方法論記事

化学的集団移動のためのマイクロ流体学と統合された牽引顕微鏡

DOI：

10.3791/60415

⸱

2019年10月13日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Korea University, 2Department of Mechanical Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3Department of Environmental Health, Harvard T.H. Chan School of Public Health

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

発達における集団細胞移動、創傷治癒、癌転移は、多くの場合、成長因子またはシグナル伝達分子の勾配によって導かれる。ここでは、トラクション顕微鏡とマイクロ流体システムを組み合わせた実験システムと、生化学的勾配下での集団移動の仕組みを定量化する方法のデモンストレーションを行います。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞は、刺激の勾配を含む化学刺激に応じて移動パターンを変化させる。化学勾配の方向への細胞移動は、化学的勾配として知られており、発達、免疫応答、創傷治癒、癌転移において重要な役割を果たしている。化学タキシスは、単一細胞の移動と生体内の細胞のコレクションを調節する一方で、インビトロ研究は、適切な実験ツールの欠如のために、単細胞化学タキシスに焦点を当てています。このギャップを埋めるために、ここで説明するマイクロ流体とマイクロパターニングを組み合わせて、集団細胞移動に対する化学勾配の影響を実証するユニークな実験システムを説明します。さらに、トラクション顕微鏡と単層ストレス顕微鏡は、基板上の細胞力の変化を特徴付けるためにシステムに組み込まれ、隣接する細胞間でも変化します。概念実証として、マディン・ダービーイヌ腎臓(MDCK)細胞の微小パターン状の円形島の移動は、既知の散乱因子である肝細胞増殖因子(HGF)の勾配の下で試験される。HGFの高濃度付近に位置する細胞は、細胞島内の反対側の細胞よりも速く移動することがわかった。同じ島内では、細胞トラクションは両側で類似しているが、細胞間ストレスはHGF濃度が高い側ではるかに低い。この新しい実験システムは、細胞集団による化学的移動の力学を研究する新しい機会を提供できる。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生体系における細胞移動は、組織形成、免疫応答、および創傷治癒1、2、3に関与する基本的な現象である。細胞移動はまた、癌4のようないくつかの疾患で重要なプロセスです。セルは、多くの場合、個別ではなくグループとして移行します。細胞が集合的に移動するためには、微小環境のセンシングが不可欠6.例えば、細胞は物理化学的刺激を知覚し、運動性、細胞基板相互作用、および細胞間相互作用を変化させ、化学勾配7、8に沿った方向移動をもたらし、応答する。 9,10.この接続に基づいて、化学集化剤11、12、13の勾配のようなよく制御された化学微小環境を作成することができるラボオンチップ技術の急速な進歩がなされた.これらのラボ・オン・チップベースのマイクロ流体学は、以前に細胞アンサンブルまたは細胞スフェロイド14、15、16、17の化学タキシスを研究するために使用されてきましたが、単一セル移行18、19、20、21のコンテキストで主に使用されています。化学勾配に対する細胞集合応答の根底にあるメカニズムは、まだよく理解されていない14,22,23,24,25,26.したがって、可溶性因子の時空間制御を可能にするプラットフォームの開発と、細胞の生物物理学のその場観察は、集団細胞移動の背後にあるメカニズムを解明するのに役立つ。

ここで開発および説明されているのは、パターン化された細胞クラスターの移動を調節する可溶性因子の濃度勾配の生成を可能にする多チャネルマイクロ流体システムである。本研究では、肝細胞増殖因子(HGF)がマディン・ダービーイヌ腎臓(MDCK)細胞の移動挙動を調節するために選択される。HGFは、細胞の完全性を減衰させ、細胞27、28の運動性を高めることが知られている。マイクロ流体系では、フーリエ変換トラクション顕微鏡と単層ストレス顕微鏡も組み込まれており、HGFに応答して構成細胞によって誘導される運動性、収縮力、および細胞間張力の分析が可能です。グラデーション。同じ島内で、HGFの高濃度付近に位置する細胞はより速く移動し、低いHGF濃度を有する側のものよりも低い細胞間ストレスレベルを示す。この新しい実験システムは、様々な可溶性因子の化学勾配下での集団細胞移動を含む分野における他の疑問を探求するのに適していることを示唆している。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:ステンシル(厚さ= 250 μm)およびマイクロチャネル部品(厚さ=150μm)、ガラスエッチング(深さ=100μm)、鋳造加工のためのSU-8金型のリソグラフィは、コンピュータ支援設計ソフトウェアを使用して設計をメーカーに送信することで外部委託されました。

1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)ステンシルおよびマイクロチャネルの製造

  1. ステンシルとマイクロチャネルのマイクロパターンを設計します。
  2. シリコンウエハ(直径4")上にSU-8金型(ステンシルの厚さ~250μm、マイクロチャネルの場合は約150μm)を製造または委託してください。
  3. 塩基エラストマーと硬化剤を10:1の比で混合してPDMS混合物を調出す。
    1. 50 mL円錐管にベースエラストマーの15mLを入れ、硬化剤の1.5 mLを追加します。これらのうちの2つを準備します。
    2. PDMS混合物を5分間渦にして、PDMS混合物を196 x gで1分間遠心分離し、気泡を除去する。
  4. PDMSステンシルを製造するには、PDMS混合物をウェーハに約1mL注ぎ、SU-8パターン領域を避けながら、PDMSがSU-8柱の側面に接触するが、SU-8パターンの上部に触れないようにする。
    1. ウェーハを室温(RT)で30分以上平らな面に置きます。2時間以上80°Cの乾燥オーブンでPDMSを硬化させます。
    2. SU-8型から慎重にPDMSを剥がし、14mmの中空パンチを使用して薄いPDMS膜をトリミングします。粘着テープを使用してPDMSピースの表面のほこりを取り除き、PDMSステンシルをオートクレーブします。
  5. PDMSマイクロチャネルを製造するには、SU-8金型の上に約30 mLのPDMS混合物を注ぎます。
    1. 真空室で30分間ドガを行い、2時間以上80°Cの乾いたオーブンでPDMSを硬化させます。
    2. SU-8型から慎重にPDMSを剥がし、24mm x 24 mmのサイズにPDMSをカットします。各PDMSブロックで、1mmの生検パンチを使用して1つの出口と3つの入口を作成します。

2. ポリアクリルアミド(PA)ゲルを使用したボトムガラスの調製

  1. 長方形のマイクロウェル(6 mm x 12 mm、100 μm 深さ29)を使用した長方形スライドメガネ(24 mm x 24 mm x 1 mm)を、メガネの切断およびエッチングにより製造または外部委託します。
  2. 底ガラス30の表面をサイラス化する。
    1. 脱イオン水(DIW)の200mL、酢酸80μL、3-(トリメトキシシル)プロピルメタクリレート(TMSPMA)の50μLを1時間混合して結合シラン溶液を調製する。
      注意:TMSPMAは可燃性液体です。材料安全データシートの推奨事項に従ってください。化学ヒュームフードでのみ使用してください。
    2. 粘着テープでガラスの表面からほこりを取り除き、ガラスをオートクレーブします。
    3. バインドシラン溶液の100 μLで底ガラスのエッチング面を覆い、1時間RTでガラスを残します。
    4. DIW 3xでガラスをすすいで、周囲の空気温度で、または空気を吹き付けることによってガラスを乾燥させます。
  3. PAゲル31用のゲル溶液を調出す。
    1. DIWの1mLで5mgのAPSを溶解することにより、0.5%(w/v)の硫酸アンモニウム(APS)の新鮮な溶液を調出します。
    2. 40%アクリルアミド溶液の138 μL、2%のビスアクリルアミド溶液の101 μL、5μLの蛍光粒子溶液(0.2μm)、およびDIWの655μLからなるPAゲル溶液を調製する。
      注意: アクリルアミドおよびビサクリラム化溶液は有毒です。保護手袋、衣類、目の保護具を着用してください。蛍光粒子を含むPAゲル溶液を光から保護します。
      注:ピペッティング前の蛍光ビーズ溶液を渦にして、バッチ当たり一定数の蛍光ビーズを得る。
    3. APS溶液の100μLとテトラメチルチレンジアミン(TEMED)の1μLを加えた後、10μLの混合ゲル溶液を長方形のマイクロウェルに移し、円形カバースリップ(18mm)の上に置きます。
      注:気泡なしでPAゲルで底ガラスを充填するには、底ガラスの溝に十分なゲル溶液を置き、慎重にゲル溶液の上にカバースリップをスライドさせ、余分なゲル溶液を除去します。
      注意:ゲルは約40分間ゆっくりと硬化します。遠心ゲルの次の手順は、できるだけ早く行う必要があります。
    4. カスタムガラス、ゲル溶液、カバースリップの組み立てを反転し、96 x gで10分間遠心分離機を使用して、PAゲルの最上層に蛍光粒子を持ち込みます。
    5. 遠心分離機からアセンブリを取り外し、カバースリップを下にして平らな面に置きます。
      注:ステップ2.3.6から始まり、バイオセーフティキャビネットでサンプルを処理します。
    6. 30分後、アセンブリを反転し、35ミリメートルペトリ皿に入れ、DIWの2 mLで満たし、(鉗子を使用して)片側にスライドさせてカバースリップを静かに取り外します。
      注:硬化PAゲルは1ヶ月間DIWに保存することができます。しかし、コラーゲンをPAゲルに塗った後は、1日以内の実験で使用する必要があります。
  4. PAゲルにコラーゲンを塗ります。
    1. 1 mg/mLスルホスクシニミジル6-(4'-azido-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート(スルフォ-SANPAH)を温暖な50mM HEPESバッファーに溶解する。溶液の200 μLをゲル表面に落とし、UV光(365nm波長)で10分間活性化します。
      注:スルフォ-SANPAHを光から保護します。
    2. ゲルを0.1 M[4-(2-ヒドロキセチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸でリンスする。HEPES]バッファ2xとPBS 1xと。
    3. PAゲルをコラーゲン溶液(PBSで100μg/mL、ラットテールコラーゲンタイプI)を一晩4°Cで塗ります。翌日はPBS3xで洗います。

3. 細胞島の微小パターン化

  1. F-127(材料の表)溶液[PBSで2%(w/v)]を準備し、F-127溶液にオートクレーブされたPDMSステンシルを浸します。37 °Cのインキュベーターに1時間保管してください。
  2. からなる細胞培養培地中の細胞溶液(2 x 106細胞/mL)を調製する:ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)と10%の胎児ウシ血清(FBS)および1%の抗生物質抗菌性(AA)を含む。
  3. PBS 3xでPDMSステンシルを洗浄し、PDMSステンシルとPAゲルの両方から液体を取り除きます。PDMS ステンシルを PA ゲル上に配置し、ステンシルに PBS を追加します。
  4. 穏やかにピペッティングすることにより、PDMSステンシルの穴の気泡を削除します。気泡を取り除いた後、PDMS ステンシルの表面から PBS を取り外します。
  5. PDMSステンシルに200μLの細胞溶液を入れた後、細胞がPAゲルに付着するように1時間インキュベーターにPAゲルを保管してください。
  6. 細胞培養培養剤で細胞溶液を静かに洗い流し、PDMSステンシルを除去し、より多くの細胞培養培養培養培養剤を追加する。顕微鏡下で細胞島の形成を確認してください。

4. PDMSマイクロチャネルを使用したPAゲルの組み立て

  1. 粘着テープを使用してPDMSマイクロチャネルのほこりを取り除き、オートクレーブします。
  2. PDMSマイクロチャネルの表面を酸素プラズマ(80 W、50 kHz)で30秒扱います。
  3. PAゲル充填ボトムガラスの流体を取り除いた後、PDMSマイクロチャネルを底面ガラスの上に置き、カスタムガラスホルダーにアセンブリを置きます。
  4. マイクロチャネルを細胞培養培地で充填する。
    注意:温かいメディアをピペットでそっと洗い流すことで、チャネルに閉じ込められたすべての気泡を取り除くようにしてください。また、気泡を除去しながら、マイクロパターン化された細胞島を取り外さないようにしてください。

5. 統合されたマイクロ流体システム

  1. チューブを接続します。
    1. 針の先端(18G)をトリミングし、90°を曲げてコネクタを準備します。
    2. 3つの入口と1つの出口のためのチューブラインを準備します。
      1. 入口チューブの場合は、トリミングされた針と30cmのミニボリュームラインを3ウェイストップコックで接続します。これらのうちの3つ。
      2. コンセントチューブの場合は、トリミングされた針と75cmのミニボリュームラインを3ウェイストップコックで接続します。これらのうちの1つを準備します。
      3. 1時間予熱した媒体でチューブラインを埋めます。
        注意:暖かいメディアを注射器でそっと洗い流すことで、チューブラインに閉じ込められたすべての気泡を取り除くようにしてください。
    3. 注射器からプランジャーを取り除き、入り込みチューブラインを接続して、貯水池を準備します。
    4. 各チューブラインの針コネクタをマイクロ流体装置の3つの入口と1つの出口に差し込みます。
  2. 新鮮な媒体または条件付き媒体の3 mLで貯水池を満たします。
    1. 勾配試験では、左入口貯留部に20 ng/mL HGFを細胞培養培地に充填します。
    2. 濃度勾配の可視化のために、左入口貯留部に200 μg/mL蛍光色素(ローダミンB-dextran、70 kDa)を追加します。
    3. コンセントチューブラインをシリンジポンプに接続します。
      注:シリンジポンプの動作モードは「撤退」です。流量は、シリンジポンプのシリンジの容量と動作速度に応じて変化します。
  3. 従来のエピ蛍光顕微鏡のステージに統合されたマイクロ流体システムを配置します。
    注意: マイクロ流体チャネルで HGF の緩やかな勾配を生成するには、流量が 0.1 μL/min と同じくらい遅くする必要があります。これは2時間の安定化を必要とするように十分に敏感であり、実験中の物理的な妨害を避けるために注意する必要があります。

6. 画像取得

  1. インキュベーターに収容された自動顕微鏡を使用して、最大24時間10分ごとに画像を撮影します。各タイムポイントで、細胞移動を可視化する位相画像、PAゲルに埋め込まれた蛍光ビーズを可視化する緑色蛍光画像、赤色蛍光画像など、3つの異なる経路で4倍の対物レンズを用いて一連の画像を撮影し、化学物質の濃度勾配。
  2. タイムラプス画像を撮影した後、0.25%トリプシン-EDTA溶液をマイクロチャネルに注入し、PAゲルから細胞を剥離します。ゲルから細胞を完全に除去した後、トラクション顕微鏡の基準画像として使用する緑色蛍光画像を撮る。

7. データ分析

注: MATLAB を使用してデータ分析用のカスタム コードが開発され、詳細は32、33、34、35、36の他の場所で説明されています。

  1. 位相画像解析の場合、粒子画像ベロシメトリー36を使用して、2つの連続した位相画像における変位を計算する。
  2. フーリエ変換トラクション顕微鏡検査では、各緑色蛍光画像を参照画像と比較し、粒子画像ベロシメトリー36を用いて各画像の変位を計算する。変位から、フーリエ変換トラクション顕微鏡検査33、34、37を使用してPAゲル上の細胞によって作られたトラクションを回復する。
  3. トラクションデータから、有限要素法32、34、38に基づいて単層応力顕微鏡を用いて細胞島の単層内の応力を算出する。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

化学勾配下での集団移動を探索するために、微小流体システムをトラクション顕微鏡検査と統合した(図1)。統合システムを構築するために、ポリアクリルアミド(PA)ゲルをカスタムカットガラス上に鋳造し、MDCK細胞はPDMSステンシル製のマイクロパターン化された島内に播種した。この実験では、MDCK細胞の12の島(3列で4列、直径約700μm)を作成した。PAゲルに付着した細胞の後、PDMSステンシルを除去して集団移動を開始した。あらかじめ作られたマイクロ流体チャネルをPAゲルの上に置き、細胞島の上にマイクロ流体チャネルを構築した(図1A)。

次いで、マイクロ流体チャネル内に濃度勾配を確立し、左入口を蛍光色素溶液を含む供給貯留部に接続した。さらに、中央と右の入り込みは、メディアのみを含む供給貯蔵所に接続されました。次に、出口をシリンジポンプに接続し、マイクロ流体チャネルから流体を除去した。カスタムカットガラスとマイクロ流体チャネルのサンド...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

構成細胞の集合的な移動は、発達および再生の間に重要なプロセスであり、移行方向はしばしば成長因子4,23の化学勾配によって導かれる。集合的な移行中、セルは隣接するセルや基底の基板と相互作用し続けます。このような機械的相互作用は、デュロタキシス42、プリト軸33、およびキノタキシカル43などの緊急現象を引き起こします。しかし、この研究は、胎児ウシ血清のような単一濃度の成長因子を用いて行われた。ギャップを埋めるために、このプロトコルは、化学勾配下での集合的な細胞移動中の機械的相互作用を測定できる新しい実験プラットフォームについて説明する。

新しいプラットフォームは、マイクロパターニング、トラクション顕微鏡、マイクロ流体解析の3つの実験システムを組み合わせたものです。まず、集団移動のための細胞島のマイクロパターン化を行った。第二に、...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、韓国政府の助成金を受けた韓国国立研究財団(NRF)の助成を受けました( いいえ)NRF-2017R1E1A1A01075103)、韓国大学助成金、BK 21 Plusプログラム。また、国立衛生研究所(U01CA202123、PO1HL120839、T32HL007118、R01EY019696)によってサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.25% トリプシン-EDTA (1X)Gibco25200-056
1 M HEPES 緩衝液Gibco15630-056
1 mm バイオプシーパンチIntegra Miltex33-31AA-P/25
100 mm シャーレSPL10100直径 100 mm 直径 15 mm 高さ
14 mm 中空パンチILJIN124-0571
18 mm ØカバーガラスMarienfeld-Superior111580円形 18 mm、厚さ No. 1 (0.13 から 0.16 mm)
2% ビスアクリルアミド溶液バイオ・ラッド1610142保護手袋、衣服、目の保護具を着用してください。
3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート(TMSPMA)Sigma-Aldrich440159-500ML
3ウェイストップコックHyupsungHS-T-61N注意:以前に開封した場合は使用しないでください。
30cmの最小容量ラインを再HyupsungHS-MV-30注意:以前に開封した場合は使用しないでください。
35 mm細胞培養ディッシュを再
430165 40% アクリルアミド溶液バイオ・ラッド1610140保護手袋、衣服、目の保護具を着用してください。
75 cm最小ボリュームライン(小児用)HyupsungHS-MV-75注意:以前に開封した場合は使用しないでください。 酢酸を再滅菌または再使用しないでください
J.T.ベーカーJT9508-03
過硫酸アンモニウム(APS)バイオ・ラッド1610700
抗生物質-抗真菌剤Gibco15240-062
底面ガラスチップMicroFIT24 x 24 x 1 mm、カスタムメイド、長方形の溝(6 x 12 mm、深さ:100 μm)
コラーゲンI型、ラットテールコーニング354236
カスタムガラスホルダーハンググメカトロニクスカスタムメイド
ダルベッコ モディファイド イーグルス ミディアム (DMEM)ウェルジーンLM 001-11
ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)バイオウエストL0615-500マグネシウム、カルシウム
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco26140-179
FluoSpheres アミン修飾マイクロスフェアInvitrogenF87640.2 µm, 黄緑色蛍光(505/515)
肝細胞増殖因子 (HGF)Sigma-AldrichH1404-5UG組換え、ヒト
JuLI ステージ ライブセルイメージングシステムNanoEnTek InAutomated X-Y-Z stage and fluorsent imaging インキュベーター互換 (37 °;Cおよび5%CO2)
Madin-Darby犬腎臓(MDCK)細胞II
型酸素プラズマシステムフェムトサイエンスCUTE-MPR
プルロニックF-127グマアルドリッチP2443-250G
ローダミンBイソチオシアネート–デキストランSigma-AldrichR9379-100MG70 kDa、マイクロ流体チャネル内のHGFの時空間分布を推定するために使用
滅菌皮下注射針 18 GKOVAX針の先端をトリミングし、90度曲げてボリュームラインでイン/アウトポートを接続
スティッキーテープ3M/スコッチ810D33 m x 19 mm
SU-8 マスターモールドMicroFIT4インチ直径、カスタムメイドの
スルホスクシンイミジル6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサン酸(スルホSANPAH)Thermo Scientific22589-20°Cで保管してください。
シルガード184エラストマーキットダウコーニングPDMS
シリンジポンプChemyx Inc.モデルフュージョン 720引き出し液
シリンジKOVAX1、3、5、10、または 50 cc 入口または出口シリンジポンプ
テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)バイオ・ラッド1610800保護手袋、衣服、目の保護具を着用してください。
紫外線(UV)ランプUVP LLC95-0248-02365 nm波長
滅菌または再使用しないでください(小児用)滅菌または再利用しないでください コーニングシ

参考文献

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