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方法論記事

多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成

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DOI:

10.3791/60384

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2019年10月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Northwestern University, 2National Center for Genetic Engineering and Biotechnology (BIOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA)

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

上皮細胞と間質細胞からなるヒト原発性子宮内膜オルガノイドを生成し、天然子宮内膜組織の特性を保持するプロトコルが提示される。このプロトコルは、子宮組織獲得から子宮内膜オルガノイドの組織処理までの方法を記述する。

要約

ヒト子宮内膜は、体内で最もホルモン応答性の組織の一つであり、妊娠の確立に不可欠です。この組織はまた、病気になり、罹患率、さらには死を引き起こす可能性があります。ヒト子宮内膜生物学を研究するモデルシステムは、単一細胞型のインビトロ培養系に限定されている。また、子宮内膜の主要な細胞型の一つである上皮細胞は、培養中に生理的形質をうまく伝播したり保持したりしないため、子宮内膜生物学に対する理解は限られています。ヒト子宮内膜の上皮細胞と間質細胞の両方からなる子宮内膜オルガノイドを初めて生成しました。これらのオルガノイドは、外因性足場材料を必要とせず、上皮細胞がスフェロイド様構造を包含し、コラーゲンを産生し分泌する中心の間質細胞と偏光するように特異的に組織化する。エストロゲン, プロゲステロンおよびアンドロゲン受容体は、上皮および間質細胞で発現され、エストロゲンとテストステロンの生理学的レベルで治療は、オルガノイドの組織を促進します.この新しいモデルシステムは、以前は不可能だった方法で正常な子宮内膜生物学と疾患を研究するために使用することができます。

概要

ヒト子宮内膜は子宮腔を直線し、移植中に胚の最初の接触として機能する。子宮内膜は、ルミナルおよび腺上皮細胞、支持性間質線維芽細胞、内皮細胞および免疫細胞から構成される。一緒に, これらの細胞タイプは、性ステロイドホルモン1に最も応答性の組織の一つである子宮内膜組織を構成します。.各月経周期の間に起こる変化は顕著です。子宮内膜の適切な成長および改造は、胚移植が起こることを可能にするために必要とされる。エストロゲンおよびプロゲステロンに対する異常な応答は、妊娠の確立を可能にしない難治性子宮内膜をもたらし、子宮内膜新生物を含む疾患をもたらす可能性さえある。

子宮内膜で起こるホルモン応答および本質的な変化を研究するために、手術中または子宮内膜生検中に患者から取り除かれた子宮内膜組織からの細胞は、細胞培養において伝播されている。子宮内膜間質細胞は、好ましく増殖し、容易に伝播し、プロゲステロンによって誘導される分化のプロセスは、インビトロで要約することができる。その結果、この分化プロセスの間に多くのことが学び、デシデュアル化2、3と呼ばれる。しかし、子宮内膜の他の主要な細胞型は、発光および腺上皮細胞は、従来の単層と同様に成長せず、極性を失い、老化し、増殖性が限られている。その結果、ヒト子宮内膜における生物学およびその役割についてはあまり知られていない。多くの新生物が上皮細胞に由来するにつれて、過形成または癌細胞への形質転換に関連するメカニズムは完全に定義されたままである。さらに、研究は、ホルモン応答が子宮内膜4、5の上皮細胞と間質細胞との間の親密なパラクリン作用を伴うことを確立した。

近年、子宮内膜上皮細胞の3次元(3D)オルガノイド培養が、子宮内膜組織から形成されたオルガノイドの最初の報告である2つの独立した基6,7によって確立された。これらのオルガノイドは、タンパク質マトリックス(材料の表)内に埋め込まれた子宮内膜上皮細胞から構成され、子宮内膜子宮内膜の重要なホルモン応答性コンパートメント、間質線維芽細胞を含んでいなかった。マトリックスタンパク質はロットごとに異なり、組織内で必ずしも発生しないシグナル伝達経路を引き起こす可能性があるため、マトリックスタンパク質を子宮内膜の成分に置き換えるのが理想的です。本研究では、ヒト子宮内膜の上皮細胞および間質細胞の足場のないヒト子宮内膜オルガノイドを生成するプロトコルが提示されている。間質細胞の存在は、上皮細胞の支持を提供するだけでなく、子宮内膜ホルモン応答4、8、9のために重要であることが確立された必要なパラクリン作用を提供する.

新しい多細胞子宮内膜オルガノイドは、生成が簡単で、上皮細胞と間質細胞の両方を組み込む子宮内膜のモデルシステムを提供します。これらのオルガノイドは、ホルモンの不均衡や外因性侮辱による腫瘍形成などの疾患の長期的なホルモン変化および初期の事象を研究するために使用することができる。これらのオルガノイドの複雑さは、最終的には、本当に人間の組織生理学を模倣するために、おそらくミオメトリオ細胞を持つ内皮および免疫細胞を含む他の細胞タイプを含むように拡張することができる。

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プロトコル

子宮内膜サンプルは、ノースウェスタン大学プレンティス女性病院で良性子宮状態のための日常的な子宮摘出術を受けている閉経前の女性から採取された。書面による同意は、研究に含まれるすべての女性から得られた。

1. アガロース金型の調製

  1. 細胞の単離を開始する前に、鋳造し、メーカーの指示に従ってオルガノイドを収容するために1.5%アガロースマイクロ金型(材料のテーブル)を平衡化します。

2. 子宮内膜オルガノイドの生成

  1. 一次間質および上皮細胞の収穫
    1. 無菌技術を用いてバイオセーフティキャビネット内で、酵素溶液(2.5mg/mLコラゲナーゼI+0.1mg/mL DNase I 10mLのディスパーゼ[500単位])を37°Cで調製し、0.2μmシリンジフィルターを用いて溶液を15mLに無菌フィルターします。
    2. 無菌技術を用いたバイオセーフティキャビネットでは、子宮生検や軟体組織から子宮内膜をこすり落とし、フードの下の軟体組織をメスで非常に小さな部分にします。
      注:少なくとも20mm x 10 mm x 1 mmである子宮内膜組織は、十分な数のオルガノイドを生成するために必要とされる。
    3. 15 mL円錐管で酵素溶液にみじん切り組織を入れます。キャップを閉じ、汚染を防ぐためにワックスフィルム(材料のテーブル)でトップを包みます。
    4. 水浴またはインキュベーターにティッシュを入れて37 °Cで30分間、穏やかな揺れ(80−100 rpm)を入れます。
    5. 50 mL円錐管に20 μmセルストレーナーの上に100 μmセルストレーナーを積み重ねます。2つのストレーナーを通して溶液を濾過し、ハンクのバランス塩溶液(HBSS;)の10 mLで15 mL円錐管をすすいでください。材料の表)すべての細胞が集められていることを確認するためにストレーナーを通して洗浄を置きます。
      注:フロースルー液体には、間質細胞と赤血球(合計約20mL)が含まれています。上皮細胞は20 μmストレーナー上に集される。未消化組織の塊は100 μmのストレーナーの上に残る。未消化組織をバイオハザード廃棄物容器に捨てます。
    6. ステップ2.1.5から新しい50 mL円錐管に20 μmセルストレーナーを反転し、1%のペン/ストレップで補充されたオルガノイド培地(材料の表)の20 mLでストレーナーから上皮細胞を洗い流します。
    7. 5分間500 x gでステップ2.1.5および2.1.6から円錐形の管を遠心分離する。
    8. 採取した間質細胞を用いて、上清を除去し、赤血球リシスバッファーの10mLでペレットを再中断する。 37 °C で 10~15 分間インキュベートし、円錐管を 500 x gで 5 分間遠心分離し、上清を取り除き、オルガノイド媒体の 200-300 μL でペレットを再中断します (詳細については、ステップ 2.2.2 を参照)。
    9. 採取した上皮細胞を使用して、上清を取り出し、100 μLのオルガノイド培地で再中断する(詳細についてはステップ2.2.2を参照)。
  2. シードセル
    1. 24ウェルプレートのウェル(1金型1個)の井戸で1.5%のアガロース型を平衡化した後、アガロースカビの外側にオルガノイド培地を取り除き、組織培養プレートを傾けて、アガロース皿の細胞播種室からの培地も可能にする。慎重に取り外します。
    2. 顕微鏡下で上皮(ステップ2.1.9から)と間質(ステップ2.1.8から)細胞懸濁液を見ます。 上皮または間質細胞懸濁液に一度に100 μLのオルガノイド培地を追加し、懸濁液の密度がほぼ等しくなるようにします。
      注:上皮細胞は一緒に集まり、単一細胞懸濁液に上皮細胞を消化/トリプシン化することはお勧めできません。
    3. 間質細胞の1部を上皮細胞の3部を体積で組み合わせます。
    4. アガロース金型の細胞播種室への結合細胞懸濁液のピペット50μL(60,000細胞)。
    5. アガロース型が細胞で満たされたら、24ウェルプレートの井戸に400μLの新鮮なオルガノイド培地を慎重に加えます。
      注:培地はアガロース皿の表面のすぐ下に達し、細胞が金型から浮かび上がらない。2−3日後、細胞は沈着し、オルガノイドを形成し始める。
    6. オルガノイド培地を500μLで2日おきに変化します。
    7. 2-3日後, 上皮および間質細胞の組織を促進するために0.1 nMエストラジオール(E)および0.8 nMテストステロン(T)を補充されたものに培地を変更します。
      注:上皮細胞と間質細胞の組織はホルモンの有無にかかわらず起こりうるが、より多くのオルガノイドはホルモンの存在下で組織化される。

3. 実験用子宮内膜オルガノイドの採取

注:実験が行われた後、子宮内膜オルガノイドは組織学またはRNA分析のために処理することができる。次のステップは、オルガノイドを処理する方法を説明する。

  1. 組織
    1. リン酸緩衝生理食べ物(PBS)に1.5%アガロースを沸騰させることで溶解します。液体アガロースを約50°Cに冷却します。
    2. 解剖顕微鏡の下で、24ウェルプレートを傾け、慎重にアガロースカビの外側から媒体をピペット。オルガノイドを破壊しないように、アガロースカビの内部から慎重に媒体をピペット。
    3. 解剖顕微鏡の下で、慎重にアガロース皿のチャンバーに暖かい(50°C)1.5%アガロースのピペット70-75 μL。オルガノイドの邪魔にならないように注意してください。
    4. 4°Cで5分間冷まします。
    5. 24ウェルプレートの各ウェルに4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加え、オルガノイドを含む密封されたアガロースカビ全体を4°Cで一晩固定します。次いで、パラフィン埋め込み処理の準備ができるまで、4°Cで70%エタノールに保存します。
  2. RNA分離
    1. 解剖顕微鏡の下で、24ウェルプレートを傾け、慎重にアガロースカビのチャンバーから媒体をピペット。
    2. 新鮮なオルガノイド培地の1mLをアガロース型に直接ピペットし、オルガノイドをマイクロウェルから洗い流します。あまりにも多くの気泡を作成しないように注意してください。
    3. ステップ 3.2.2 から同じ媒体でピペッティングをもう一度繰り返します。
    4. オルガノイドを含むすべての培地を収集します。オルガノイドを収集し、RNA抽出に進むために最高速度で遠心分離機。

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結果

プロトコルの概略図を図 1 に示します。子宮組織は病理学者によって検査された後、手術から得られた。子宮内膜の内層を掻き取ることによってミオメリウムから分離し、子宮内膜組織をプロトコルで概説したように細胞に酵素的に消化した。上皮および間質細胞をアガロース型のマイクロウェルに添加した。培養7日後、オルガノイドをさらに7−14日間EおよびTで処理した。

組織学的処理のために、子宮内膜オルガノイドを含むアガロース型をアガロースで密封し、続いて一晩4%のPFAで固定した。これらの型は、標準的なパラフィン埋め込みのために処理され、組織学、免疫蛍光または免疫組織化学のために切り分けおよび染色された。ヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色(図2A)は、外側と中心の細胞を裏打ちする単層の球体を持つスフェロイド状構造を明らかにした。子宮内膜上皮(E-カドヘリン)および間質細胞(ビメンチン)に対する細胞特異的マーカーは、中心に間質細胞を有するオ...

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ディスカッション

外因性足場材料を用いずに子宮内膜の上皮細胞と間質細胞からなるヒト子宮内膜オルガノイドを生成した。原発性子宮内膜上皮細胞がオルガノイド6、7を形成できることが既に示されているが、これらの細胞はマウス肉腫細胞によって分泌されるタンパク質のゼラチン状マトリックスに埋め込まれた(材料の表を参照)。球状構造を形成する。また、子宮内膜間質細胞は存在しなかった。我々は、子宮内膜組織の必須支持成分である我々のシステムの間質細胞が、細胞型間で上皮細胞が付着しパラクリンシグナル伝達を行うための足場を提供したと推測する。間質細胞の周りの上皮細胞の組織は、生理学的手がかりを提供した2つの細胞タイプ間の活発な相互作用を示した。子宮内膜のホルモン応答は、上皮細胞と間質細胞4,8,9間のパラクリン相互作用に依存するとして、私たちの多...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

本研究は、NIEHS/NIH/NCATS UG3助成金(ES029073)とノースウェスタンファインバーグ医学部ブリッジ基金(JJK)が資金提供を受けました。パラフィン埋め込みのための固定オルガノイドを処理するためのノースウェスタン病理学コア施設を認めたい。ウッドラフ、バーデット、アーバネックのラボを含むUG3チーム全体に対して、洞察に満ちたディスカッションとコラボレーションを行いたいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガロースHS、分子生物学グレードデンビルサイエンティフィックCA3510-6
アガロース金型シグマ-アルドリッチZ764043(https://www.microtissues.com/)
塩化アンモニウム (NH<サブ>4Cl)アムレスコ0621
β-エストラジオールSigma-AldrichE2257
コラゲナーゼ、タイプ II、粉末サーモフィッシャーサイエンティフィ17101015
ディスパーゼコーニング354235
DNase ISigma-AldrichD4513
EDTAフィッシャーサイエンティフィックBP120-1
エオシン染色VWR95057-848
エストロゲン受容体(SP1)、ウサギモノクローナル抗体サーモフィッシャーサイエンティフィックRM-9101-S
DAPI付きフルオロシールド、組織学封入剤Sigma-AldrichF6057
ハンクス平衡塩溶液(HBSS)Corning21-022-CV1x カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドを含まない
ヘマトキシリン染色液サーモフィッシャーサイエンティフィック3530-32改変ハリス製剤、水銀フリー
ヘパリン溶液STEMCELL Technologies07980が MammoCult 培
ヒドロコルチゾンストック溶液STEMCELL Technologies07925が MammoCult 培地
に追加 オルガノイド培地 - MammocultSTEMCELL Technologies056202 & micro;L / mLヘパリンおよび5 µL/mL ヒドロコルチゾン
パラホルムアルデヒド、16% 溶液電子顕微鏡Sciences 15710
ペニシリン-ストレプトマイシンサーモフィッシャーサイエンティフィ15140122
リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4Sigma-AldrichP3813
プロゲステロン受容体、PgR 1294、非抱合型、培養上清Agilent TechnologiesM356801-2
タンパク質マトリックス - MatrigelBD Biosciences356231
精製マウス抗E-カドヘリン抗体BD Biociences610181Clone 36
組換え抗ビメンチン抗体 [EPR3776]Abcamab92547
RNA溶解および単離キットZymo ResearchR2060
重炭酸ナトリウム (NaHCO3)シグマ-アルドリッチS6014
テストステロンシグマ-アルドリッチ86500
トリクロームステインアブカムab150686
ワックスフィルム-パラフィルムVWR52858-000
ック 地に追加 ック

参考文献

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