方法論記事

天然ポリフェノールクルクミンを用いた脳組織におけるアミロイドプラークの標識とイメージング

DOI：

10.3791/60377

⸱

2019年11月1日

 ,  ,  ,  , 
1Field Neurosciences Institute, Ascension St. Mary's Hospital, 2Field Neurosciences Institute Laboratory for Restorative Neurology, Central Michigan University, 3Program in Neuroscience, Central Michigan University, 4Department of Psychology, Central Michigan University, 5Department of Health Sciences, Saginaw Valley State University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

クルクミンは、アミロイドベータタンパク質への優先結合、ならびに他の伝統的なアミロイド結合色素との構造的類似性に起因する脳組織におけるアミロイドベータタンパク質プラークの標識およびイメージングのための理想的な蛍光色素である。これは、従来の方法よりも効率的かつ安価にアミロイドベータタンパク質プラークをラベル付けし、画像化するために使用することができます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞外および細胞内空間におけるアミロイドβタンパク質(Aβ)の沈着は、アルツハイマー病(AD)の顕著な病理の一つである。したがって、AD脳組織におけるAβの存在の検出は、ADの進行を防止するための新しい治療法を開発するための貴重なツールである。いくつかの古典的なアミロイド結合色素、フルオロクロム、イメージングプローブ、およびAβ特異的抗体がAD脳組織においてAβ組織化学的に検出するために使用されている。Aβ検出のためのこれらの化合物の使用は、コストと時間がかかります。しかし、その強烈な蛍光活性、高親和性、およびAβの特異性、ならびに従来のアミロイド結合色素との構造的類似性のために、クルクミン(Cur)は死後のAβプラークの標識およびイメージングのための有望な候補である脳組織。ハーブクルクマロンガから天然ポリフェノールです。本研究では、Curは、5x家族性アルツハイマー病(5xFAD)の遺伝的マウスモデルと1分以内にヒトAD組織の両方からAβプラークを組織化学的に標識するために使用された。Curの標識能力は、チオフラビン-S(チオ-S)、コンゴレッド(CR)、フルオロジェイドC(FJC)、ならびにAβ特異的抗体(6E10およびA11)などの従来のアミロイド結合色素と比較した。Curは、これらの従来の染料と比較して、Aβプラークを標識および画像化する最も安価で迅速な方法であり、Aβ特異的抗体に匹敵することを観察しました。さらに、CurはオリゴマーやフィブリルなどのほとんどのAβ種と結合する。したがって、Curは、Aβプラークの最も費用対効果が高く、シンプルで迅速なフルオロクロム検出剤として使用することができる。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アルツハイマー病(AD)は、最も一般的な、年齢関連、進行性神経疾患の一つであり、世界的に死亡の主要な原因の一つである1、2。学習、記憶、認知障害は、神経精神障害と共に、AD3に現れる一般的な症状である。ADの病因は完全には解明されていないが、利用可能な遺伝的、生化学的、および実験的証拠は、Aβの段階的な沈着がAD4の決定的なバイオマーカーであることを示す。この誤った折り畳まれたタンパク質は、細胞内および細胞外空間に蓄積し、AD5の影響を受ける脳の皮質および海馬領域におけるシナプス損失、神経炎症の増加、および神経変性に関与すると考えられている。したがって、AD組織におけるAβの組織化学的検出は、ADの進行を防ぐために非毒性、抗アミロイド薬を開発する上で重要な第一歩である。

過去数十年の間に、いくつかの染料および抗体は、脳組織のAβプラークを標識および画像化するために多くの研究所で使用されてきましたが、これらの方法のいくつかは時間がかかり、使用される染料や抗体は高価であり、いくつかの付属品を必要とします化学 物質。したがって、AD脳におけるAβプラークの検出の安価な手段の開発は、歓迎される新しいツールであろう。多くの研究室は、Aβの標識およびイメージングのための有望な抗アミロイド天然ポリフェノールであるCur、ならびにAD6、7、8、9の治療薬を使用し始めました。その疎水性と好中性、古典的なアミロイド結合色素との構造的な類似性、強い蛍光活性、ならびにAβと結合する強い親和性は、AD組織10におけるAβプラークの標識およびイメージングのための理想的な蛍光色素を作る.CurはAβプラークおよびオリゴマーと結合し、その存在はまた、細胞内空間7、11、12、13においても検出される。さらに、Curの最小量(1−10nM)は、5x家族性アルツハイマー病(5xFAD)脳組織7においてAβプラークを標識できることが示されている。1nM濃度はAβプラークの計数に最適な蛍光強度を提供しないが、Curの10nM以上の濃度を有する。ランと同僚14は、ジフルオロボロン誘導体化Curの0.2 nMの低用量が、赤外線プローブとほぼ同様に生体内のAβ沈着物を検出できることを報告した。この用量が組織中のAβプラークを標識するのに十分であるかどうかはまだ明らかではない。これまでの研究のほとんどは、Curを使用してAβプラークを染色するために20−30分を使用していますが、最適な染色は、はるかに少ない時間を必要とするかもしれません。

本研究は、CURがAD脳組織のAβプラークにラベルを付け、他の従来のCurで染色した後の5xFADマウスからの脳組織におけるAβプラークの標識およびイメージングに対する感受性を比較するために必要な最小時間をテストすることを目的とした。チオフラビン-S(チオ-S)、コンゴ赤(CR)、フルオロジェイドC(FJC)などのAβ結合性染料。これらの古典的なアミロイド結合色素のAβ標識能力は、5xFADマウスおよび老化一致したヒトADおよび制御脳組織からのパラフィン埋め込みおよび凍結石コロナ脳切片における硬化染色と比較された。この知見は、CurがAβ特異的抗体(6E10)と同様の方法でAβプラークを標識し、チオS、CR、またはFJCよりも適度に優れていることを示唆している。また、5xFADマウスに対する心腹腔内注射を2〜5日間投与した場合、血液脳関門を通過し、Aβプラーク7と結合した。興味深いことに、Curのナノモル濃度は、5xFAD脳組織7、14におけるAβプラークの標識および画像に使用されている。さらに、形態学的に異なるAβプラークは、コア、神経学的、拡散、および焼失したプラークを、他の従来のアミロイド結合色素7のいずれよりも効率的にCurによって標識することができる。全体的に、Curは、Aβ特異的抗体に対する信頼性の高い代替として、AD動物モデルおよび/またはヒトAD組織からの死後脳組織における標識および画像Aβプラークに容易かつ安価な方法で適用することができる。

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プロトコル

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ここで説明するすべての方法は、サギノーバレー州立大学の動物ケアと使用委員会(ACUC)によって承認されています.ヒト組織は、アリゾナ州のバナーサンヘルス研究所で確立された脳バンクから得られた15,16.

1. 動物の灌流

  1. 固定バッファーと灌流バッファーを準備します。
    1. 0.1 M 塩化ナトリウム(NaCl)、塩化カリウム2g(KCl)、21.7gのリン酸水素二ナトリウム(Na2HPO 4・7H2O)、2.59gのリン酸二水素カリウム(KH2PO44)を加えて調製)、及び二重蒸留水を合計1Lにする。
    2. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)を調製する。
      1. PBSの1L(0.1M、pH7.4)に40gのパラホルムアルデヒドを加えます。
      2. PFA溶液を60−65°Cに加熱し、磁気攪拌機を使用して混合します。
        注:温度は65°Cを超えるべきではありません。
      3. PFAを完全に溶解するためにスポイトでNaOH(1 N)の数滴を追加します。
      4. PFA溶液を中から微細な濾紙でろ過し、4°Cで保存します。
        注:解決策は1ヶ月間良いです。
  2. 動物性麻酔と灌流を行います。
    注:12ヶ月のB6SJL-Tg APP SwFlLon、PSEN1*M146L*L286V、1136799Vas/J(5×FAD)年齢一致対照マウス(グループあたりn =6)はベンダーから購入され、サギノーバレー州立大学の動物の家で飼育されました。ジェノタイピングは、先に説明したようにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により確認した。ヒトAD脳組織は、死後AD脳組織および年齢一致対照組織を含む。
    1. 腹腔内注射(27G針と1本)によるペントバルビタールナトリウム(体重390mg/kg)、ケタミン/キシラジン混合物(最大80mg/kg体重ケタミンおよび10mg/kg体重キシラジン)などの適切な麻酔薬で動物を麻酔するmLシリンジ)。つま先をつまんで麻酔のレベルを確認してください。動物が応答しない場合は、灌流手術の準備ができています。
    2. 麻酔をかけられた動物を灌流手術用トレイの上の上の上の上の上の位置に置き、小さい虹彩はさみを使用して、左心室の後部端に切開を行う。
    3. 22 Gの灌流針を左心室に挿入し、右耳介で小さな切開を行い、体外液から灌流液を除去する。重力供給灌流システムを使用して、氷冷灌流流体(0.1 M PBS、pH 7.4)を5~6分間流れるようにします(流量20−25 ml/分)。
      注:明確な肝臓は、最適な灌流の指標です。
    4. バッファーバルブを固定用の氷冷4%パラホルムアルデヒド溶液に切り替え、8~10分間流れるようにします。
      メモ:トレモルの後に硬化または硬い手足が良好な固定の指標です。
    5. はさみを使って頭蓋骨から脳を取り除く。へらを使用して、脳を収集し、4%PFA(脳容積の少なくとも10倍の体積)のバイアルに置き、さらに使用するまで4°Cで保存します。

2. 組織処理

  1. クライオスタットセクションをカットします。
    1. グレードのスクロース溶液(10%、20%、30%)に脳を転送使用するまで、それぞれ24時間4°Cで保管してください。
    2. -22°Cでクライオスタットを使用し、厚さ40μmの切片をカットします。PBSとアジ化ナトリウム(0.02%)で満たされた6ウェルプレートでウェルあたり10−20セクションを収集します。
  2. パラフィンは、マウスとヒトの脳組織のセクションを埋め込みます。
    1. パラフィン切片の場合、等級アルコールで浸透した24時間後の脳組織(50%、70%、90%)を脱水するそれぞれ2時間、次いで100%アルコール2xをそれぞれ1時間)、次いで室温でキシレン2xをそれぞれ1時間ずつ使用した。
    2. アルミニウム箔で覆われたガラスコニカルフラスコで、キシレンパラフィン(1:1)2xで組織を56°Cで1時間浸透させます。
    3. 溶かしたパラフィン(56°C)に4−6時間浸漬する。
    4. 室温でロータリーミクロトームを使用して厚さ5μmの切片をカットし、45°Cのティッシュウォーターバスに入れます。
  3. ヒスト化学的にキュリオスタットセクションのAβプラークにCurでラベルを付けます。
    1. ステップ 2.1.2 のセクションを PBS (pH 7.4) 3x でそれぞれ 5 分間すすいでください。
    2. 溶液を70%エタノールに浸し、室温で2分間浸漬する。
    3. ストックキュア(1mM)をメタノールに溶解し、70%エタノールで希釈し、最終作業濃度10μMを得た。
    4. 150 rpmのシェーカーの室温で1-5分間、作業用Cur溶液でセクションを浸します。
    5. 硬化液を廃棄し、70%エタノール3xでそれぞれ2分間洗浄する。
    6. ポリL-リジンコーティングガラススライドのセクションを置き、ディスティン可塑剤キシレン(DPX)などの有機取り付け媒体を使用してカバースリップでマウントします。
    7. 480/550 nm励起/発光フィルターを使用して蛍光顕微鏡で表示します。
  4. ヒスト化学的にパラフィン埋め込みマウスとヒト脳切片のAβプラークにCurでラベルを付ける。
    1. ステップ2.2.4から組織切片を室温でそれぞれ5分間キシレン2xで脱パラフィン化する。
    2. 等級アルコール溶液(100%、80%、70%、50%それぞれ1分間)と蒸留水2xを室温でそれぞれ5分間で補温します。
    3. 暗闇の中で室温で10分間硬化(10μM)で切り分け、150rpmで振る。70%、90%、100%のアルコールをそれぞれ2分間洗浄します。
    4. それぞれ5分間キシレン2xでクリアし、DPXでスリップをカバーします。
    5. ステップ2.3.7で述べたように蛍光顕微鏡で可視化します。
  5. Aβプラークおよびオリゴマー中のAβ抗体を用いてCurをコローカライズする。
    1. 12ウェルプレートにPBS 3xでステップ2.1.2からクライオスタットセクションを洗浄します。
    2. 1時間室温で0.5%トリトンX-100でPBSに溶解した10%の正常ヤギ血清(NGS)で切片をブロックします。
    3. ブロッキング ソリューションを破棄します。Aβ特異的抗体(6E10またはA11、希釈1:200)で切片をインキュベートし、10%NGSおよび0.5%Triton-X100を含む新鮮なブロッキング溶液に溶解し、150rpmでシェーカーで4°Cで一晩。
    4. 抗体溶液を廃棄し、各10分間PBS 3xで切片を洗浄します。
    5. 赤色蛍光体(例えば、Alexa 594)を有する二次抗体タグを有する二次抗体タグを有するインキュベートを、暗闇の中の室温で1時間行う。
    6. それぞれ10分間PBS 3xで洗浄します。
    7. 70%アルコール1xで洗浄します。
    8. 室温で5分間、Cur(10μM)でセクションをインキュベートします。
    9. 70%アルコール3xでそれぞれ1分間洗浄する。
    10. それぞれ1分間90%と100%のアルコールで脱水し、それぞれ5分間キシレン2xでクリアし、DPXを使用してスライドにマウントします。
    11. 赤と緑の信号に適した励起/発光フィルタを使用して蛍光顕微鏡を使用して視覚化します。
    12. 細胞内Aβ共振の場合、Aβ抗体(6E10)を用いて切片を染色し、暗闇の室温で150rpmで振りながらCurで再染色し、Hoechst-33342(1mg/ml)および/またはDAPI(1ug/ml)のいずれかで室温で10分間のカウンターステイン150のrpmで揺れながら暗闇。PBS 3xで洗浄します。
    13. 赤、緑、青のフィルターを 100 倍の目標 (合計倍率 1,000x) で画像を撮影します。
  6. チオS、CR、およびFJCでAβプラークにラベルを付けます。
    注:Thio-SおよびCRラベリングの詳細なプロトコルは、以前に7を報告しました。
    1. FJC染色の場合は、ステップ2.1.2から得られたフリーフローティングセクションをPBS 3xでそれぞれ5分間洗浄します。
    2. セクションを12ウェルプレートに入れ、FJCで染色します(0.001%)室温で暗闇の中で10分間。
    3. FJC溶液を廃棄し、それぞれ5分間PBS 3xで洗浄します。
    4. 塩化アンモニウム(NH4Cl、PBSに溶解50mM)で室温で10分間インキュベートする。
    5. NH4Cl溶液を捨て、それぞれ5分間PBS 3xで洗浄します。
    6. セクション2.4のステップに従って、450/520 nm励起/発光フィルタを使用して、等級アルコール溶液で脱水、クリア、マウント、および蛍光顕微鏡下で表示します。

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結果

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クルクミンは1分以内にAβプラークをラベル付けします。5xFAD組織をCurで染色したところ、1分以内にCur標識Aβプラークが見つかった。Curによるインキュベーション時間の増加はAβプラークの蛍光強度をわずかに増加させるが、観察されたAβプラークの数は1分と5分の染色時間の間で有意に異なっていなかった(図1)。

Curは、マウスAD脳組織におけるAβ特異的抗体と共在化するクライオスタット調製マウスおよびパラフィン埋め込みマウスおよびヒトAD組織においてAβプラークを標識することができる。凍結切片、パラフィン埋め込み切片(図2A)およびヒトAD組織(図2B)を染色した場合、全てのタイプの組織切片でCur標識Aβプラークを観察した。

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちの仮説は、Curが他の古典的なアミロイド結合色素と比較して、死後AD脳組織におけるAβプラークを標識し、画像化する最も速く、最も簡単で、最も安価な方法として使用することができ、Aβ特異的抗体と比較して行うことができた。本研究の目的は、死後AD脳組織におけるCurによるAβプラークの標識および画像化に要する最小時間を決定し、CurがAβプラークを標識するためのAβ抗体の代替として使用できるかどうかを決定することであった。この点に対して、CurのAβ標識能力は異なる時点で観察された。Curは1分以内にAβに標識することができた。また、CurによるAβの標識は、チオ-S(0.1%)、CR(1%)、およびFJC(0.001%)などの他の従来のアミロイド結合色素よりも大きかった。

Curは、Aβ標識のためのユニークで理想的な蛍光色素と考えられており、構造的、物理的、化学的、および生物学的特性10を含む従来のアミロイド結合色素のほとんどが有する特性を有するのでである。さらに、手頃な価格のために、ほとんどの研究者は、この天然ポリフェノールを使...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究のサポートは、セントメアリーズの昇天のフィールド神経科学研究所から来ました.

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)IHCワールド、ウッドストック、MD
アルツハイマー病の動物モデルジャクソン研究所、バーハーバー、ME
絶対アルコールVWR、ラドナー、ペンシルバニア
Alexa 594Santacruz Biotech、ダラス、テキサス州
抗体 6E10Biolegend、カリフォルニア州サンディエゴ
抗体 A11ミリポア、マサチューセッツ州
複合光学顕微鏡オリンパス、新宿、日本オリンパス BX51
コンゴレッドシグマ、セントルイス、ミズーリ
クライオスタットGMI、ラムゼイ、ミネソタ州LeicaCM1800
クルクミンシグマ、セントルイス、ミズーリ
水素二ナトリウムリン酸塩シグマ、セントルイス、ミズー
リ州 ジスチレン可塑剤キシレンBDH、ジョージア州
フィルターペーパーフィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルバニア
Hoechst-33342シグマ、セントルイス、ミズーリ
倒立蛍光顕微鏡ライカ、バッファローグローブ、イリノイライカ DMI 6000B
倒立蛍光顕微鏡オリンパス、新宿、日本オリンパス 1x70
正常なヤギ血清シグマ、セントルイス、ミズーリ
パラフィンシグマ、セントルイス、ミズーリ
パラホルムアルデヒドシグマ、セントルイス、ミズーリ
プロロイリジンコーティング荷電ガラススライドグローブサイエンティフィック社、マーワー、ニュージャージー
州塩化カリウムシグマ、セントルイス、ミズーリ
二水素カリウムシグマ、セントルイス、ミズーリ
アジ化ナトリウムシグマ、セントルイス、ミズーリ
ナトリウムシグマ、セントルイス、ミズーリ
酸化ナトリウムEMDミリポア、バーリントン、マサチューセッツ州
トバルビタールナトリウムボルテックスファーマシューティカルズリミテッド、ディアボーン、ミシガン州
チオフラビン-SSigma、セントルイス、ミズーリ
Triton-X-100Sigma、セントルイス、ミズーリ
キシレンVWR、ペンシルバニア
州 バーリントン州 州 ドーソンビル州 州 州 州 州 州 州リン酸州州塩化州水ペン州 州州ラドナー

参考文献

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