逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法による無細胞タンパク質合成代謝の絶対定量

無細胞タンパク質合成(CFPS)は、タンパク質や化学物質の製造に有望なプラットフォームであり、従来は生きている細胞のために予約されてきました。無細胞系は、粗細胞抽出物に由来し、細胞^増殖1に関連する合併症を排除する。さらに、CFPSは細胞壁の干渉なしで代謝産物および生合成機械への直接アクセスを可能にする。しかし、無細胞プロセスの性能限界に関する根本的な理解が欠けている。代謝物定量のための高スループット法は、代謝の特性評価に貴重^{であり、代謝計算モデル2、3、4}の構築に不可欠である。代謝産物濃度を決定するために使用される一般的な方法には、核磁気共鳴(NMR)、フーリエ形質転換赤外分光法(FT-IR)、酵素系アッセイ、質量分析(MS)5、6、7^{などがあります。 、8}.しかし、これらの方法は、多くの場合、一度に複数の化合物を効率的に測定できないことによって制限され、多くの場合、典型的な無細胞反応よりも大きいサンプルサイズを必要とします。例えば、酵素ベースのアッセイは、多くの場合、実行で単一の化合物を定量するためにのみ使用することができ、無細胞タンパク質合成反応(通常は10〜15°Lスケールで実行される)のように、サンプルサイズが小さい場合に制限されます。一方、NMRは、検出および定量のための代謝産物の高い量を必要とします^5. これらの欠点に対して、質量分析法(LC/MS)と連像のクロマトグラフィー法は、高感度および複数の種を同時に測定する能力を含むいくつかの利点を提供^する9;しかし、測定される種の数と多様性に伴い、分析の複雑さが大幅に増加します。したがって、LC/MSシステムの高スループットポテンシャルを十分に実現する方法を開発することが重要です。試料中の化合物は液体クロマトグラフィーで分離され、質量分析によって同定される。化合物のシグナルは、その濃度およびイオン化効率に依存し、そこでイオン化は化合物間で変化し得るし、また、サンプルマトリックスに依存し得る。

LC/MSを使用して分析物を定量する場合、サンプルと規格の間で同じイオン化効率を達成することは課題です。また、プロトン親和性および極^性10におけるシグナル分割および不均一性による代謝産物多様性に伴う定量化がより困難となる。最後に、試料の共溶出マトリックスは、化合物のイオン化効率にも影響を与え得る。これらの問題に対処するために、代謝産物を化学的に誘導体化し、LC/MSシステムによる分離分解分解分解と感度を高め、場合によっては^{信号分割を10、11}に減少させることができる。化学誘導体化は、代謝産物の特定の官能基をタグ付けして、電荷や疎水性などの物理的性質を調整してイオン化効率^を11上げることによって機能する。種々のタグ付け剤は、異なる官能基(例えば、アミン、ヒドロキシル、リン酸塩、カルボン酸など)を標的とするために使用することができる。アニリンは、そのような誘導体化剤の1つが、一度に複数の官能基を標的とし、親水性分子に疎水性成分を加え、それによってその分離分解能および^{シグナル12を}増加させる。共溶出マトリックスイオン抑制効果に対処するために、ヤンと同僚は、標準^が13Cアニリン同位体でタグ付けされ、サンプル^{と混合されるグループ固有の内部標準技術(GSIST)ラベリングに基づく技術を開発しました。12、13}.代謝産物および対応する内部標準は、共溶成以来同じイオン化効率を有し、その強度比を使用して実験試料中の濃度を定量することができます。

本研究では、CFPS反応における糖分解、ペントースリン酸経路、トリカルボン酸サイクル、エネルギー代謝および補因子再生に関与する40の化合物を検出し、定量するプロトコルを開発した。この方法はGSISTアプローチに基づいてお^り、12のC-アニリン^と13のC-アニリンを使用して、逆相LC/MSを使用して代謝産物をタグ付け、検出、定量しました。すべての化合物の線形範囲は、平均相関係数0.988の2〜3桁に及んだ。したがって、この方法は、無細胞代謝、および場合によっては全細胞抽出物を問い合わせるための堅牢で正確なアプローチです。

1. アニリンタグ付け用試薬の調製

1. pH 4.5で6Mアニリン溶液を調製します。フードで働き、550 μLのアニリンとLCMS等級水の337.5°L、12M塩酸(HCl)の112.5°Lを遠心管に組み合わせます。ボルテックスウェルと4°で保存します。
   注:アニリンは4°Cで2ヶ月間保存することができます。
   注意:アニリンは非常に有毒であり、ヒュームフードで作業する必要があります。塩酸は腐食性が高い
2. pH 4.5で6M ^13Cアニリン溶液を調製します。250 mg の¹³C₆-アニリンと水の132°L、12 M HCl. 渦井戸の44°Lを組み合わせ、4°Cで保存します。
3. 200 mg/mL N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)溶液を調製する。すべてのサンプルに対して10°Lの水に2mgのEDCを溶かし、渦をよく付ける。
   注:EDC溶液は、反応と同じ日に調製されるべきである。EDCは、アニ^リン12を有する化合物の誘導体化のための触媒として作用する。

2. 基準の整備

1. LC/MSグレードの水に溶解したすべての化合物の別々のストック溶液を作る(表1)。
2. 内部標準的なストックソリューションの準備
   1. ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)、アセチル補酵素A(ACA)、グリセロール3-リン酸(Gly3P)を除くすべての化合物を、適切な体積で組み合わせ、すべての化合物の2 mMのストックソリューションを作成します。
3. NAD、NADP、FAD、ACA、および Gly3P を適切なボリュームと組み合わせて、2 mM のストック ソリューションを作成します。

3. サンプルの調製 (図 1)

1. クエンチし、反応に等量の氷冷100%エタノールを加えることによって、無細胞タンパク質合成反応でタンパク質を沈殿させます。サンプルを12,000 x gで遠心分離し、4°Cで15分間。新しい遠心管に上清を移します。
   注:サンプルは、この時点で-80 °Cで保存し、後で分析することができます

4. 標識反応

1. ¹²C-アニリン溶液によるラベリングサンプル
   1. 6 μL のサンプルを新しい遠心管に移し、体積を水で 50°L にします。
      注:体積サンプルサイズは、特定のCFPS反応に依存する場合があります。
   2. 200 mg/mL EDC 溶液の 5 μL を追加します。
   3. ¹²C-アニリン溶液の5°Lを加えます。
      注: アニリン溶液は2つのフェーズに分かれています。反応に加える前によく混ぜます。
   4. 室温で2時間穏やかに振とう反応をボルテックス。
   5. 2時間後、シェーカーからチューブを取り出し、フュームフードで反応にトリエチルアミン(TEA)を1.5μL加えます。
      注:トリエチルアミンは、アニリンタグ付け反応を停止し、化合物を安定化する溶液のpHを上げます。
      注意: トリエチルアミンは有毒であり、目や気道の刺激を引き起こす.
   6. 13,500 x gで3分間遠心分離機。
2. ¹³C-アニリン溶液による内部標準のラベリング
   1. 内部原液を50μLの最終容積で80μMに希釈します。
      注:内部標準の濃度は、実験サンプルに近いレベルに調整することができます。
   2. 200 mg/mL EDC 溶液の 5 μL を追加します。
   3. ¹³C-アニリン溶液の5°Lを加えます。
   4. 室温で2時間穏やかに振とう反応をボルテックス。
   5. 2時間後、シェーカーからチューブを取り出し、ヒュームフードの反応にTEAの1.5 μLを加えます。
   6. 13,500 x gで3分間遠心分離機。
3. タグ付き内部標準とタグ付きサンプルの組み合わせ
   1. ¹²C-アニリンラベル付きサンプルの25 μL^{を、25°Lの13}C-アニリンラベル標準と混合します。
   2. オートサンプラーバイアルに転送し、LC/MS手順で分析します。
4. タグなし代謝産物の標準曲線の作成
   1. タグなし代謝産物(NAD、NADP、FAD、ACA、Gly3P)の希薄な原液を、体積50μLの320μM、80μM、20μM、5μMの最終濃度に希釈します。
   2. 200 mg/mL EDC 溶液の 5 μL を追加します。
   3. ¹²C-アニリン溶液の5°Lを加えます。
   4. 室温で2時間穏やかに振とう反応をボルテックス。
   5. 2時間後、シェーカーからチューブを取り出し、ヒュームフードの反応にTEAの1.5 μLを加えます。
   6. 13,500 x gで3分間遠心分離機。
   7. 上清をオートサンプラーバイアルに移し、LC/MS手順で分析します。
      注: タグなし代謝産物は、同様のイオン化効率を維持するためにサンプルマトリックスを複製するサンプルと同じ手順に従います。

5. LC/MS手順の設定

1. 溶剤の調製
   1. 酢酸でpH4.75に調整した5mMトライブチラミン(TBA)水溶液を調製する。
      注:モバイルフェーズのTBAは、分解物が良好な解像度と^分離14を達成するのに役立ちます。
   2. アセトニトリル(ACN)で5 mM TBAを準備します。
   3. 5%の水と95%のACNで洗浄溶剤を準備します。
   4. 95%の水と5%のACNでパージ溶媒を準備します。
2. MS 条件の設定
   1. 質量分析計をプローブ温度520°C、負のキャピラリー電圧-0.8kV、正のキャピラリー電圧0.8kVの負イオンモードに設定し、ソフトウェアを5ポイント/sでデータを取得するように設定します。
   2. 指定した円錐電圧と質量過充電(m/z)値を持つ各代謝産物に対して、選択したイオン記録(SIR)を設定します。表 1を参照してください。
3. 製造元の指示に従って LC/MS を初期化する
   1. 3分間の溶媒マネージャーにおける主な溶媒ライン。
4. 2. 
      

概念実証として、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する大腸菌系CFPS系の代謝産物を定量化するプロトコルを用いた。 CFPS反応(14μL)をエタノールで急行し、脱タンパク質化した。その後、CFPSサンプルは12C-アニリンでタグ付けされ、標準は13C-アニリンでタグ付けされました。タグ付けされたサンプルと標準を組み合わせて LC/MS に注入しました (図 1)。内部標準を用いて中枢炭素・エネルギー代謝に関与する40個の代謝産物を検出・定量化した一方、アニリンでタグ付けされなかった代謝産物5名の標準曲線も開発された(図2)。これらの経路に関与する多様な代謝産物は、リン酸化糖、ホスホカルボン酸、カルボン酸、ヌクレオチド、および補因子のクラスであった。アニリンによる誘導体化は、逆相クロマトグラフィー12を用いてより効果的な分離を促進する親水性分子に疎水性部分を導入した。さらに、この方法は、グルコース6-リン酸およびフルクトース6-リン酸などの構造異性体対を単一のLC/MSランで分離することを可能にした。各化合物の質量過充電量(m/z)比と保持時間は、一度に1mMの化合物を注入し、質量スペクトルをブランクと比較することにより、実験前に同定した(表1)。

すべての化合物の検出限界と直線性の範囲は、0.10μMから400μMまでの標準曲線を生成することによって推定された(表2)。すべての化合物の平均相関係数(R2)は0.988であり、ほとんどの化合物は3オーダーの線形範囲を有していた。3つの化合物は顕著な飽和効果を有し、特に0.1μMから25μMまでの線形範囲を有するα-ケトグルタル酸は、アイソクエン酸およびクエン酸も100μMを超える飽和効果を有していた。

図 1: アニライン タグ付けのワークフローの概略図無細胞タンパク質合成反応は脱タンパク質化され、12C-アニリンでタグ付けされ、標準的なストック混合物は13C-アニリンでタグ付けされます。両方の混合物を1:1の体積比で混合し、LC/MSによって分析します。

図2:40の代謝産物に対して選択されたイオンクロマトグラムを重ね合わせた。40代謝産物の40 μM標準混合物の単一LC/MSランからの質量クロマトグラム。ピークは、各化合物の保持時間とm/z値によって同定された。完全な複合名とその省略形を表 1に示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表1:代謝産物の同定と標識結果各化合物の対応するピーク数、保持時間、標識されていないm/z値、標識された12Cおよび13C、およびMS種。MS種、Aはアニリンタグの略です。

表2:代表的なCFPSサンプルにおける代謝物定量。各代謝産物の濃度と標準偏差。標準曲線から特定された検出の限界、直線性および相関係数の範囲。

著者たちは何も開示する必要はない。