方法論記事

ラットにおける円周食道再建のための組織工学型移植片

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DOI：

10.3791/60349

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2020年2月10日

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1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Seoul National University, College of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Inje University, Gimhae, 3Department of Nature-Inspired Nanoconvergence Systems, Korea Institute of Machinery and Materials

この記事について

サマリー

食道再建は困難な処置であり、食道粘膜や筋肉の再生を可能にし、人工移植として移植できる組織工学的食道の開発が必要である。ここでは、足場製造、バイオリアクター栽培、各種外科技術など、人工食道を生成するためのプロトコルを紹介します。

要約

周食道再建のための生体適合性材料の使用は、ラットでは技術的に困難な作業であり、栄養サポートを備えた最適なインプラント技術が必要です。最近、食道組織工学の試みが多く行われているが、蠕動の特殊環境における早期上皮化の困難により成功率が制限されている。ここでは、2層管状足場、間葉系幹細胞ベースのバイオリアクターシステム、変性を有するバイパス給餌技術を通じて食道粘膜および筋肉層の再生を改善できる人工食道を開発しました。胃腸炎。足場は、外壁に巻かれた3次元(3D)印刷ポリカプロラクタンストランドを有する円筒形のポリウレタン(PU)ナノファイバーで作られています。移植前に、ヒト由来間葉系幹細胞を足場の内腔に播種し、細胞反応性を高めるバイオリアクター栽培を行った。手術用吻合を適用し、移植された補綴物を甲状腺フラップで覆い、続いて一時的な非経口胃切り出しを行うことで、移植片の生存率を改善した。これらの移植片は、組織学的分析によって示されるように、移植された部位の周りの最初の上皮化および筋肉再生の知見を要約することができた。また、移植片の周辺部ではエラスチン繊維の増加および新血管形成が認められた。したがって、このモデルは、周食道再建のための潜在的な新しい技術を提示する。

概要

先天性奇形や食道癌などの食道障害の治療は、食道の構造セグメント喪失につながる可能性があります。ほとんどの場合、胃プルアップ導管や結腸の入管などの自家置換移植片は、1,2を行なわれている。しかし、これらの食道置換は、様々な外科的合併症および再操作リスク3を有する。したがって、天然食道を模倣した組織工学的食道足場の使用は、最終的に失われた組織4、5、6を再生するための有望な代替戦略となり得る。

組織工学的食道は、食道欠損の現在の治療法に代わる可能性がありますが、生体内での適用には重大な障壁があります。移植された食道足場の術後の解剖学的漏出および壊死は、必然的に、網介素7のような周囲の無菌空間の致死的な感染につながる。したがって、創傷および胃チューブにおける食物または唾液汚染を防止することが極めて重要である。胃の治療または静脈内栄養は、原発性創傷治癒が完了するまで考慮されるべきである。これまで、大動物は足場8の注入後2〜4週間静脈内過敏によってのみ送ることができるので、食道組織工学は大型動物モデルで行われてきた。しかし、このような非経口摂食モデルは、小動物における食道移植後の早期生存のために確立されていない。これは、動物が非常に活発で制御不能であったため、長時間胃の中に給餌管を入れておくことができなかったためです。このため、小動物の食道移植に成功した症例は少なかった。

食道組織工学の状況を考慮して、エレクトロスパンナノファイバー(内層;)図1A)と3Dプリントされたストランド(外側の層;図1B)は、変性胃管選択術を含む。内部ナノファイバーは、非分解性ポリマーであるPUで作られており、食品や唾液の漏洩を防ぎます。外部の3Dプリントストランドは、機械的柔軟性を提供し、蠕動態に適応することができる生分解性ポリカプロラクテン(PCL)で作られています。ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(hAD-MSCs)を足場の内層に播種し、再上皮化を促進した。ナノファイバー構造は、細胞移動のための構造細胞外マトリックス(ECM)環境を提供することによって初期粘膜再生を容易にすることができる。

また、バイオリアクター栽培を通じて、接種細胞の生存率と生物活性を向上させてきた。埋め込まれた足場は、食道粘膜および筋肉層のより安定した再生を可能にするために甲状腺フラップで覆われていた。このレポートでは、足場製造、間葉系幹細胞ベースのバイオリアクター栽培、変性胃細胞切除術を伴うバイパス給餌技術、改変手術などの食道組織工学技術のプロトコルについて説明します。ラットモデルにおける周食道再建のための吻合法

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プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、ソウル大学病院の機関動物管理および使用委員会(IACUC No.17-0164-S1A0)によって承認されています。

1. 足場製造

注:2層食道足場は、エレクトロスピニングと3Dプリントを組み合わせて製造されています。管状足場の内膜を、コレクタ9として回転ステンレス製のマンドレルを用いてポリウレタン(PU)をエレクトロスピニングして製作した。

  1. 管状PUナノファイバーの調製のために、室温で8時間N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)で攪拌することによりPUポリマーの20%(w/v)溶液を調製する。
  2. PU溶液を鈍い金属針(22G)でシリンジ上に置き、針先と回転コレクタの間の距離30cmの回転ステンレス製のマンドレル(直径= 2mm)にエレクトロスピンを置きます。
    メモ:電源は、15 kV電位の高電圧直流に設定されています。溶液の供給速度は、シリンジポンプを使用して0.5 mL/hで固定されます。
  3. 3.14 m/s で回転するマンドレルの表面に管状のナノファイバー層を作ります。
  4. PUナノファイバーを真空オーブンで40°Cで一晩乾燥させて、残留溶媒を完全に除去します。
    注:食道足場の3Dプリントされた外壁は、ラピッドプロトタイピングシステムを使用して調製されます。3Dプリント装置は、ディスペンサー、ノズル、圧縮/熱コントローラ、3軸変換ステージ、ソフトウェアシステムで構成されています。
  5. PCLペレットは加熱シリンダー内で100°Cで溶解し、バイオプロットシステムの制御下で高圧(7bar)でナノファイバーの表面に印刷されます。ノズルのサイズは300μm、ストランド距離は700μmです。
  6. マンドレルから2層足場を取り除いた後、紫外線下で70%エタノールに浸して殺菌する。
    注: 足場のより詳細な特徴は、以前の研究で報告されています10.

2. 移植片とバイオリアクター栽培における細胞播種

注:企業から購入したヒト脂肪由来間葉系幹細胞(hMSC)は、修飾なしで使用されました。

  1. 細胞移植の前に、紫外線の下で1時間の3Dプリントされた食道足場を殺菌し、エタノールで10分間湿潤させ、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3倍洗浄する。
  2. 培養と成長培地中のhMSCsを拡大します (基礎培地/成長サプリメント).2層の管状足場を非接着体24ウェル組織培養プレートに移した。
  3. 細胞を足場の内面に取り付けるには、成長培地を含む基細胞マトリックスに1 x 106セル/mLの密度でhMSC懸濁液を静かに加えます。
  4. 基心膜マトリックス懸濁液を2層管状足場の内面に均一に堆積させる。
  5. 脈動流バイオリアクターシステムを使用して、hMSCシードの管状足場をバイオリアクターの培養室のアクリルホルダーにしっかりと固定する。
    注:カスタム設計のバイオリアクターシステムはポンプ、泡のトラップ、流れの部屋、圧力計、制御可能な弁および媒体の貯蔵所から成っている。培養室でせん断応力を適用する場合は、1〜2分11の休憩時間を許可します。
  6. 培養室に成長培地を加え、5%CO210を含む加湿雰囲気下で0.1ダイン/cm2流れ誘起剪断応力を加える。
    注:流れ誘起剪断応力の値は、前の研究から人体由来の食道組織の蠕動をシミュレートすることによって算出した10。
  7. メーカーの指示に従って、LIVE/DEAD Viabilityアッセイキットを使用して、バイオリアクター栽培を行わずに2層管状足場の内面の細胞応答を決定します。Zスタックツールを使用して共焦点顕微鏡で画像を取得します。
  8. 3日目には、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いてhMSC播種管状足場の表面形態を観察した。
    1. hMSCで2.5%グルタルアルデヒドとOsO4でインキュベートした足場を24時間固定し、エタノールで脱水します。
    2. アルゴン大気条件下でスパッタコーターを使用して固定hMSCを白金でコーティングし、25kVの加速電圧でSEM画像を取得します。

3. 動物外科手術の手術準備

注:外科的製剤は、胃切り出し術と食道移植の両方の前に適用されます。

  1. 滅菌手術器具を設定する:メスブレード、ワイトラナーレトラクター、マイクロニードルホルダー、マイクロ縫製鉗子、マイクロチス鉗子、マイクロシザー、メイヨーヘガーニーホルダー、操作ハサミ、アイリスハサミ、ドレッシング鉗子、ティッシュ鉗子、スプリンター鉗子、虹彩鉗子、5 mLシリンジ(21G針)、10 mLシリンジ(22G針)、9-0ポリアミド縫合糸、4-0ポリグラクチン縫合。
  2. チレタミン/ゾラゼパム(50 mg/g用量)および2%キシラジン塩酸塩(2mg/kg用量)の筋肉内注射で動物を麻酔する。
    注:398-420gの成人スプレイグ・ドーリー(SD)ラットは食道移植に使用した。
  3. 外科用ドレープに移る前に、鉗子で尾をつまんで動物の適切な麻酔状態を確認してください。
  4. 無菌ドレープの上の上の上の強引な位置に動物を置き、首(食道移植用)または腹部(胃切除用)から髪を取り除くためにバリカンを使用します。その後、手術部位をベタジンと70%エタノールでスクラブする。
  5. 切開前に、皮下にブプレノルフィン(0.05-0.1 mg/kg)などの鎮痛薬を痛みの軽減のために注入する。

4. ラットのT管を用いた胃手術

注:一時的なバイパス非経口チューブ供給を可能にするために、すべての実験動物で改変された胃切りは行われた(n = 5)。

  1. 手術の前日にラットを速くする。セクション3のように手術を準備します。
  2. 麻酔ラットの皮膚と腹部の筋肉の正中線切開を通して胃を露出させる。
  3. メスの刃で前の胃壁に3mmのオリフィスを作成します。
  4. シリコンT管の先端を欠陥部位に挿入し、胃壁に固定します。
  5. T管が胃壁から切り離されないように適切に縫合する。
  6. 皮下トンネルを通って、移植されたT管の遠位端を首の後ろに取り出す。
  7. ヘパリンキャップをT管の端に挿入し、胃の内容物が後方に流れないようにします。
    注:血管カテーテルを使用して、T管の端をヘパリンキャップで接続します。
  8. 4-0ポリグラクチン縫合を使用して腹壁および皮膚のすべての層を縫合する。
  9. 胃切開が完了した後、すべての実験ラットを代謝ケージ内で分離してください。

5. 食道移植

注:二層管状足場の食道移植は、胃切り出し後1週間(n =5)で行われます。移植前に、hMSCs(細胞密度:基下膜マトリックスで1×106細胞/mL)を各足場の内壁に入れ、バイオリアクターシステムで3日間インキュベートした。外科的処置は以下の通りである。

  1. モデル動物の首の毛を取り除き、無菌手術のための外科部位の標準的なドレープを行う。
    注:動物のセプティック手術を維持するために大きなシェービング領域を作成することをお勧めします。
  2. 首の前中央切開後、ストラップの筋肉を分離し、気管食道構造を露出させる。
  3. セグメントを切除する前に食道から迷走神経をぶっきらぼうに解剖し、そうでなければ動物の呼吸が損なわれる。
  4. 拡大下では、食道の左側を気管から分離し、甲状腺から上部を慎重に分離する。
  5. 外科はさみを使用して食道のすべての層を含む5 mmの全円周欠陥を作成する。
    注:食道移植の前に、手術用はさみを使って準備した足場を切り、移植部位の長さに合わせるようにしてください。
  6. 顕微鏡下で、9-0縫合糸を用いて遠位食道欠損の両端で微小吻合を行う。上食道残骸と足場の右の下の後部のマージンの間に最初の縫合糸を置きます。上食道残骸と足場の間で右から左に縫合を続けます。下食道残骸の上マージンと同様に足場を吻合する。
    注:食道移植の臨床手術で使用される微小血管吻血を行う。インプラント部位の精密で、水密の縫合のための顕微鏡との仕事。
  7. その後、移植部位の上に周囲の甲状腺の羽ばたきを置き、移植片への安定した維持と血管供給を確保する。
  8. 移植後、皮下筋肉と皮膚組織を4-0ビクリル縫合糸で縫合する。
  9. すべての実験ラットを代謝ケージに個別に保管します。

6. 術後手続き

注:術後の手順は、胃切り出し術と食道移植の両方の後に行われます。

  1. 腹部の傷の閉鎖後、ラットを個々の代謝ケージに入れ、低体温を防ぐために赤外線加温装置にケージを置く。
  2. 動物が胸の骨の上に直立するまで動物を監視し、胸の上に直立して維持する。
  3. 外科現場での炎症を最小限に抑えるために、抗生物質ゲンタマイシン(20mg/kg)をラットに毎日投与する。
  4. 研究の終点まで3回目の術後日に経口液体摂食を開始する。手術後1日から1日あたり3倍のヘパリンキャップを通して、栄養の全処方(20.6g/100 ml [g%]炭水化物、3.8g%タンパク質、0.2g%脂肪)を供給します。
  5. 動物の外見と体重を毎日チェックしてください。自傷切り傷部位やチューブ摂取量に対する抵抗性、ならびに様々な外科的合併症などの行動を管理するためにチェックしてください。ラットモデルの体重が20%以上急激に減少すると、CO2吸入による安楽死を行う。

7. ヒストロジーと免疫学

注:組織学的分析のために、安楽死動物の食道組織のすべてが外科用はさみを使用して抽出されます。ヘマトキシリンおよびエオジン染色およびマッソンのトリクローム染色は、標準的な組織学的手法を用いて行った。免疫賦用化学は、以下のプロトコルに従って行った。

  1. 移植した部位を含む食道全体を4%パラホルムアルデヒドで固定します。パラフィンブロックを作成し、4 μmの厚いセクションをカットします。
  2. 組織切片を脱パラフィン化し、エタノールシリーズで脱水する。組織のスライドをクエン酸バッファーに浸し、電子レンジで10分間加熱します。冷たいPBSで20分間冷やして細胞を冷やし、過酸化水素を3%6分間浸し、PBSで10分間洗浄します。
  3. 3%ウシ血清アルブミン(BSA)で室温で1時間インキュベートし、組織切片の非特異的反応を阻止する。
  4. PBSを5分間PBSで洗浄し(1:200に希釈)、ケラチン13(1:100に希釈)、フォン・ヴィレブラント・ファクター(vWF;1:100に希釈)を4°Cで一晩インキュベートします。
  5. PBSで3倍の洗浄を行い、15分間、適切な二次抗体を濃度1:500で、デスミンとケラチン13を室温で洗浄します。次に、10分間PBSでスライドを2回洗浄します。
    注:vWFの組織切片は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合キット(材料表を参照)を用いてインキュベートし、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)を用いて可視化した。
  6. ガラスカバースリップと4'、6-ジアミディノ-2-フェノリンドル(DAPI)を使用してマウントする。

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結果

図1はPU-PCL2層管状足場の製造工程の概略図を示す。PU溶液を18G針からエレクトロスパンし、厚さ200μmの円筒状の内部構造を作った。次いで、溶融したPCLをPUナノファイバーの外壁に一定間隔で印刷した。完成した管状足場の内壁と外壁の表面形態は、走査型電子顕微鏡画像で見ることができる。

図2は、ラットに胃腸管を挿入して外部栄養を供給するプロセスを示しています(図2A)。T字型シリコーンチューブを胃壁に挿入し、縫合した(図2B)。その後、チューブを皮下トンネルを通って頸部の後ろに移動し、ヘパリンキャップで接続した(

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ディスカッション

人工食道に関する既存の動物研究は、依然としていくつかの重要な要因によって制限されています。理想的な人工食道足場は、生体適合性を持ち、優れた物理的特性を有する必要があります。手術後の初期の期間に粘膜上皮を再生して、解剖学的漏れを防ぐことができるはずです。内側の円形および外側縦方向の筋肉層の再生は、機能的蠕動12、13にとっても重要である。

食道の機械的特性は呼吸中に食道が崩壊し、嚥下中に開き、反動現象14で最大伸張に一定の暴露を伴うので不可欠である。植え付け足場は、同様にこれらの機械的特性を持っている必要があります。移植された食道の粘弾性は、食道を通る蠕動運動の繰り返しのランプ緩和に適しているべきである。弱すぎる足場は、破裂や漏れ、受信者の重篤な状態(例えば、媒介炎)を引き起こす可能性があります。対照的に、硬すぎる足場は食道のルーメンに膨らみ、食べ物の通路を妨げる可能性があります。エレクトロスパンナノファイバーは食道再建...

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開示事項

本研究のために設計されたバイオリアクターシステムは、製品化されています(モデル番号:ACBF-100)。

謝辞

本研究は、韓国保健産業開発研究所(KHIDI)を通じて韓国保健技術研究開発プロジェクトを支援し、厚生省(助成番号:HI16C0362)と基礎科学研究文部省が資金を提供する国立韓国研究財団(NRF)を通じたプログラム(2017R1C1B2011132)。本研究で使用された生物標本とデータは、韓国バイオバンクネットワークのメンバーであるソウル国立大学病院のバイオバンクによって提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
メタボリックケージTEUNGDO BIO &PLANTJD-C-66
Zoletil (50 mg/g 用量)Virbac1000000188
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-056
1 mL シリンジBD309659
2% キシラジン塩酸塩 (Rumpun)ByelyQ-0615-035
4% パラホルムアルデヒドBIOSOLUTIONBP031
4-0 VicrylエチコンW9443
9-0 VicrylエチコンW2813
抗生物質ゲンタマイシン (セプトパル).Septopal0409-1207-03
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma5470
クエン酸緩衝液、ph6.0、10XSigmaC9999
DAB ペルオキシダーゼ基質キットベクターSK4100
DesminSanta Cruzsc-23879
弾性染色キットScyTeKETS-1
エタノールメルク100983
エタノールメルク64-17-5
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco16000-044
グルタルアルデヒド Σ354400
ヤギ抗マウス IgG (H+L) 二次抗体サーモフィッシャーA-11001
ヘパリンキャップHyupsung MedicalHS-T-05
hMSC (STEMPRO) / Growth Medium
(MesenPRO RSTM)		InvitrogenR7788-110
西洋わさびペルオキシダーゼ結合キット (Vectastain)VECTORPK7800
過酸化水素純生7722-84-1
Keratin13NovusNBP1-97797
LIVE/DEAD 生存率アッセイキットMolecular ProbesL3224
マトリゲルコーニング354262
N,N-ジメチルホルムアミド (DMF)Sigma227056
Nonadherent
24ウェル組織培養プレートです。		Corning3738
OsO4SigmaO5500
ペトリ皿エッペンドルフ3072115
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Gibco10010-023
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、10XBIOSOLUTIONBP007a
ポリカプロラクトン (PCL) ポリマーSigma440744
ポリウレタン(PU + A2:A24)ポリマーLubrizol2363-80AE
電源NanoNCHV100
ProLong Gold退色防止試薬とDAPIインビトロジェンP36931
ンプンバイエルQ-0615-035
TチューブSewoonMedical2206-005
マイシンアイ軟膏ファイザーファーマシューティカルコリアW01890011
チレタミン/ゾラゼパム(ゾレチル)Virbac LaboratoriesQ-0042-058
トリクローム染色キットScyTeKTRM-1
von Willebrand Factor (vWF)Santa Cruzsc 14014
ルシリコーンテラ

参考文献

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