鉄制限性抗酸菌による細胞外小胞の単離と特徴付け

サマリー

結核菌は、低鉄条件に応答して細胞外小胞の産生および放出の増加を示す。本研究では、鉄欠乏症に反応して放出されるマイコバクテリア細胞外小胞の精製および特性評価のための低鉄条件および特性評価のための方法を生成するためのプロトコルを詳しく説明する。

要約

ヒト結核の原因物質である結核菌(Mtb)を含む抗酸菌は、免疫学的に活性な分子を含む細胞外小胞(EV)を自然放出する。小胞生体形成の分子機構、小胞の含有量、および病原体宿主界面におけるその機能に関する知識は非常に限られている。これらの質問に対処するには、EVの分離、精製、検証のための厳格な手順が必要です。以前は、結核が鉄制限にさらされたとき、小胞産生が増強され、宿主環境でMtbが遭遇した状態であることが判明した。ここでは、鉄欠乏性抗酸菌からEVを分離および精製するための完全で詳細なプロトコルです。定量的および定性的な方法が適用され、精製された EV が検証されます。

概要

マイコバクテリア細胞外小胞(MEV)は、膜結合ナノ粒子であり、60−300nmの大きさで、速く成長する抗酸^菌1によって自然に放出される。病原性マイコバクテリアによって放出されるMEVは、免疫学的に活性なタンパク質、脂質、および糖脂質を介して宿主と相互作用するメカニズムを構成し、濃縮および保護された方法で分泌^{される2、3、4である。}MEVを特徴付け、その生体発生と機能を理解するためには、小胞の浄化と検証の厳格かつ効率的な方法が不可欠です。これまで、MEVは鉄分が豊富な^{培地1、5、6、7、8}で増殖したマイコバクテリアの培養濾液から単離されてきた。

しかし、以前の研究は、鉄の制限がMtbの小胞放出を大きく刺激することを実証し、おそらくMEV⁹で分泌されるシデラクチを介して鉄を捕捉する。高鉄培地で培養したMtbからMEVを分離する手順は説明されているが、低鉄培養物からMEVを得るための効率的な方法論は報告されていない。したがって、この方法の目的は、低鉄培養物から得られたMEVを単離、精製、定量し、生化学的および機能的アッセイやマイコバクテリアにおける小胞産生の遺伝的決定要因の分析に使用することです。

プロトコル

1. 鉄枯渇定義媒体の調製

1. _KH2PO4の5g、L-アスパラギン5g、グリセロール20mL、脱イオン水2gをプラスチック容器に900mLで溶解して1Lの最小培地(MM)を調製する。鉄の汚染を防ぐためにガラスを避けてください。pHを5 N NaOHで6.8に調整し、体積を水で1Lに調整します。
2. 50gの金属キレート樹脂(MCR)を加え、磁気攪拌バーを4°Cで24時間軽く攪拌します。プラスチック受信機で0.22μmフィルターユニットを通してろ過することにより、MCRを殺菌し、取り外します。ろ過を加速し、フィルターの詰まりを防ぐために、濾過前に約30分間樹脂堆積物を入れましょう。
   注:この培地は、原子吸光分析法により決定される2μM未満の残留鉄を含む。
3. サプリメント MM の ZnCl_2,MgSO₄の 40 mg/L , MnSO₄の 0.1 mg/L .別途、脱イオン水中の各金属サプリメントの濃縮株(1,000x)を調製し、MM補充前に濾過により殺菌する。鉄枯渇、金属補充MMは、ここで低鉄MM(LIMM)と呼ばれる。
4. 10 mM HClに溶解したFeCl₃の50 mMストックから、LIMMの1L(50μM最終濃度)に1mLを加えて、高鉄MM(HIMM)を調製します。

2. 鉄制限条件下での菌菌の増殖

1. Mtbの凍結した15%グリセロールストックの50μLを解凍し、10%ADNエンリッチメント(5g/Lアルブミン、2g/Lデキストロース、および0.85 g/L塩化ナトリウム、0.2%グリセロールおよび0.05%Tween-80)10を補った寒天プレートをストリーク。コロニーが見えるまで37°Cでプレートをインキュベートします。
2. ADN濃縮を補足したマイコバクテリアブロス培地(材料表)の2mL中のMtb¹⁰の単一コロニーを接種する。37°Cで攪拌を伴うインキュベート。
3. Mtb培養物を後期対数期(OD₅₄₀は~0.8)まで成長させる。これを確認するには、分光光度計を用_いてOD540を測定する。
4. 0.2%グリセロール、0.05%トゥイーン-80、およびADNを補充したマイコバクテリア寒天プレート(材料表)に後期対数培養物の200μLを広げます。少なくとも5枚のプレートを接種する。細菌の増殖がコンフルエント層として見えるまで、プレートを37°Cでインキュベートします。Mtbの場合、この処理には約 1 週間かかります。
5. LIMMで無菌綿棒を濡らします。この綿棒を使用して寒天プレートから細菌を収集し、LIMMの100 mLを接種し、約1.0_のOD540で濃縮細菌懸濁液を調製します。
6. この懸濁液をLIMMで1Lに10回希釈し、2本の2L滅菌ペットボトルに分け、それぞれ500mLの培養物を含む。
7. 2 mL の培養物を取り出し、5 mL 培養管に移します。10%vol/volタイロキサポリの10°Lを加えます。
8. 培養物を37°Cで14日間培養する。

3. MEVのコレクション

1. 採取時の2mL培養物_のOD540を測定する。ADNと0.05%Tween-80で寒天プレート上の各希釈の培養およびプレート100°Lの1:10シリアル希釈を行います。
2. 培養物を5本の225mL円錐円管に移し、遠心分離機を2,850 x gで20°Cで7分間移動します。
3. 50 mLピペットで培養上清を収集し、0.22μmフィルターユニットを通して殺菌します。

4. MEVの分離

1. 4°Cに入れた攪拌セル限外濾過システムに濾液を移し、100kDaカットオフ膜を通して<50 psiの濃縮物を〜50mLに濾過します。
2. 濃縮培養物を15,000xgで4°Cで15分間遠心分離し、上清を回収する。
3. ポリカーボネート超遠心分離管中の培養濾液を100,000 x gで4°Cで2時間分遠心分離する。
4. 穏やかなピペットによって無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の合計1 mLで膜状ペレットを再スレド。
5. ステップ4.4で得られたペレット懸濁液の0.5 mLを60%のジオオキサノール溶液の1.5 mLで混合し、最終的なイオジキサノール濃度45%重量/vol.を生み出し、この混合物を13mm x 51mmポリプロピレン薄壁の薄い層状の超セントリフュージチューブの底部に塗布する。
6. MEV-iodixanol 45%懸濁液を1mL40%、35%、30%、25%、20%(PBSのvol/vol)と1mLのPBSを上部に重ね合えます。
7. 4 °Cで18時間のための100,000 x gで遠心分離機。
8. 1 mL ハミルトンシリンジを使用して、上から始まる 1 mL 密度勾配分を収集します。
9. 収集した各画分をPBSで20mLに希釈し、遠心分離機を100,000 x gで4°Cで2時間希釈します。
10. 上清を取り外し、0.5 mLのPBSでペレットをサスペンドします。このペレットは4°Cで保管してください。

5. MEVの定量化

1. ブラッドフォードアッセイ(材料表)によって各画分のタンパク質濃度を測定します。
2. 膜脂質分析を実行します。
   1. 蛍光膜プローブ1-(4-トリメチルアンモニウムフェニル)-6-フェニル-1,3,3,5-ヘキサトリエンp-トルエンスルホン酸塩(TMA-DPH)を用いて各勾画の10μLを96ウェルブラックのPBSの最終濃度1μg/mLでインキュベートするプレート。
   2. プレートを33°Cで20分間インキュベートします。
   3. 360 nm励起および430 nmの放出で蛍光を測定する。

6. MEVの定性分析

1. タンパク質電気泳動を行う。
   1. 16 μLの MEV サンプルを 16 μL に混合し、5x サンプルローディング バッファー (10% w/v SDS、10 mM ジチオトライトール、20% v/v グリセロール 0.2 M Tris-HCl、pH 6.8 0.05% w/v ブロモフェノール ブルー) を 5 5 5 m でサンプルバッファーで加熱します。
   2. 10%トリス/グリシンSDS-ポリアクリルアミド^ゲル11にロードし、青色染料前面がゲルの底部に達するまで、ランニングバッファ(25 mMトリスベース、190 mMグリシン、0.1%SDS)で10V/cmで実行します。
   3. 超高感度タンパク質染色液でゲルを染色します (材料表)。
2. ドットブロットを実行します。
   1. 約0.5μg/μLの濃度を持つMEVサスペンションの2μLをロードし、ニトロセルロース膜上に2倍のシリアル希釈をロードし、メーカーの指示に従ってドットブロットのプロセスを行います。
   2. 一次抗体として1:5,000の希釈でMEVの調製に対してマウスで上げられた抗血清を使用し、二次抗体として1:10,000希釈でホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)に結合したヤギ抗マウスを使用する。適切なHRP基板ブロッティング検出試薬とイメージングシステムを用いて抗原抗体複合体を検出します。
3. 負の染色と電子顕微鏡を行います。
   1. 250 μLのMEVを0.1 Mカコダイレートで0.1 Mカコダイレートで2%のカコダイレートで2時間固定し、4%ホルムアルデヒド、1%グルタルアルデヒド、0.1%PBSで一晩インキュベートします。
   2. 固定サンプルを2%の四酸化オスミウムで90分間染色します。
   3. 試料をエタノールで連続的に脱水し、スパーのエポキシ樹脂に埋め込みます。
   4. 透過型電子顕微鏡でMEVを観察します。

結果

MEVは密度勾配の差動沈下により精製した(図1、図2)。記載された条件下で、MEVは主に勾配画分3(F3)で分離され、25%のジオオキサンに相当する。この結論は、タンパク質、膜脂質、無傷MEVの顕微鏡的可視化、ナノ粒子サイズ分布、および抗小胞抗血清による陽性反応性の検出に基づいている(図2、図3)。コロニー形成単位に正規化されたタンパク質および脂質濃度(CfUs)は、高鉄条件に対する低鉄におけるMEV収率の約8倍の増加を示した(_図3)。1つの代表的な実験の結果が提示されますが、これはMEVの複数の(>10)分離に基づいて非常に再現可能な結果です。この方法により1Lの低鉄培養物から得られた純粋なMEV収率は約500μgのタンパク質であった。

<...

ディスカッション

真核細胞由来エキソソームを精製する複数の方法が開発^された12.対照的に、細菌^由来EV7を精製するための有効な方法に関する情報は限られています。Mtb由来のEVの効率的な分離は、この病原性マイコバクテリウムの成長における本質的な困難を考慮する必要があります。Mtbは長い分割時間(〜24時間)を有し、バイオセーフティレベル3(BSL-3)条件で扱われるべきである。したがって、MEV分離方法の効率を最適化することが重要である。マイコバクテリアは、粗MEV製剤を凝集して容易に汚染する糖脂質やその他の疎水性分子を培地に放出するので、生化学的および機能的研究を行う前にMEVを精製し、検証することが重要です。Mtbが鉄制限の条件下でMEVの放出を強化することを実証した以前の観測に基づいて、鉄制限された抗酸菌からのEV精製のためのプロトコルが確立されました。また、非毒性M.スメグマティスも低鉄条件に応答してEVの放出を増加させることも確認されている(データは示されていない)。したがって、BSL-2条件でこの細菌からEVを浄化するために同じプ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アミコン攪拌セル モデル108	EMD ミリポア	UFSC40001	細胞限外ろ過システム
BD ポリプロピレン 225 mL コニカルチューブ	フィッシャー	05-538-61	コニカル遠心チューブ
バイオマックス 100 kDa カットオフ限外ろ過膜	EMD ミリポア	PBHK07610	限外ろ過膜
Chelex-100 樹脂	バイオ・ラッド	142-2842	金属キレート樹脂
ミドルブルック 7H10 寒天	BD Difco	262710	マイコバクテリア寒天プレート
ミドルブルック 7H9 ブロス	BD Difco	271310	マイコバクテリアブロス ミディアム
ニトロセルロースブロッティングメンブレン	GE ヘルスケア	10600001	ブロッティングメンブレン
Optiprep	Sigma	D1556	ヨウオジキサノール
ポリカーボネート超遠心分離チューブ 25 mm x 89 mm	ベックマン・コールター	355618	ポリカーボネート超遠心分離チューブ 25 mm x 89 mm
ポリプロピレン薄肉遠心チューブ 13 mm x 15 mm	ベックマン・コールター	344059	ポリプロピレン薄肉遠心チューブ 13 mm x 15 mm
タンパク質アッセイ色素	BioRad	5000006	Bradford タンパク質染色
SYPRO ルビー	分子プローブ	S12000	超高感度蛋白質の汚れ
TMA-DPH	の分子調査	T204	1-(4-トリメチルアンモニウムフェニル)-6-フェニル-1,3,5-ヘキサトリエンp-トルエンスルホン酸塩
真空ろ過フラスコ	CellPro	V50022	フィルターユニット