4°で保存します。
    注:アニリンは4°Cで2ヶ月間保存することができます。
    注意:アニリンは非常に有毒であり、ヒュームフードで作業する必要があります。塩酸は腐食性が高い
  2. pH 4.5で6M 13Cアニリン溶液を調製します。250 mg の13C6-アニリンと水の132°L、12 M HCl. 渦井戸の44°Lを組み合わせ、4°Cで保存します。
  3. 200 mg/mL N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)溶液を調製する。すべてのサンプルに対して10°Lの水に2mgのEDCを溶かし、渦をよく付ける。
    注:EDC溶液は、反応と同じ日に調製されるべきである。EDCは、アニリン12を有する化合物の誘導体化のための触媒として作用する。

2. 基準の整備

  1. LC/MSグレードの水に溶解したすべての化合物の別々のストック溶液を作る(表1)。
  2. 内部標準的なストックソリューションの準備
    1. ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)、アセチル補酵素A(ACA)、グリセロール3-リン酸(Gly3P)を除くすべての化合物を、適切な体積で組み合わせ、すべての化合物の2 mMのストックソリューションを作成します。
  3. NAD、NADP、FAD、ACA、および Gly3P を適切なボリュームと組み合わせて、2 mM のストック ソリューションを作成します。

3. サンプルの調製 (図 1)

  1. クエンチし、反応に等量の氷冷100%エタノールを加えることによって、無細胞タンパク質合成反応でタンパク質を沈殿させます。サンプルを12,000 x gで遠心分離し、4°Cで15分間。新しい遠心管に上清を移します。
    注:サンプルは、この時点で-80 °Cで保存し、後で分析することができます

4. 標識反応

  1. 12C-アニリン溶液によるラベリングサンプル
    1. 6 μL のサンプルを新しい遠心管に移し、体積を水で 50°L にします。
      注:体積サンプルサイズは、特定のCFPS反応に依存する場合があります。
    2. 200 mg/mL EDC 溶液の 5 μL を追加します。
    3. 12C-アニリン溶液の5°Lを加えます。
      注: アニリン溶液は2つのフェーズに分かれています。反応に加える前によく混ぜます。
    4. 室温で2時間穏やかに振とう反応をボルテックス。
    5. 2時間後、シェーカーからチューブを取り出し、フュームフードで反応にトリエチルアミン(TEA)を1.5μL加えます。
      注:トリエチルアミンは、アニリンタグ付け反応を停止し、化合物を安定化する溶液のpHを上げます。
      注意: トリエチルアミンは有毒であり、目や気道の刺激を引き起こす.
    6. 13,500 x gで3分間遠心分離機。
  2. 13C-アニリン溶液による内部標準のラベリング
    1. 内部原液を50μLの最終容積で80μMに希釈します。
      注:内部標準の濃度は、実験サンプルに近いレベルに調整することができます。
    2. 200 mg/mL EDC 溶液の 5 μL を追加します。
    3. 13C-アニリン溶液の5°Lを加えます。
    4. 室温で2時間穏やかに振とう反応をボルテックス。
    5. 2時間後、シェーカーからチューブを取り出し、ヒュームフードの反応にTEAの1.5 μLを加えます。
    6. 13,500 x gで3分間遠心分離機。
  3. タグ付き内部標準とタグ付きサンプルの組み合わせ
    1. 12C-アニリンラベル付きサンプルの25 μLを、25°Lの13C-アニリンラベル標準と混合します。
    2. オートサンプラーバイアルに転送し、LC/MS手順で分析します。
  4. タグなし代謝産物の標準曲線の作成
    1. タグなし代謝産物(NAD、NADP、FAD、ACA、Gly3P)の希薄な原液を、体積50μLの320μM、80μM、20μM、5μMの最終濃度に希釈します。
    2. 200 mg/mL EDC 溶液の 5 μL を追加します。
    3. 12C-アニリン溶液の5°Lを加えます。
    4. 室温で2時間穏やかに振とう反応をボルテックス。
    5. 2時間後、シェーカーからチューブを取り出し、ヒュームフードの反応にTEAの1.5 μLを加えます。
    6. 13,500 x gで3分間遠心分離機。
    7. 上清をオートサンプラーバイアルに移し、LC/MS手順で分析します。
      注: タグなし代謝産物は、同様のイオン化効率を維持するためにサンプルマトリックスを複製するサンプルと同じ手順に従います。

5. LC/MS手順の設定

  1. 溶剤の調製
    1. 酢酸でpH4.75に調整した5mMトライブチラミン(TBA)水溶液を調製する。
      注:モバイルフェーズのTBAは、分解物が良好な解像度と分離14を達成するのに役立ちます。
    2. アセトニトリル(ACN)で5 mM TBAを準備します。
    3. 5%の水と95%のACNで洗浄溶剤を準備します。
    4. 95%の水と5%のACNでパージ溶媒を準備します。
  2. MS 条件の設定
    1. 質量分析計をプローブ温度520°C、負のキャピラリー電圧-0.8kV、正のキャピラリー電圧0.8kVの負イオンモードに設定し、ソフトウェアを5ポイント/sでデータを取得するように設定します。
    2. 指定した円錐電圧と質量過充電(m/z)値を持つ各代謝産物に対して、選択したイオン記録(SIR)を設定します。表 1を参照してください。
  3. 製造元の指示に従って LC/MS を初期化する
    1. 3分間の溶媒マネージャーにおける主な溶媒ライン。



    11. figure-protocol-1

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結果

概念実証として、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する大腸菌系CFPS系の代謝産物を定量化するプロトコルを用いた。 CFPS反応(14μL)をエタノールで急行し、脱タンパク質化した。その後、CFPSサンプルは12C-アニリンでタグ付けされ、標準は13C-アニリンでタグ付けされました。タグ付けされたサンプルと標準を組み合わせて LC/MS に注入しました (図 1)。内部標準を用いて中枢炭素・エネルギー代謝に関与する40個の代謝産物を検出・定量化した一方、アニリンでタグ付けされなかった代謝産物5名の標準曲線も開発された(図2)。これらの経路に関与する多様な代謝産物は、リン酸化糖、ホスホカルボン酸、カルボン酸、ヌクレオチド、および補因子のクラスであった。アニリンによる誘導体化は、逆相クロマトグラフィー12を用いてより効果的な分離を促進する親水性分子に疎水性部分を導入した。さらに、この方法は、グルコース6-リン酸およ...

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ディスカッション

無細胞システムは細胞壁を持たないため、複雑なサンプル調製を必要とせずに代謝産物や生合成機械に直接アクセスできます。しかし、細胞のない反応系を定量的に調べるための徹底的で堅牢なプロトコルを開発する作業はほとんど行われていない。本研究では、無細胞反応混合物および全細胞抽出物中の代謝産物を定量する高速で堅牢な方法を開発した。細胞を含まない反応や全細胞抽出物など、複雑な混合物中の代謝産物の個別定量は、いくつかの理由で困難である。これらの理由の中心は、化学的多様性です。これらの混合物中に同時に存在する官能基の配列(例えば、カルボン酸、アミン、リン酸塩、ヒドロキシルなど)は、分析の複雑さを大幅に増加させる。これを回避するために、13C内部規格と組み合わせてアニリン誘導体化法を用いて、代謝産物混合物に疎水性成分を導入した。この方法を用いて、1回のLC/MSランで無細胞反応で40個の代謝産物を堅牢に検出し、定量した。この研究では40化合物のうち35種類のプロトコルにタグを付け、残りの5種の化合物は標準曲線法で定量した。以前の研究は、誘導体化を阻害したアミンとリン酸基との間に分子内塩を...

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開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

記載された研究は、国立がん研究所(https://www.cancer.gov/)から1U54CA210184-01賞を通じてがん代謝物理学センターによって支援されました。コンテンツは著者のみ責任であり、必ずしも国立がん研究所や国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
12C アニリンSigma-Aldrich242284アニリン 12C
13C 標識アニリンSigma-Aldrich485797アニリン 13C6
3-ホスホグリセリン酸Sigma-AldrichP88773PG
酢酸フィッシャーサイエンティフィックAC222140010ACE
アセトニトリル、LCMSJT BAKER9829-03ACN
アセチルコエンザイム ASigma-AldrichA2056ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM、2.1 x 150 mm カラムWaters186002353カラム
アデノシン二リン酸Sigma-AldrichA2754ADP
アデノシン一リン酸Sigma-AldrichA1752AMP
アデノシン三リン酸Sigma-AldrichA2383ATP
α-ケトグルタル酸Sigma-AldrichK1128aKG
クエン酸Sigma-Aldrich251275CIT
シチジン二リン酸Sigma-AldrichC9755CDP
シチジン一リン酸Sigma-AldrichC1006CMP
シチジン三リン酸Sigma-AldrichC9274CTP
D-グリセルアルデヒド 3-リン酸Sigma-Aldrich39705GAP
エリスロース 4-リン酸Sigma-AldrichE0377E4P
エタノールSigma-AldrichEX0276EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 遠心分離機FisherScientific遠心分離機
フラビン アデニン ジヌクレオチドSigma-AldrichF6625FAD
フルクトース 1,6-ビスリン酸Sigma-AldrichF6803F16P
フルクトース 6-リン酸Sigma-AldrichF3627F6P
フマル酸塩Sigma-AldrichF8509
FUM グルコン酸 6-リン酸Sigma-AldrichP78776PG
グルコースSigma-AldrichG8270GLC
グルコース 6-リン酸Sigma-AldrichG7879 G6P
グリセロール 3-リン酸Sigma-AldrichG7886Gly3P
グアノシン二リン酸Sigma-AldrichG7127GDP
グアノシン一リン酸Sigma-AldrichG8377GMP
グアノシン三リン酸Sigma-AldrichG8877GTP
塩酸Sigma-Aldrich258148HCl
イソクエン酸Sigma-AldrichI1252ICIT
乳酸Sigma-AldrichL1750LAC
リンゴ酸Sigma-Aldrich02288MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix KitArborBiosciences507024無細胞タンパク質合成
N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N′-エチルカルボジイミド塩酸塩Sigma-Aldrich03449EDC
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドSigma-Aldrich43410NAD
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸Sigma-AldrichN5755NADP
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元Sigma-Aldrich481973NADPH
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元Sigma-AldrichN8129NADH
シュウアセテートSigma-AldrichO4126OAA
ホスホエノールピルビン酸Sigma-AldrichP0564PEP
ピルビン酸Sigma-AldrichP5280PYR
Ribose 5-リン酸Sigma-AldrichR7750R5P
リブロース 5-リン酸CarboSynthMR45852RL5P
セドヘプツロース 7-リン酸CarboSynthMS07457S7P
コハク酸Sigma-AldrichS3674SUCC
トリブチルアミンSigma-Aldrich90780TBA
トリエチルアミンFisherScientificO4884TEA
超純水FisherScientific10977-015水
ウリジン二リン酸Sigma-AldrichU4125UDP
ウリジン一リン酸Sigma-AldrichU6375UMP
ウリジン三リン酸Sigma-AldrichU6625UTP
VWR ヘビーデューティ ボルテックスVWRボルテックス
ウォーター、LCMSJT BAKER9831-03ウォーター
ズ アクイティ H UPLC クラス クオータナリーソルベントマネージャーウォーターズLCMS
ズ アクイティ H UPLC クラスサンプルマネージャー FTNウォーターズLCMS
Waters Acquity Qda 検出器WatersLCMS
Waters Empower 3Watersソフトウェア
Waters LCMS Total Recovery VialWaters186000384cLCMS バイアル
型 型 ウォーター

参考文献

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