方法論記事

天然ポリフェノールクルクミンを用いた脳組織におけるアミロイドプラークの標識とイメージング

DOI：

10.3791/60377

⸱

2019年11月1日

 ,  ,  ,  , 
1Field Neurosciences Institute, Ascension St. Mary's Hospital, 2Field Neurosciences Institute Laboratory for Restorative Neurology, Central Michigan University, 3Program in Neuroscience, Central Michigan University, 4Department of Psychology, Central Michigan University, 5Department of Health Sciences, Saginaw Valley State University

この記事について

サマリー

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クルクミンは、アミロイドベータタンパク質への優先結合、ならびに他の伝統的なアミロイド結合色素との構造的類似性に起因する脳組織におけるアミロイドベータタンパク質プラークの標識およびイメージングのための理想的な蛍光色素である。これは、従来の方法よりも効率的かつ安価にアミロイドベータタンパク質プラークをラベル付けし、画像化するために使用することができます。

要約

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細胞外および細胞内空間におけるアミロイドβタンパク質(Aβ)の沈着は、アルツハイマー病(AD)の顕著な病理の一つである。したがって、AD脳組織におけるAβの存在の検出は、ADの進行を防止するための新しい治療法を開発するための貴重なツールである。いくつかの古典的なアミロイド結合色素、フルオロクロム、イメージングプローブ、およびAβ特異的抗体がAD脳組織においてAβ組織化学的に検出するために使用されている。Aβ検出のためのこれらの化合物の使用は、コストと時間がかかります。しかし、その強烈な蛍光活性、高親和性、およびAβの特異性、ならびに従来のアミロイド結合色素との構造的類似性のために、クルクミン(Cur)は死後のAβプラークの標識およびイメージングのための有望な候補である脳組織。ハーブクルクマロンガから天然ポリフェノールです。本研究では、Curは、5x家族性アルツハイマー病(5xFAD)の遺伝的マウスモデルと1分以内にヒトAD組織の両方からAβプラークを組織化学的に標識するために使用された。Curの標識能力は、チオフラビン-S(チオ-S)、コンゴレッド(CR)、フルオロジェイドC(FJC)、ならびにAβ特異的抗体(6E10およびA11)などの従来のアミロイド結合色素と比較した。Curは、これらの従来の染料と比較して、Aβプラークを標識および画像化する最も安価で迅速な方法であり、Aβ特異的抗体に匹敵することを観察しました。さらに、CurはオリゴマーやフィブリルなどのほとんどのAβ種と結合する。したがって、Curは、Aβプラークの最も費用対効果が高く、シンプルで迅速なフルオロクロム検出剤として使用することができる。

概要

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アルツハイマー病(AD)は、最も一般的な、年齢関連、進行性神経疾患の一つであり、世界的に死亡の主要な原因の一つである1、2。学習、記憶、認知障害は、神経精神障害と共に、AD3に現れる一般的な症状である。ADの病因は完全には解明されていないが、利用可能な遺伝的、生化学的、および実験的証拠は、Aβの段階的な沈着がAD4の決定的なバイオマーカーであることを示す。この誤った折り畳まれたタンパク質は、細胞内および細胞外空間に蓄積し、AD5の影響を受ける脳の皮質および海馬領域におけるシナプス損失、神経炎症の増加、および神経変性に関与すると考えられている。したがって、AD組織におけるAβの組織化学的検出は、ADの進行を防ぐために非毒性、抗アミロイド薬を開発する上で重要な第一歩である。

過去数十年の間に、いくつかの染料および抗体は、脳組織のAβプラークを標識および画像化するために多くの研究所で使用されてきましたが、これらの方法のいくつかは時間がかかり、使用される染料や抗体は高価であり、いくつかの付属品を必要とします化学 物質。したがって、AD脳におけるAβプラークの検出の安価な手段の開発は、歓迎される新しいツールであろう。多くの研究室....

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プロトコル

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ここで説明するすべての方法は、サギノーバレー州立大学の動物ケアと使用委員会(ACUC)によって承認されています.ヒト組織は、アリゾナ州のバナーサンヘルス研究所で確立された脳バンクから得られた15,16.

1. 動物の灌流

  1. 固定バッファーと灌流バッファーを準備します。
    1. 0.1 M 塩化ナトリウム(NaCl)、塩化カリウム2g(KCl)、21.7gのリン酸水素二ナトリウム(Na2HPO 4・7H2O)、2.59gのリン酸二水素カリウム(KH2PO44)を加えて調製)、及び二重蒸留水を合計1Lにする。
    2. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)を調製する。
      1. PBSの1L(0.1M、pH7.4)に40gのパラホルムアルデヒドを加えます。
      2. PFA溶液を60−65°Cに加熱し、磁気攪拌機を使用して混合します。
        注:温度は65°Cを超えるべきではありません。
      3. PFAを完全に溶解するためにスポイトでNaOH(1 N)の数滴を追加します。
      4. PFA溶液を中から微細な濾紙でろ過し、4°Cで保存します。
        注:解決策は1ヶ月間良い....

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結果

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クルクミンは1分以内にAβプラークをラベル付けします。5xFAD組織をCurで染色したところ、1分以内にCur標識Aβプラークが見つかった。Curによるインキュベーション時間の増加はAβプラークの蛍光強度をわずかに増加させるが、観察されたAβプラークの数は1分と5分の染色時間の間で有意に異なっていなかった(図1)。

Curは、マウスAD脳組織におけるAβ特異的抗体と共在化するクライオスタット調製マウスおよびパラフィン埋め込みマウスおよびヒトAD組織においてAβプラークを標識することができる。凍結切片、パラフィン埋め込み切片(図2A)およびヒトAD組織(図2B)を染色した場合、全てのタイプの組織切片でCur標識Aβプラークを観察した。

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ディスカッション

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私たちの仮説は、Curが他の古典的なアミロイド結合色素と比較して、死後AD脳組織におけるAβプラークを標識し、画像化する最も速く、最も簡単で、最も安価な方法として使用することができ、Aβ特異的抗体と比較して行うことができた。本研究の目的は、死後AD脳組織におけるCurによるAβプラークの標識および画像化に要する最小時間を決定し、CurがAβプラークを標識するためのAβ抗体の代替として使用できるかどうかを決定することであった。この点に対して、CurのAβ標識能力は異なる時点で観察された。Curは1分以内にAβに標識することができた。また、CurによるAβの標識は、チオ-S(0.1%)、CR(1%)、およびFJC(0.001%)などの他の従来のアミロイド結合色素よりも大きかった。

Curは、Aβ標識のためのユニークで理想的な蛍光色素と考えられており、構造的、物理的、化学的、および生物学的特性10を含む従来のアミロイド結合色素のほとんどが有する特性を有するのでである。さらに、手頃な価格のために、ほとんどの研究者は、この天然ポリフェノールを使.......

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開示事項

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著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

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この研究のサポートは、セントメアリーズの昇天のフィールド神経科学研究所から来ました.

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)IHCワールド、ウッドストック、MD
アルツハイマー病の動物モデルジャクソン研究所、バーハーバー、ME
絶対アルコールVWR、ラドナー、ペンシルバニア
Alexa 594Santacruz Biotech、ダラス、テキサス州
抗体 6E10Biolegend、カリフォルニア州サンディエゴ
抗体 A11ミリポア、マサチューセッツ州
複合光学顕微鏡オリンパス、新宿、日本オリンパス BX51
コンゴレッドシグマ、セントルイス、ミズーリ
クライオスタットGMI、ラムゼイ、ミネソタ州LeicaCM1800
クルクミンシグマ、セントルイス、ミズーリ
水素二ナトリウムリン酸塩シグマ、セントルイス、ミズー
リ州 ジスチレン可塑剤キシレンBDH、ジョージア州
フィルターペーパーフィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルバニア
Hoechst-33342シグマ、セントルイス、ミズーリ
倒立蛍光顕微鏡ライカ、バッファローグローブ、イリノイライカ DMI 6000B
倒立蛍光顕微鏡オリンパス、新宿、日本オリンパス 1x70
正常なヤギ血清シグマ、セントルイス、ミズーリ
パラフィンシグマ、セントルイス、ミズーリ
パラホルムアルデヒドシグマ、セントルイス、ミズーリ
プロロイリジンコーティング荷電ガラススライドグローブサイエンティフィック社、マーワー、ニュージャージー
州塩化カリウムシグマ、セントルイス、ミズーリ
二水素カリウムシグマ、セントルイス、ミズーリ
アジ化ナトリウムシグマ、セントルイス、ミズーリ
ナトリウムシグマ、セントルイス、ミズーリ
酸化ナトリウムEMDミリポア、バーリントン、マサチューセッツ州
トバルビタールナトリウムボルテックスファーマシューティカルズリミテッド、ディアボーン、ミシガン州
チオフラビン-SSigma、セントルイス、ミズーリ
Triton-X-100Sigma、セントルイス、ミズーリ
キシレンVWR、ペンシルバニア
州 バーリントン州 州 ドーソンビル州 州 州 州 州 州 州リン酸州州塩化州水ペン州 州州ラドナー

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cummings, J. L. Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).
  2. Jack, C. R., Holtzman, D. M. Biomarker modeling of Alzheimer's disease. Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).
  3. Tarawneh, R., Holtzman, D. M.

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