フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

Summary

チップベースの超分解能光学顕微鏡は、蛍光顕微鏡検査の新しいアプローチであり、費用対効果とスループットの利点を提供します。ここでは、チップ調製およびイメージングのためのプロトコルをTIRF顕微鏡および局在化ベースの超解像顕微鏡用に示す。

Abstract

総内部反射蛍光(TIRF)は、光学的断面によるコントラストを高めるため、単一分子局在化ベースの超解像顕微鏡で一般的に使用されます。従来のアプローチは、励起と収集の両方に高い開口顕微鏡TIRF目標を使用し、視野とスループットを厳しく制限することです。チップベースのナノスコピーと呼ばれる光導波路を用いたイメージング用TIRF励起を生成する新しいアプローチを提示する。このプロトコルの目的は、既に構築されたセットアップでチップベースのイメージングを実行する方法を示することです。チップベースのナノスコピーの主な利点は、励起経路と収集経路が分離されることです。イメージングは、低倍率レンズで行うことができ、解像度のわずかな低下の価格で、TIRF画像の広い視野を生み出します。肝静脈内皮細胞(LsEC)を直接確率光学的再構成顕微鏡(dSTORM)を用いて画像化し、従来の超解像顕微鏡に匹敵する分解能を示した。また、低倍率レンズで500μm×500μm領域を撮像し、76nmの分解能を発揮し、ハイスループット機能を発揮します。そのコンパクトなキャラクターを通じて、チップベースのイメージングは、最も一般的な顕微鏡に改造することができ、オンチップセンシング、分光法、光学トラッピングなどの他のオンチップ光学技術と組み合わせることができます。そのため、この技術は、高スループットの2D超解像度イメージングに最適ですが、マルチモーダル解析にも最適です。

Introduction

単一分子局在化顕微鏡の最初の実証以来、多くのバリエーションが開発され、異なる課題^{を解決するために1、2、3.}しかし、残っている課題の1つは、dSTORMイメージングの大きな視野です。多くのdSTORM セットアップでは、同じ対物レンズを使用してサンプルを励起し、画像化します。視野を広げるためには、低倍率レンズが必要です。低倍率と低い開口(NA)対数レンズは、通常、被写界深度が大きいため、局在化精度を低下させる面外信号が増加します。TIRFの目的は、一般的に面外蛍光を減少させることによって画像コントラストを高めるために使用されます。TIRFを介して、励起は、エバネッセント^場4によって表面から約150nmの光学厚さに制限される。TIRF対等レンズは、小さな視野(FOV)(例えば50 x 50μm²⁾をもたらす大きなNAを必要とし、スループットを大幅に制限します。ただし、エバネッセント フィールドを生成する別の方法があります。

光導波路は、光が構造に結合されている場合に光を閉じ込め、導く構造です。最も一般的には、導波路はファイバーベースの通信に使用されます。フォトニック集積回路の主成分として2D集積導波路を開発するために、多大な努力がなされている。この技術は、低損失ナノ構造の光導波路を作製できるところまで進^んだ5.今日、世界中のいくつかのファウンドリは、フォトニック集積回路の開発に使用することができます。導波管は、表面にエバネッセントフィールドを示す総内部反射率を通して光を導きます。導波管構造の慎重な設計によって、エバネッセント分野で高強度を達成することができる。導波管表面の上に直接置かれたサンプルは、イメージングアプリケーションのためのエバネッセントフィールドによって照らすこともできます。エバネッセントフィールドは、導波路の全長と幅に沿って生成されるため、任意に大^きな6にすることができます。

我々は、任意の大きな視野を提供するTIRF dSTORMに新しいアプローチを提示します。励起と収集の両方にTIRFレンズを使用する代わりに、光導波路のエバネッセント場を使用して励起します。これにより、励起光経路と集捉光経路が分離され、導波路チップ照明によって提供される所定の波長の光学的断面を損なうことなく、収集光経路に沿った全自由を可能にします。したがって、低倍率レンズを使用してTIRFモードで非常に大きな領域をイメージできますが、NAを小さくすると横方の解像度が低下します。さらに、多色イメージングは、システムをリジャストすることなく、いくつかの波長を導き、検出することができるので、導波^路7を使用して大幅に簡素化される。これは、低波長が蛍光色素の点滅や多色イメージングを強化するために使用できるため、dSTORMに有利です。エバネッセント場の浸透深さは波長の関数として変化しますが、撮像手順の実行方法には影響しません。このチップはライブセル^{イメージング8}と互換性があり、マイクロ流体の統合などのアプリケーションに最適です。各チップには、異なる条件下で画像を画像化したり、光学ト^{ラッピング9}とラマン分光^法10を適用することができます。

チップベースのシステムは、回折制限イメージングと超分解能イメージングの両方で同様に機能します。同様のアプローチは、エバネッセンス場励^起4を生成するためにプリズムを使用して2005年に導入されました.フォトニックチップはまた、エバネッセントフィールドを通して興奮しますが、現代の導波管製造技術を使用すると、導波路でエキゾチックな光パターンを生成することができます。本チップベースのナノスコピーの実装は、励起場が導波管表面内にロックされているため、2Dイメージングのみに限定される。今後の開発は3Dアプリケーションを目指す。また、構造化照明顕微鏡などの他の超解像技術は、同じチップベース^顕微鏡11を用いて開発されている。

Protocol

1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)層の調製

1. シルガード184モノマーと硬化剤の10:1ミックスを準備します。
2. 気泡がなくなるまで真空チャンバーに入れます。
3. 3.5インチ(直径)ペトリ皿の中央に1.7gのPDMS混合物を注ぎます。
4. スピンコーターの真空チャックにペトリ皿を置きます。
5. 900 rpmで20sのペトリ皿をスピンコートし、75 rpm/sの加速を加えます。
6. 50°Cのホットプレートで少なくとも2時間は硬化させます。

2. サンプル調製

1. 導波路洗浄
   1. 脱イオン水中に洗浄洗剤濃縮物(材料表)を1%希釈して100mL調製する。
   2. ウエハツイーザーを使用してガラスペトリ皿にチップを入れ、洗剤溶液で完全に覆います。
   3. ペトリ皿を70°Cのホットプレートに10分間置きます。
   4. ホットプレートの上に残したまま、清潔なティッシュ綿棒で表面をこすります。
   5. ペトリ皿からチップを取り出します。少なくとも100mLのDI水ですすします。
   6. イソプロパノールの少なくとも100 mLでリンス、蒸発汚れを防ぐために表面に溶媒が乾燥しないことを注意してください。
   7. 少なくとも100mLのDI水ですすします。窒素ガンでチップを乾かします。
2. チャンバー準備
   1. ペトリ皿に150μmポリジメチルシロキサン(PDMS)の層を調製する(セクション1)。
   2. メスを使用して、PDMS レイヤーから 1.5 cm x 1.5 cm フレームをカットします。
   3. シュイーザーでペトリ皿からフレームを持ち上げます。清潔で磨かれたチップに平らに入れ。これで、サンプルでセルシードの準備ができました。
3. 蛍光標識
   1. リン酸緩衝生理食塩水、染料溶液、dSTORMイメージングバッファーの化学物質を調製します。
   2. 細胞のシード処理後、メディアからチップを取り出します。
   3. PDMSチャンバーの外側から余分な液体を除去するには、ピペットを使用します。
   4. 約60°LのクリーンPBSを同時に追加しながら、ピペットでPDMSチャンバー内から電流流体を取り出します。
      注:チャンバーに追加された量は、チャンバーのサイズに応じて変更する必要があります。セル表面からすべてのメディアを取り外さないように注意してください。
   5. PBSを60°LのクリーンPBSに交換し、1分間インキュベートします。
   6. 前の手順を繰り返し、今度は 5 分間インキュベートします。
   7. PBSを取り外し、60μLの染料溶液に交換します。サンプルを約15分間インキュベートし、光から遮蔽します。
      注: この手順は、使用する蛍光色素に応じて大幅に変更する必要があります。私たちは、この実験のための細胞膜にラベルを付けるためにセルマスクディープレッドを使用しています
   8. 手順2.3.3-2.3.5のようにPBSでサンプルを洗浄します。
   9. PBSを取り外し、同時に40μLのイメージングバッファに交換します。
      メモ:異なる蛍光色素に対していくつかの異なるイメージングバッファーがあります。
   10. カバースリップを上に置き、気泡が下に形成されるのを防ぎます。カバースリップを画像室に軽く押して、余分なメディアを取り除きます。
   11. ピペットを使用して、カバースリップの外側にある余分なメディアを取り除きます。乾燥した浸漬媒体残渣によって形成される結晶を避けるために、カバースリップの外側の領域を水湿った綿棒で清掃します。

3. イメージング手順

1. コンポーネントの設定
   メモ:このバージョンのセットアップは、顕微鏡、カップリングステージ、サンプルステージの3つの主要コンポーネントで構成されています。「材料表」を参照してください。
   1. フィルターホルダー、白色光源、カメラ、および客観的なリボルバーを備えた顕微鏡を使用してください。
   2. 3軸ピエゾカップリングステージには、ファイバー結合レーザーとカップリングレンズを使用してください。
   3. 先端と傾きと真空ホルダーを備えた1軸手動サンプルステージを使用してください。
   4. カップリングとサンプルステージの両方を2軸電動ステージに取り付けて、サンプル翻訳を行います。
2. 導波路カップリング
   1. カップリングファセットを使用して真空チャックにチップを配置します。チップがカップリング目的から約1焦点距離離れていることを確認します。
   2. 真空ポンプの電源を入れます。
   3. レーザーの電源を1mWにします。ビームがエッジに当たるようにチップの高さを大まかに調整します。レーザーの電源を切ります。
   4. 白い光源をオンにします。低倍率の対数レンズ(例:10x)を選択します。顕微鏡を導波路に合わせます。
   5. 導波路に沿って顕微鏡を移動し、光路と十分に整列しているかどうかを確認します。顕微鏡をカップリングエッジに移動します。
   6. レーザーの電源を1mW以下で切り入れます。レーザー光を見つけるためにカップリングエッジに沿って顕微鏡を移動します。ビームをチップエッジに焦点を合かします。
   7. 光路に沿って結合ステージを調整し、レーザー光スポットサイズが消えるまで小さくします。ビームがチップ表面の上または下にあるようになりました。
   8. ビームスポットが再び表示され、最大化されるまで、カップリングステージの高さを調整します。
   9. レーザーが焦点を合わせる場所になるまで、前の 2 つの手順を繰り返します。
   10. 焦点を合った場所を目的の導波管に移動します。
   11. 焦点を合わせられたビームスポットが見えなくなるように、顕微鏡をエッジから少し離れた場所に移動します。白いライトを消しなさい。
   12. コントラストを調整します。導波路が導いている場合は、導波路に沿った散乱光がはっきりと見えるはずです。
   13. カップリングステージの軸を調整して、散乱光強度を最大化します。レーザーの電源を切ります。
   14. 白いライトを点灯します。必要に応じてコントラストを調整します。
   15. イメージング領域に移動します。
3. 回折限定イメージング
   1. 目的のイメージング目標に焦点を合わせる。白いライトを消しなさい。
   2. 蛍光フィルターを挿入し、レーザーパワーを1mWに回します。
   3. カメラの露出時間を約 100 ミリ秒に設定します。カップリングがまだ最適化されていることを確認します。
   4. イメージング対象の領域を見つけます。ピエゾステージループをオンにして、平均アウトモードを行います。
      注:50 nmのステップサイズの20μmスキャン範囲は、ほとんどの導波路構造に適しています。
   5. 少なくとも300枚の画像をキャプチャします。
   6. 仮想スタックを使用して、キャプチャしたイメージ スタックを Fiji に読み込みます。フィジーのイメージメニューから[スタック]と[z-project]を選択します。
   7. 投影タイプの平均強度を選択して TIRF 画像を計算します。
4. dストームイメージング
   1. レーザーの電源を 1 mW にし、カメラの露出時間を 30 ミリ秒に設定します。
   2. コントラストとフォーカスを調整します。
   3. 点滅が見つかるまでレーザーパワーを上げます。
      注: エバネッセント フィールドの強度によっては、しばらく時間がかかる場合があります。
   4. サンプルの小さな領域を拡大します。
   5. コントラストを調整します。
   6. いくつかの画像をキャプチャして、点滅が適切に分離されているかどうかを確認します。
   7. 最適な点滅のためにカメラの露出時間を調整します。
      注:点滅の最適化は複雑な作業ですが、適切な文献の多^くは12を利用できます。
   8. ピエゾステージループをオンにします。
   9. 点滅密度に応じて、少なくとも 30,000 フレームのイメージ スタックを記録します。
5. dSTORM画像再構成
   1. フィジーを開き、仮想イメージとして d STORM スタックをロードします。
   2. 必要に応じてコントラストを調整します。
   3. 長方形ツールを使用して、再構築する領域を選択します。
   4. フィジーの^雷雨13プラグインで実行分析を開きます。
   5. デバイスに対応する雷雨で基本的なカメラ設定を設定します。残りの既定のパラメーターは、通常は満足です。
   6. 再構築を開始します。
      注: ビューの完全なフィールドでは、ファイル サイズが大きいため、データをサブスタックに分割する必要がある場合があります。
   7. 再構築ソフトウェアによって提供されるローカリゼーションリストをフィルタリングして、特定のローカリゼーションを削除します。アップルは、必要に応じて追加のドリフト補正。

Results

TIRF顕微鏡は、面外蛍光を除去し、コントラストを高め、画質を向上させ、他の蛍光ベースの顕微鏡技術に比べて光毒性が低いため、一般的な技術です。従来の客観的なアプローチと比較して、チップベースの顕微鏡検査は、通常TIRFレンズを伴う限られたスループットなしでTIRF励起を提供します。示されているセットアップの概要については、図 1 Aを参照してください。マウスから抽出した肝正弦細胞(LSEC)の回折制限とdSTORM画像を提示する。マイクロチューブリンの標識付きLSICの大きな視野画像も提示され、高スループットイメージングの能力を実証します。オイルイマージョンTIRFレンズ(60xまたは100x倍率)を使用した従来のdSTORMセットアップは、通常、図2のチップベースの画像よりも100倍小さい50μm x 50μmの領域を画像化し、25x、0.8 NAの目的でイメージします。

この方法では、励起にマルチモードSi₃N₄導波路を使用します。利用されたチップは、シリコンチップの2μm酸化層上に堆積した150nm Si_3N4のストリップエッチングされた導導層からなる。チップの概略図は、図 1Bにあります。導波管の幅は200と1000 μmの間で変化することができます。伝播モード間の干渉を通じて、励起光は均一な強度分布を持たないが、むしろ空間的に変化するパターンを持つ。図 2A は、はっきりと見えるモード パターンを持つイメージを示しています。この干渉パターンは、導波路の端にあるレーザー光の位置に応して変化します。最終的な画像で均質な励起を達成するために、ピエゾステージを使用して結合されたファセットに沿って振動します。撮像手順の過程で、干渉パターンの十分な変動が存在し、それらが平均化され、画像の強度変動を除去する。イメージ スタックは、図 2Aのような複数のイメージで構成されますが、パターンは異なりますが、平均すると、図 2Bなどの均質な励起を持つイメージが生成されます。別のアプローチは、断熱テーパリングを使用して、モード平均化の必要性を排除する広いシングルモード導波^路8、14を達成することです。ただし、100 μm の導波路幅を実現するには、シングルモード条件を維持するために数ミリメートルのテーパ長が必要です。マルチモード導波路は、このテーパリングの必要性を回避し、構造の幅に制限を残さない。照明パターンを超えて、モードの非常に効果的な屈折率は、構造化照明^顕微鏡11および変動顕微鏡^法7に向けて前例のない可能性を可能にする。

イメージングの最初のステップは、回折限られた画像を収集することです。実験結果は約300枚の画像のスタックとなり、最終的な画像はスタックの平均を取ることによって作られます。図2では、60x、1.2 NA水浸漬目的を用いて、セルマスクディープレッドで標識されたLSICの回折制限およびdSTORMイメージングを提示する。図2Aは、不十分なモード平均化によって引き起こされる不均一な照明を示す。正常なモード平均が図2Bに表示されます。図 2Cは、同じ領域のdSTORM イメージで、図 2Dに示すマーク付き領域を示しています。肝静脈滑膜内皮細胞は、形質^膜15にナノサイズの細孔を有し、ここで見ることができる。フーリエリング相関分析は、46 nmの分解能を提供した。

図3は、500μm x 500μm領域のdSTORM画像を示し、この技術の高スループット能力を示す。図3A のズーム画像は、一般的なdSTORM 視野に対応し、図 3Bの回折限定イメージと共に示されます。分解能を推定するフーリエ環相関を行い、76nmの値を生み出した。

図1:イメージングシステムと導波路(A) 撮像システムの写真。サンプルはサンプル段階の真空チャックに置かれ、導波路のカップリングファセットはカップリング目的に向かう。繊維結合レーザーおよび結合目的は3Dピエゾ段階の上に置かれる。撮像レンズ付きレンズタレットは、上から画像をキャプチャし、カメラに中継します。(B)カップリングレンズとイメージングレンズを用いた導波路の概略図。カップリングレンズは、導波路に光を結合します。サンプル(オレンジビーズ)は密封されたPDMSの部屋の中で保たれる。導波路に沿ったエバネッセントフィールドはサンプルを励起し、イメージング目的は放出された蛍光を捕捉します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2: 回折制限付きおよびdSTORM イメージ(A)不十分なモード平均を有する肝静脈内皮細胞の画像は、明らかに目に見える励起パターンをもたらす。(B)(A)と同じ領域であるが、十分なモード平均化により、均質な励起をもたらす。(C)(B)におけるインセットの回折限定画像。(D) d同じ領域の STORM イメージ。(E)(D)の発症は、細胞の形質膜におけるフェネストレーションを明確に示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3: ラット LSIC のdSTORM イメージ(A)ラットLSECにおけるAlexa 647染色チューブリンの広い視野dSTORM画像。スケール バー = 50 μm(B) 回折制限 (左下) とdSTORM イメージ (右上) を比較する(A)から大きいマーク領域。(C) (A) から小さいマーク領域 。スケール バー = 1 μm。画像の解像度は 76 nm です。Helle et al. 2019⁶からの許可を得て適応.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

チップベースのイメージングは、従来のdSTORMイメージングと同様です。したがって、従来のdSTORM イメージングと同じアプローチを使用して画質を測定できます。ユーザーのための主な違いは、透明なガラススライドが不透明なSi-waferと交換されるということです。それらは非常に異なって見えますが、サンプル処理は実質的にガラススライドに似ています。チップは非常に丈夫で、ウエハーピンセットを使用して簡単に処理できます。撮像手順と画像再構成は、通常のdSTORM実験と同じです。機能的なチップベースの顕微鏡を設定するには、フォトニックチップを除いて特別なコンポーネントは必要ありません。セットアップの詳細については、前作^6、7を参照してください。この作品で使用されるチップは、標準フォトリソグラ^フィー8を使用して製造されています。

試料調製は、試料室の調製を包含する。PDMSフレームをチップに取り付ける場合、空気が入る可能性のある小さな折り目や裂け目を避けることは非常に重要です。PDMSが取り付けるときに折りたたまれた場合は、ツイーザーで慎重に取り外し、取り付け直してください。サンプルがPDMSチャンバー内で準備ができたら、カバーガラスを押し付け、領域を密閉する必要があります。カバーガラスを取り付ける際に形成される可能性のある気泡は避けることが重要です。気泡が形成された場合は、カバーガラスをゆっくりと取り外し、サンプルチャンバーにPBSを追加して、サンプルが覆われていることを確認します。カバースリップの準備と取り付けは、単にやり直すことができます。

このペーパーで提案されているプロトコルを使用して、導波路への光の結合を簡素化する。ただし、カップリングを制限できる一般的な課題がいくつかあります。まず、チップが適切に洗浄されておらず、残りのPBSが完全に取り除かれた場合、導波路に汚れや結晶化PBSが存在する可能性があります。これにより大きな損失が生じ、イメージング領域の電力が非常に少なくなる可能性があります。湿った綿棒を使用してカバーガラスの外側の領域をきれいにすることは、電力を大幅に向上させることができます。第二に、導波路のカップリングファセットが損傷した場合(例えば、不適切な取り扱いによって)、カップリング損失が大幅に増加する可能性があります。エッジの光学検査は、通常、任意の損傷を容易に明らかにします。チップのカップリングファセット全体は、光ファイバと同様に慎重に研磨でき、滑らかなカップリングファセットを提供し、結合電力を増加させます。

ライトが結合された後、イメージング手順は、従来のdSTORMセットアップと同じです。図 2Aに示すように、画像に不均一な励起がある場合は、モード平均が適切に機能しなかった可能性が高くなります。この 2 つの最も一般的な理由は、1) 平均スタックを作成するためにキャプチャされた画像が少なすぎること、2) 振動距離が短すぎるか、ステップ サイズが大きすぎるためです。収集する画像が少なすぎると励起パターンが除外され、平均が不均一になります。これは、平均スタック内の画像の数を増やすことで簡単に解決できます。発振距離が短すぎると、モードパターンが十分に得られるため、不均一なイメージが生じる可能性もあります。これは、発振距離を増やしたり、ステップサイズを小さくしたりすることで簡単に解決できます。この研究では、ピエゾステージを使用して入力レーザービームを20μm以上スキャンし、少なくとも300枚の画像を取得しました。もう1つのアプローチは、高速ガルボミラーを使用して、10-30 msのような単一の集録時間内に入力導波路ファセット全体の光をスキャンすることです。

チップベースのdSTORMは、前例のない大面積TIRF励起を提供し、高スループットイメージングに最適です。コンパクトなキャラクターは、チップを逆段セットアップや透明基板用に逆さまに配置できる商用システムへの改造を可能にします。チップは大量に製造され、多くのニーズに合わせて変更することができます。現在、主な制限は 2D に制限されていることです。エバネッセントフィールドは導波管表面から約200nm離れた場所でしか利用できないので、この領域内の蛍光路のみが励起されます。全体として、統合された光学の分野は、新しいイメージングの質問に取り組むだけでなく、既存のものに新しい可能性を提供することにより、近い将来にチップベースの顕微鏡検査のための多くの機会を提供しています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1軸サンプルステージ	Standa	7T173-20
2軸サンプルトランスレーションステージ	Mad City Labs		カスタムオーダー
3軸NanoMaxステージ	Thorlabs	MAX311D
BXFM 顕微鏡本体	オリンパス	OLY-LSM-037018
CellMask Deep Red, Life technologies	ThermoFisher	C10046
クリーンルームグレードの綿棒	MRC	テクノロジーMFS-758
結合	レーザーCobolt	メンコ
フィルターホルダー	自家製
Hellmanex III、Hellma Gmbh	Sigma-Aldrich	Z805939	洗浄洗剤濃縮物
イソプロパノール	Sigma-Aldrich	563935-1L
KL 1600 LED	オリンパス	OLY-LSM-E0433314
オリンパス カップリングレンズ	オリンパス	LMPLFLN 50x/0.5
オルカ フラッシュ 4.0 V2	浜松
PBS錠	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB	説明に従って混ぜる
SYLGARD 184 シリコーンエラストマー 1.1 kg キット	ダウ	1673921
チップチルトステージ	Thorlabs	APR001
真空	ホルダーThorlabsHWV001
ウェーハピンセットタイプ2W	寒天科学	AGT5051