本稿では、レシピエント動物の間肩甲膜白色脂肪パッドにドナーラット乳腺上皮細胞を移植する移植方法について説明する。この方法は、乳腺上皮発生に対する宿主および/またはドナーの影響を調べるために使用することができ、事前にクリアする必要がなくなり、この技術の有用性を拡張する。
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この記事について
サマリー
要約
早くも1970年代に、研究者は乳腺上皮細胞をラットの肩甲膜間白い脂肪パッドに移植しました。移植技術を用いた乳腺上皮移植は、思春期のげっ歯類宿主が提供するホルモン環境を利用する。これらの研究は、様々な生物学的操作が乳腺の発達に及ぼす影響を探求し、乳腺生物学の多くの側面を解剖するのに理想的である。一般的な、しかし制限的な特徴は、移植された上皮細胞が周囲の間質によって強く影響され、内因性上皮によって競争されるということです。ネイティブの乳腺組織を利用するには、移植前に宿主乳腺上皮を除去するために腹部の、うろたえの白い脂肪パッドをクリアする必要があります。ラットモデル生物を使用する際の大きな障害は、後産ラットで発達中の乳腺の木を取り除くのが効率的ではないということです。腺のない脂肪パッドに移植すると、ドナー上皮細胞は、クリアされた宿主脂肪パッドを再移植し、機能的な乳腺を形成することができる。間肩甲膜脂肪パッドは、これらの移植片のための代替位置です。主な利点は、それがまだ上皮の成長を促進するために必要であり、ラットで容易にアクセス可能である正常な間質を提供する導管構造を欠いているということです。この技術のもう一つの大きな利点は、それが焼灼し、成長する内因性乳腺の木を除去する必要性を排除するので、それは、最小限の侵襲性であるということです。さらに、中小肩甲膜脂肪パッドは、移植のための部位を分離するために使用することができる内側血管を含む。内因性腺はそのまま残るため、この技術は、内因性乳腺と移植された腺を比較する研究にも使用できます。本論文はラットの間肩甲膜白色脂肪パッドへの乳腺上皮細胞移植法について述べている。
概要
出生後の乳腺の発生および乳管形態形成は、主に思春期の発症時のホルモンシグナル伝達の影響を受けるプロセスである。乳腺生物学の一般的に使用されるモデル生物であるマウスおよびラットでは、このプロセスは約3週齢から始まり、急速な増殖と分化が成熟したパレンチマの形成をもたらす。成熟した乳腺は、20世紀初頭から調査中の拡張とインボル化の多数のラウンドを受けることができます。過剰増殖と癌の発症の文脈の中で、乳腺移植技術は1950年代1に開発され、1977年2、3、4年にGouldらによって寄与された定量的方法論によって増強された。げっ歯類の移植技術の改良は、正常な乳腺の発達および疾患状態に対する様々な治療および遺伝子操作の効果を研究するためにまだ広く使用されている正常な乳腺生物学を理解する上で大きな進歩に貢献している。
多くの仮説が生成され、その後、乳腺移植を使用してテストされています,最初にDeOmeらによって記述されました 1 . 1.数十年にわたる実験は、ドナー乳腺から切除された乳腺の切断の傾向を示し、脂肪パッド5、6、7全体を再移植し、乳腺発達の重要な成分がこれらの上皮構造に存在することを示した。マウスの後の研究は、単一の乳腺幹細胞がクリアされた脂肪パッドを再取り込みできることを示し、基底および明尿乳上皮細胞8、9、10の単一の共通の前駆細胞の発見に寄与した。これらの結論に沿って、移植は可塑性の結果として多系統的に再人口化する可能性を有する細胞のプールを増加させ、移植された細胞が機能的な乳腺7、10、11、12、13を成長させることが示唆されている。重要なことに、げっ歯類における移植技術の使用は、細胞培養誘発異常14の限界を克服し、多くの場合、わずか数週間で結果を提供する。
この処置はもともとマウスの前生性病変の文脈で説明されていたが、すぐにラットに拡大され、癌感受性15の尺度として多重性を確立するために発がん性治療と組み合わせて使用されたが、移植技術の人気は各種の遺伝的ツールの開発に続いている。移植を組み込んだマウス研究は多くの翻訳所見を占めているが、ラット乳腺のまん性はヒトに似ている16,17で、エストロゲン受容体陽性(ER+)乳癌を研究する上で明確な利点を提供する。乳腺腫瘍は両方の種で誘導可能であるが、それらはホルモン感受性および遺伝子発現プロファイルの点で異なる。主な違いは、ラット乳腺腫瘍が、ヒト乳癌の発光A亜型と同様に、卵巣および下垂体ホルモン受容体、すなわちエストロゲンおよびプロゲステロン(PR)の機能を発現し、依存することである。実際、乳腺上皮細胞移植は、このプロトコルに記載されているように、乳癌に関与する遺伝的変異体を研究し、乳腺上皮細胞18に及ぼす効果の細胞自律性を決定するために使用されている。
腫瘍生物学に加えて、正常ラット乳腺の管上皮は、より高いレベルの分岐を示し、マウスよりも深い間質層によって横たわっている。間質の重要性は、乳腺上皮移植研究において十分に文書化されている。乳腺上皮は脂肪間質と相互作用しなければならず、理想的には、その特徴的な形態形成19、20を受けるために、それ自身の間感覚と相互作用しなければならない。レシピエント乳腺に組織を移植することは最適な環境を提供します。しかし、内因性上皮の存在は結果を妨げる可能性があります。内因性上皮の乳腺を事前にクリアすることは、マウス移植アッセイで一般的に行われ、内因性乳腺組織の外科的切除および/または乳頭1、21、22の除去を必要とする。可能であるが、後の乳腺の前皮を前取りするラットは、主に後乳枝ラットの成長する乳腺の木を取り除く効果がないため、それほど広く行われない。体の他の場所で脂肪組織の領域が移植乳上皮21、23、24の成長を支えることができることが示されているので、プリクリアリングのプロセスは、組織を中小体白脂肪パッドに移植することによってラットで容易に回避することができる。
本論文に記載された移植方法は、酵素的に解ソシエアされた乳腺オルガノイド(乳管上皮および形態形成が可能な他の細胞タイプの断片)または単分散細胞を近交交型の間帯脂肪パッドに注射することを含む、実験室ラット2の間蓋脂肪パッドへの単分散性株。間肩甲膜脂肪パッドは通常乳腺組織を欠いているため、内因性上皮を事前に透明にする必要なしに、複数の移植部位に適した環境を提供する。その結果、宿主動物の内因性、腹部を肛門の乳腺は外科的操作の対象とならず、正常に発達し、結果の解釈を妨げることはできない。さらに、無傷の乳腺は、乳腺上皮発生および腫瘍形成18、25に対する宿主対ドナー効果を評価するための比較に使用することができる。単一幹細胞からの乳腺の再集団化はマウスに利用可能であるが、ラットに対してはまだ開発されておらず、主にラット乳腺幹細胞25、26、27に対して選択する抗体の入手可能性の欠如のためである。それにもかかわらず、単分散乳上皮細胞の移植は、再入可能な可能性を定量するためには成功し、それらの細胞は適切なフレームワーク2、3、4に移植すると正常に発達する。オルガノイドは多くの目的に適しているが、単分散細胞は定量的用途に必要であり、例えば、イオン化放射線治療28の後の癌開始に必要な乳腺上皮細胞の数を決定するか、または細胞学的に選択されたリンパ球上皮細胞集団29のフローの特性を比較する。
現在までに、ここで説明されている手順は、乳腺の発達と乳癌の発達の根底にあるメカニズムを研究するという全体的な目標を持つラットで乳腺移植を行う最も堅牢な方法である。多くの場合、ドナーおよび/またはレシピエント動物は、上皮移植の前、中、または後に異なる変数にさらされる。例としては、化学発癌30、放射線28、31、32、宿主/ドナーゲノム18の遺伝子操作、およびホルモン操作12を含む単一遺伝子研究が含まれる。本プロトコルに記載されている酵素解離の主な利点は、フローサイトメトリー、3D培養、遺伝子編集などを伴う相補的実験のために上皮オルガノイドまたは単分散細胞を単離する機会である。この技術の将来の応用には、遺伝子工学によるドナーおよび/または宿主組織の追加操作が含まれる。例えば、ドナー細胞はCRISPR−Cas9遺伝子編集システムを用いて選択されたゲノム遺伝子座において、任意のゲノム座座において遺伝的に改変され得る。同様に、レシピエントラットは、ドナーとレシピエントの遺伝子因子の相互作用を研究するために遺伝子的に改変することもできる。
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プロトコル
すべての動物はAAALAC認可施設に収容され、維持され、このプロトコルに記載された実験は、MUSC機関動物保護および使用委員会(IACUC)によって承認されました。相互移植に使用する動物は近親交配または等原性株であるべきであり、少なくとも6世代のコンジェニック状態が好ましいまたは後方交差する。
1. ドナーラット乳腺上皮の収穫
- 移植に必要なドナーラットの数を決定します。
注:一般に、1匹のドナーラット(4週齢)は、4匹のレシピエント動物に移植するのに十分な細胞を提供することができる。このプロトコルの特定のアプリケーションは、セルの追加の数を必要とし、総収率にひずみ固有の違いがあります。 - すべての供給にラベルを付け、外科医(表1)のアクセス可能な配置を確保します。
- 各雌ドナーラットの体重を記録します。ドナーラットを完全に麻酔または安楽死させるために制度上のガイドラインに従ってください。つま先のピンチに対する応答の欠如によって麻酔の深さをチェックしてください。
- 動物を無菌手術場に移動させる。背中に動物を置き、70%エタノールで全体の腹側表面をスプレーします。
- 胸部、腹部およびうねり乳腺へのアクセスを可能にする矢状、X字形の切開を作る。はさみを用いてドナーラットから乳腺組織をすべて解剖する(図1)。目に見えるリンパ節をすべて取り除きます。
- 乳腺組織を鉗子を使って抽出し、ラベル付きの60mm皿に入れます。60mm皿に500μLの無血清DMEM/F12培地を加えます。乳腺組織の配置を調整して、完全に濡れた状態を保ちます。
- はさみを使って乳腺組織を細かくミンチします。そのためには、組織を1~2mm3の大きさに切り取ります(図1C)。すべてのドナー組織が収穫されるまで、腺を氷の上に置いてください(60分を超えないでください)。
注:外科医が組織抽出を進める間、追加の人員は乳腺をミンチし、さらにコラゲナーゼ溶液を調製することができます。
2. 安楽死ドナーから脳組織を抽出する
- ドナー動物の体を慎重にひっくり返して、それを起こりやすい位置に置きます。ピンで固定します。頭と上部の背中に70%エタノールを噴霧します。
- 頭蓋骨の基部を見つけ、後頭の付き合いの下に切開を行います。皮膚の下に鋭いはさみを挿入し、頭の側面を含む頭蓋骨から皮膚を切り離します。
- 骨カッターや強いはさみを使用して、後頭から前頭骨まで、正中線に沿って頭蓋骨を切断します。下層の脳組織の破壊を防ぐために、ブレードを可能な限り表面的かつ斜めに保ちます。
- ロンギュールまたは強力な鉗子を使用して骨を剥がします。小脳に横の工具を挿入して両側の骨を折り、骨の聴覚管を露出させます。髄のつながりを断ち切る。
- 湾曲した細かい先端の鉗子で脳をそっと持ち上げます。ホイルの上に脳を置き、重量を記録し、すぐに氷の上に保存されたメディアの同じ量(w:v)と15 mLのチューブに転送します。
- 必要に応じて、細かい先端の鉗子を使用して下垂体(脳の下に位置する)を除去し、必要に応じて移植手順で追加の使用を行う。
- 機械的ホモジナイザーを使用して組織を破壊します。低速で10-15 sの脳を均質化します。混合物を少なくとも1分間氷の上に座らせ、再び均質化します。均質化は、最終的な混合物が大きな部分を含まない場合に十分である。
- ホモジネートを100μmのフィルターに通してフィルターします。使用するまで濾液を氷の上に置いておきます(4時間未満)。
3. 乳腺エキスの消化・処理
- 示されたように、解凍または温かい試薬 (表 1)。オルガノイドまたは単分散細胞を回復するための適切な手順に従ってください。
- すべてのドナー動物(補足ファイル1)のために10 mLの無血清消化培地(コラゲアーゼなし)を準備します。
注:使用される消化媒体の体積は、該当する場合、グループ化された組織に合わせて調整(拡大または縮小)することができます。- オルガノイドの場合は3.3にスキップします。
- 単分散細胞の場合、無血清コラゲナーゼ消化媒体に加えて、新鮮な単分散混合物および不活性化溶液(補足ファイル2、補足ファイル3)を調製する。ステップ 3.3 に進みます。
- ドナーからすべての乳腺組織が抽出され、ミンチされた場合、温かい(または室温)消化媒体にコラゲターゼ酵素を加える(補足ファイル1)。反転して混ぜます。
- 20 μm フィルターを介してコラゲ酵素消化培地を渡します。消化のためにラベル付けされた50 mLの管に10 mLの濾過された媒体を分配します。
- サンプルごとに新しい1,000 μLピペットチップを使用し、各60mm皿からコラゲナーゼ消化管に細かいドナー組織を移します。1,000 μLチップの端から1cm切り取り、使用前に手動でデバイスに置きます。ひき肉の組織を1〜2回軽く混ぜます。
注:組織が転写中にピペットに難しい場合は、50mLチューブから少量のコラゲアーゼ消化液を使用し、それを元に戻します。 - サンプルを振動インキュベーターの水平位置に配置し、サンプルが37°C、200〜220rpmで1.5-2時間消化できるようにします。
- オルガノイドの場合は3.7にスキップします。
- 単分散細胞の場合、最後の10分間の消化液にDNase I(0.2 μg/mL)を加えます。活発な揺れで、以前と同じインキュベート。ステップ 3.7 に進みます。
- 組織が完全に消化されると、1,200 x gで10分間冷間遠心(4°C)を用いて懸濁液をペレットにペレ(図1D)。
注:細胞の生存率を高めるために、すべてのステップの間に氷の上にチューブを保ちます。 - ペレットが形成されていることを確認し、慎重に上清と脂肪層を注ぎます。フレドをフレッシュDMEM/F12メディアの10 mLに静かに再吊り下げます。
- 約10sの68 x gで短時間スピンします。細胞の明確な分離がない場合、スピンの長さ(速度ではない)が増加する可能性があります。先に進む前にペレットを目視で検査します(図1D)。
- 小さなボリュームを残して、慎重に上清を取り除きます。次のステップに進み、オルガノイドまたは単分散細胞が必要かどうかに基づいて行います。
注: ペレットが非常に緩くなるため、チューブ内に少量のメディアを残しておく必要があります。媒体の残存量は洗浄ステップによって薄くする。- オルガノイドの場合は、さらに10 mLのDMEM/F12培地を追加し、洗浄/スピンを繰り返します。2回目の洗浄後、濾過のためにDMEM/F12培地のより小さい体積(1〜2mL)で細胞を再懸濁します。ステップ 3.11 に進みます。
- 単分散細胞の場合、0.025%(w/v)トリプシンおよび6.8 mM EDTAで予め温めたHBSSの2 mLに溶解します。37 °Cで3〜5分間消化します。直ちに無効にします。
- 10% FBS で DMEM/F12 の 4 mL を追加して、トリプシンの不活性化を停止します。
- 5分間270 x gで細胞を回転させ、DMEM/F12で再び10%FBSで再サスペンドします。ステップ3.11に進み、セルをフィルタリングします。
- 新しい50 mLチューブに入れた40μmの細胞ストレーナーを使用して細胞を濾過します。細胞を懸濁するために使用したのと同じベース培地の1 mLをピペッティングしてストレーナーを前湿し、次いで、ピペットを用いてフィルターを通して細胞懸濁液を通過させ、ダクト断片/オルガノイドを採取する。
注:1回の4週齢のドナーラットの乳腺組織からの濾過上皮のおよその収量は1x106細胞である。- オルガノイドの場合は、濾液を捨てます。乳腺オルガノイドは細胞のストレーナーのバスケットの中に残り、より小さく、望ましくない細胞は排除される。新しい50 mLチューブの上に細胞ストレーナーを反転させ、細胞を集めるために必要な任意のボリュームでリンスします。ステップ 3.12 に進みます。
- 単分散細胞の場合、細胞ストレーナーを捨てて濾液を保ちます。10%FBSでDMEM/F12の別のボリュームで消化/遠心分離に使用されたチューブをすすいで、同じ細胞ストレーナーを通過します。5分間1,200xgで遠心分離することにより単分散した細胞をペレットにする。
メモ: 再中断されたセルは、後続のアプリケーションに対応する準備ができています。
- パルスは、次のステップに進む前に、溶液をスピンし、細胞ペレットの形成を確認します。必要に応じて、パルススピンを再び行います。
- 上清を慎重に取り除きます。ペレットを少量(1,000~2,000 μLのDMEM/F12)に再懸濁し、細胞を濃縮してカウントします。
- 細胞を数え、必要に応じて希釈します。各動物のDMEM/F12培地の20 μLで、移植用の所望の数の細胞を再懸濁します。細胞は常に氷の上に置いてください。
注:ドナー細胞数1 x 105 -1 x106細胞は、研究の終点に基づいて各移植片部位に必要とされます。例えば、発がん実験では、他の用途に比べて、より多くの移植細胞が必要になることが多い。必要な細胞数は、各株について実験的に決定されなければならない。このプロトコルに記載された手順は、ステップ3.16に記載されているように、脳ホモジネートと混合する前に、移植片部位当たり20μL培地で250,000個のドナー細胞を利用した。 - 他の実験に必要な細胞(例えば、FACS分離3、26、27、30、33)の任意のアリコートを準備します。
- オルガノイドについては、ステップ3.16に進みます。
- 単分散細胞の場合は、トリパンまたはメチレンブルー染色を用いて生存細胞を定量し、次に進みます。
- すべての移植レシピエントにドナー材料の単一のバッチを準備します。移植のすべての部位について、50%の脳ホモジネート(20μL)と細胞懸濁液(20μL)の等量を組み合わせます。
注:各サイトに計40μLの注入が行われますが、廃棄物の場合は最低25%の余分な量を含めるのが推奨されます。 - 移植後に細胞を固化または凍結して、すぐに移植を行う(潜在的停止点)。
注:冷凍細胞はこのプロトコルでテストされておらず、移植実験のための動物のコホートを生成する前に最適化が必要です。新鮮な細胞を移植することを強くお勧めします。
4. 移植手順 (レシピエントラット 4-5 年齢の週)
- 各レシピエントラットを秤量し、手順で使用される承認された鎮痛薬の正しい用量を計算する。
メモ:体重は、手順の前に24時間まで測定することができます。シェービングの間、各動物を拘束または短時間麻酔するには、制度上のガイドラインに従ってください。 - 電気バリカンを使用して、各動物の外科領域を剃ります。頭蓋骨の基部と椎骨柱の開始を特定します。背骨の約3分の1の道は、背中の胸部の上胸部に3cm x 2cmの領域を剃ります。
注:シェービングは、移植日に麻酔下で行うこともできますが、無菌フィールドの外で行う必要があります。必要になるまでラットを自宅のケージに戻します。 - 移植に必要なすべての物資を見つけます (表 1)。
- 使用前に実験動物麻酔システムを評価する。流体を取り除き、必要なタンクや部品を交換してください。麻酔室へのガスラインが開いていて、すべての末梢線が閉じられていることを確認し、イソフルラン麻酔と酸素がチャンバーに入れられると動物に自由に流れ込む可能性があります。
- レシピエント動物の体温をサポートする温かい加熱パッド。
- 手術に使用する無菌フィールドを生成します。表 1に示すように、消耗品を配置します。
- 術前の鎮痛作用を、制度的に承認された動物ケアプロトコルによって示されるようにレシピエントラットに投与する。
- ハミルトンの注射器を滅菌DMEM/F12メディアで洗い流し、細胞の損失を防ぎます。針が注射器の本体に固定されていることを確認し、針を液体に挿入し、プランジャーを引き戻します。最大音量まで入力します。プランジャーを押し下げて、内容物を廃棄物収集チューブに追い出します。3~5回繰り返します。
- ドナー物質の全容積(ステップ3.16で調製)を、条件ごとに別々のシリンジ(例えば、コントロール、処理、ワイルドタイプ、ノックアウトなど)にロードします。針の先端を液体に挿入し、プランジャーを引き戻し、チューブの体積が減少するにつれて、混合物の表面の下に針を保ちます。
注:各シリンジに少なくとも10%の余分なボリュームを含めます。残りの混合物をチューブを閉じて処分し、より多くが必要な場合には氷の上に保管しないでください。 - 完全に装填された後に注射器を反転させ、プランジャーを少し押して、針先の気泡を取り除きます。準備が整ったら次のステップに進みます。
メモ:無菌フィールド内であっても、針の先端が他の表面に触れないようにしてください。細胞の生存率を促進するために氷の小さな容器の上に注射器の体を休ませるのが有用である。 - レシピエント動物を麻酔室に入れ、機械の電源を入れます。
- 動物が完全にリラックスしているとき(チャンバーのタッピングまたは穏やかな動きに反応しない)、麻酔を鼻コーンに向け、動物を無菌フィールドに移す。
注:麻酔の延長持続時間は、ラットによって十分に許容されません。各動物の手順を10分以内に完了します。 - 頭の後ろと上背骨にアクセスできるように、動物を(胃の上に)起こりやすい位置に置きます。
注:動物に対して常に十分な熱サポートを確保し、定期的にしっかりとしたつま先のピンチを使用して麻酔の深さを評価してください。 - 必要に応じて、眼科用の軟膏を塗布して眼の乾燥を防ぎます。
- 剃りたての部分をクリーニングして、余分な髪を取り除きます。円形運動を使用し、70%エタノール(または制度ガイドラインごとに別の試薬)を皮膚に塗布し、続いて消毒剤(ヨウ素など)を塗布し、繰り返します。かきの領域の領域のみが露出するように、動物の上にタオルドレープを置きます。
- しっかりとしたつま先のピンチで深い刺激に反応しないことを確認し、次のステップに進みます。
- 鋭い外科用刃を使用して小さい(2 cm)間肩切開を行う。
注:脂肪パッドは皮膚のすぐ下にあるので、カットは表面的でなければなりません。 - 向きの内側の血管を見つけます (図 2B)。
- 鉗子を使用して切開片の片側の皮膚を持ち上げ、移植が行われている間、脂肪パッドから離したままにします(図2B)。針を移植片部位に挿入します。
- 必要に応じて、組織の中に針の先端を移動し、細胞を収集するために小さなポケットを作成します。小さな繰り返しの動きを使用します。針を取り外さないで下さい。
注 : この手順は、プロトコルの初回ユーザに推奨されます。ポケットを作成する際は、細心の注意を払って脂肪パッドの間の組織が非常に繊細です。
- 必要に応じて、組織の中に針の先端を移動し、細胞を収集するために小さなポケットを作成します。小さな繰り返しの動きを使用します。針を取り外さないで下さい。
- 細胞混合物の40 μLを慎重に、中小片脂肪パッド組織に注入する。針をゆっくり取り外します。
- 組織を所定の位置に保持し、移植された細胞が3〜5 s.必要に応じて追加の鉗子のペアを使用するようにします。
- 針を取り外します。移植の第2部位で注射手順(ステップ4.18-4.21)を繰り返す。
注:1つのドナー群からの上皮は、すべての動物の脂肪パッドの同じ側に注入することができ、または外科医の手の支配からのバッチ効果を防ぐために交互の側面。 - 創傷クリップまたは縫合糸を使用して外科的創傷を閉じ、麻酔を中止する。
- 制度的に承認されたプロトコルによって示されるように術後鎮痛薬を提供します。
- すぐに熱サポートと回復ケージに動物を移動します。切開からの出血や呼吸困難などの苦痛の兆候を監視します。
注:動物は5〜10分以内に完全に回復する必要があります。生存手順の後にコロニーに動物を戻し、術後の監視のための制度的ガイドラインを参照してください。 - 必要に応じて、移植後3〜4週間にレシピエントラットに発癌物質を投与することにより移植片部位で発癌研究を行う。
注:典型的には、ラット乳がんの発癌は、50〜57日の生後の化学発癌剤治療を用いて行われる。この治療は移植手術の年齢を指示する(29〜36日の間に行われなければならない)移植細胞が乳腺の成長を開始するのに十分な時間を与える。
5. 上皮の成長の評価
- 毎日の膣洗浄を通してラットの口内循環を監視し、顕微鏡のスライドで細胞学を調べる。研究の終点の8-12日前に開始します。同じ段階ですべてのラットを犠牲にします。これはオプションの手順です。
注:ラットのエストラスサイクルは4-5日です。動物が1-2の完全な周期を通過することを許可することは、比較のために前の周期からの洗浄のスライドが、使用することができるように、解釈を促進する。 - 移植後6~8週間の屠殺移植レシピエントラットは、制度ガイドラインに従う。
注:外生は通常、移植後3〜6週間検出可能ですが、追加の時間が必要な場合があります。 - 動物を起こりやすい位置に置き、70%エタノールで体をきれいにします。鉗子で皮膚を持ち上げ、椎骨の柱に沿って切開して、肩甲膜間脂肪パッドを露出させます。脂肪パッドの大部分が見えるように、組織から皮膚を解剖します。
- 間肩甲膜脂肪パッドの移植片部位を分離する内側血管を特定します。パッド全体を単一の組織として切り取るか、血管に沿って切り取り、側面を個別に取り除きます。
- 全体のマウントのための正に荷電した顕微鏡のスライドの上にティッシュを置きます。鈍い鉗子の2ペアを使用し、滑り台の元の立体構造を回復するためにティッシュを穏やかに広げる。
注:ラット乳腺組織は非常に繊細です。組織の縁は、それ自体の下でカールする可能性があります。常に注意して取り扱い、組織がスライドに付着するまで所定の位置に保持します(数秒)。 - 全体を全体の腹部を持つ腹部の浸潤乳腺の少なくとも1つ(向きのためのリンパ節と)比較のために。
- 70%エタノールに70~10日間スライドを入れ、組織を脱脂します。組織が乾燥しないように、必要に応じてエタノールを必要に応じて補充してください。
- ミョウバン-カルミン染色を準備し、組織が十分に不透明な場合にスライドを処理します。使用前に汚れを冷やします(補足ファイル4)。
注:汚れは固定および再水和のステップの1日前まで準備することができる。この溶液は4°Cで貯蔵することができ、再利用の可能性は限られています。 - 25%の氷酢酸にスライドを置くことによって組織を固定する:60分間の75%エタノール。
- エタノールの一連の減少濃度で一連の3つのスイッシングを通して組織を水分補給する:エタノール70%15分、5分間50%エタノール、5分間のdH2O。
- 4-8日間ミラムカーミンで染色。毎日スライドの裏をチェックして、汚れが完全に組織に浸透しているかどうかを判断します。染色が完了したら、次のステップに進みます。
注: 染色は、腺の最も厚い部分が紫色の色で、白く表示されなくなったときに完了します。 - デステインとエタノールの一連の増加濃度を介してスライドを移すことによって組織を脱水:30分のエタノール70%、30分の95%エタノール、30分間の100%エタノール。
- 脱水スライドをキシレンに3+日間置き、組織をクリアします。長期保存用のミネラルオイルへの移送。
- スライドがクリアされた後、低電力の光顕微鏡または高解像度のデジタル写真を使用して、分析用スライドの画像を取得します。すべてのスライドで画像取得パラメータが一貫していることを確認します。
注:上皮の成長は明確に区別可能でなければなりません。 - 成長の存在をバイナリの結果として扱います。
- 取得した画像を使用して、移植部位の50%で≥1乳腺成長を生み出した移植された上皮細胞の平均数を計算します。必要に応じて、その他の物理的な特徴を定量化します。
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結果
ドナーとレシピエント乳腺
移植用ラット乳腺上皮細胞を単離して調製するステップを図1Aに示す。生後4週齢では、ドナーラットの内因性乳腺が成熟を開始し、上皮は、ミョウバンカルミンで染色された全ての取り付けスライド上で可視化することができる(図1B)。この年齢で1人のドナーラットは、移植のために約1 x 106細胞を提供します。ドナー組織の採取量または後にミンチが不十分な場合、コラゲナーゼ消化後の細胞の収率が低くなる可能性がある。したがって、ドナーからできるだけ多くの乳腺組織を収集することが重要です。完全に消化された乳腺組織は、懸濁液中に目に見える組織の部分を持たない油性の外観を有する必要があります (図 1
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ディスカッション
このプロトコルは、ラットを操作するために最適化された乳腺上皮細胞移植技術を記述する。ドナーラットから単離された乳腺上皮オルガノイド(3〜5週齢)は、レシピエントラットの間肩膜白色脂肪パッド(また3〜5週齢)に移植される。結果は、わずか4〜6週間後に、移植された組織を調べるために軽顕微鏡を使用して解釈することができる。しかし、移植と犠牲の間の最適な時間は、完全な実験を実施する前に決定されなければならない。時間が過ぎても時間が過ぎると、結果は解釈可能でも意味もありません。プロトコルを最適化するには、移植後6〜8週間の小さな動物の群で増殖を分析する。移植された上皮が存在するが、未発達の場合は、時間の長さを増やす。移植片がよく発達しているが、上皮の重なる特徴が分析を妨げている場合は、上皮の成長のための週数を減らすことを検討する。時間を短縮できない場合(例えば、発癌実験で)、結果は個々から解釈できないため、両方の移植部位(内側血管の両側に1つ)に同じタイプのドナー上皮を注入することをお勧めします。100%の確実性を持つ側面。どのようなタイプの相互作用(オートクリン、パラクリン)が疑われる場合、同じタイプのドナー上皮を注射した追加のコントロール動物...
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開示事項
著者たちは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、国立衛生研究所(https://www.nih.gov/)からのホリングスがんセンター支援助成金P30 CA138313パイロット研究資金とサウスカロライナ医科大学病理学研究所医学部からの資金によって資金提供されました。インタビューの声明を録音してくれたマリイネ・スミスに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.2 &マイクロ;Mシリンジフィルター | フィッシャーサイエンティフィック | 09-715G | 滅菌ろ過コラゲナーゼ消化培地 |
| 1.5-2.0mLマイクロ遠心チューブ(滅菌) | フィッシャーサイエンティフィック | 05-408-129 | 再懸濁細胞および/または脳ホモジネート混合物 |
| 100&マイクロ;M細胞ストレーナー | コーニング | 431752 | フィルタリング脳 ホモジネート |
| 100 uL ガスタイトシリンジ 25ゲージ針付き | ハミルトン | 81001 & 90525 | レシピエント動物に移植片混合物を注入するため (ドナーの遺伝子型/条件ごとに 1 つ) |
| 1000 uL ピペットチップ + ピペット | - | -細胞/混合物/組織を移送 | |
| 15 mL ポリプロピレンチューブ | ファルコン (コーニング) | 352196 | 脳ホモジネート混合物の貯蔵、または細胞:移植用のホモジネート混合物 |
| 40µM細胞ストレーナー | Corning | 431750 | 細胞ペレット洗浄後のオルガノイドのフィルタリング |
| 50 mL ポリプロピレンチューブ | フィッシャーサイエンティフィ | 05-539-6 | ドナー乳腺組織のコラゲナーゼ消化用 |
| 60 mm ディッシュ | サーモサイエンティフィ | 130181組織 | ミンチ用 |
| ミョウバン 硫酸カリウム | シグマ・アルドリッチ | 243361/237086 | 染色乳腺 ホールマウント |
| スライド 獣医用麻酔気化器 | - | - | 施設のプロトコルに従ってください |
| ベータダインまたはヨウ素 | - | - | |
| 均質化のためのホウケイ酸ガラス培養管 | フィッシャーサイエンティフィック | 14-961-26 | (ホモジナイザーに適切なチューブを使用) |
| カーマイン | シグマ-アルドリッチ | C6152/1022 | 腺染色ホールマウントスライド |
| 細胞計数装置 | - | ||
| 回復のためのきれいな動物ケージ | - | 機関のプロトコルに従う | |
| コラゲナーゼ3型 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | ドナーラットからのミンチ乳腺組織の酵素的消化 |
| 脱イオン水 | - | 化学溶液 | |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | 組織、コラゲナーゼ消化培地および再懸濁上皮細胞混合物 |
| EDTA- | - | 単分散混合物 | |
| エタノール、200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | 乳腺ホールマウントスライド固定剤、乳房ホールマウントスライド洗浄、外科的切開部位の洗浄(希釈) |
| ウシ胎児血清(FBS) | ハイクロン | 不活性化溶液 | |
| ガーゼ | - | - | |
| 氷酢酸 | フィッシャーサイエンティフィック | A38-212 | 乳房ホールマウントスライド固定剤(100%エタノール中の1:4氷酢酸) |
| HBSS | GIBCO | - | 単分散混合物 |
| 加熱パッド | - | - | 機関のプロトコルに従う |
| アイスバケツ(x2) | - | 軌道 | |
| 回転式インキュベーター | -37°Cを維持できなければなりません。C、220-225 RPMで振とう(乳腺組織のコラゲナーゼ消化用) | ||
| イソフルラン麻酔 | - | - | 機関のプロトコルに従う |
| 光学顕微鏡またはデジタルカメラ | - | - | 全体のマウントされた乳腺上皮の視覚化および/または画像の取得 |
| メカニカルホモジナイザー | フィッシャーサイエンティ | フィック- | ティマイザーまたは代替モデル |
| 鉱物油、純粋 | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | クリアされた乳腺の長期保存 ホールマウント |
| 麻酔気化器用酸素タンク | - | -機関のプロトコルに従う | |
| ペーパータオルまたは繊細なタスクワイプ | - | ||
| 正に帯電した顕微鏡スライド | Thermo Scientific | P4981-001 | 乳腺組織全体マウント |
| 術後鎮痛剤 | - | - | 機関のプロトコル |
| 体重測定 | 、鎮痛剤の適切な投与 | ||
| シェーバー | -- | 電気クリッパー、またはその他の | |
| 染色瓶 | - | - | 化学洗浄ごとに最低1つ、スライドの数に適したサイズ、ガラス優先 |
| 滅菌フィールドドレープ | IMCO | 4410-IMC | 移植中に使用される |
| 滅菌ハサミと鉗子x3(オートクレーブ滅菌済み) | - | ド | ナーとレシピエントに使用されるオートクレーブ手術器具 |
| シリンジ:5mL(またはそれ以上) | コラゲナーゼ消化媒体の滅菌ろ過用 | ||
| トリプシン | ワージントン | 単分散混合物 | |
| 液体(注ぐまたは吸引)用の廃棄物収集容器 | - | - | |
| 傷口クリップアプライヤー、クリップ、取り外しツール | Fine Science Tools | 12020-00 | 肩甲骨間白パッドパッドの上の皮膚切開部を閉じる |
| キシレン | フィッシャーサイエンティフィ | X3S-4 | 染色後の乳腺全体のマウントスライドをクリア |
参考文献
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