このプロトコルは、カエネラブディティスエレガンスの腸透過性を測定する方法を記述します。この方法は、腸内細菌とその宿主との相互作用に関連する腸の健康に関する基礎生物学的研究や、漏出性腸症候群および炎症性腸疾患を治癒するためのプロバイオティクスおよび化学薬品を同定するためのスクリーニングに役立ちます。
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この記事について
サマリー
要約
生体では、腸の透過性が多くの炎症性腸疾患(IBD)につながる深刻な症状です。カエノラブディティス・エレガンスは、寿命が短く、透明性、費用対効果、動物倫理の問題がないため、アッセイシステムとして広く使用されている非哺乳動物モデルです。本研究では、高スループット画像解析システムを用いたC.エレガンスの腸透過性に対する異なる細菌および3,3'-ジインドリルメタン(DIM)の影響を調べる方法を開発した。ワームは異なる腸内細菌に感染するか、DIMで48時間治療し、一晩フッ素セインイソチオシアネート(FITC)-デキストランを供給した。次いで、虫体内部の蛍光画像と蛍光強度を比較して腸透過性を調べた。この方法はまた、動物モデルの腸透過性に影響を与えるプロバイオティクスおよび病原性腸細菌を同定する可能性があり、腸の透過性および腸の健康に有害または健康増進化学物質の影響を調べるのに有効である。しかし、このプロトコルはまた、この方法は主にフェトチピック決定に使用されるため、特に病気を制御するために変更される遺伝子を決定するために、遺伝的レベルでいくつかのかなりの制限を有する。さらに、この方法は、どの病原性基質が炎症を引き起こすか、感染中にワームの腸の透過性を高めるかを正確に決定することに限定される。そこで、変異型細菌や線虫を用いた分子遺伝機構の調査や細菌の化学成分分析など、さらに詳細な研究が必要であり、腸透過性を決定する上で細菌や化学物質の機能を十分に評価することが求められている。
概要
腸透過性は、腸内微生物叢および粘膜免疫に関連する主要な障壁の1つと考えられており、腸内微生物叢修飾、上皮障害、または粘液層変化1などのいくつかの要因によって影響を受ける可能性がある。最近の論文では、腸細胞層2全体の蛍光フラックス率を分析して培養したヒト腸細胞の腸透過性を測定する有効なプロトコルが報告されているが、FITC-dextran染色を用いて、特にC.エレガンスにおいて線虫の腸透過率を測定するのに適した手順を提示する研究論文は少ない。
ナイル赤3とエリオグラウシン二ナトリウム(またはスマーフアッセイ)4、5を用いてC.エレガンスにおける腸透過性を測定するための代表的なプロトコルが2つあります。このプロトコルでは、ナイル赤(MW = 318.37)およびエリオグラウシン二ナトリウム(MW = 792.85)よりもはるかに高い分子量を有するFITC-dextran(平均分子量10,000)を使用しました。FITC-デキストランは、ナイル赤やエリオグラシン二ナトリウム染料よりも、腸層を通して吸収される炭水化物などの実際の高分子栄養素に似ています。エリオグラウシン二ナトリウム(青スマー....
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プロトコル
1. P.アルギノーサPAO1および大腸菌OP50培養の調製
- 500mLの殺菌ルリア・ベルタニ(LB)培地(表1)を調製し、P.エルギノーサの単一コロニーを培地に接種する。150 rpmの振とう速度で37°Cで14~15時間培養します。
- 細菌培養を2本の500mL遠心管に均等に分配し、30分間4°Cで3,220 x gでチューブを遠心分離します。
- 体積が50mL(初期体積の10分の1)になるまで上清を取り除き、細菌ペレットを再懸濁します。
- 濃縮した細菌培養物を4°Cで保存し、使用するまで保存する。P.エルギノーサ培養の貯蔵期間は最大1ヶ月ですが、新鮮な培養は腸の損傷を誘発するのに適しています。
注:プロトコルはここで一時停止できます。生菌全体に加えて、細菌培養の上清を用い、腸内細菌19の効果を試験することができる。 - 大腸菌OP50を調製するために、DYT培地(表1)で大腸菌OP50を培養し、上述したものと同様のステップを適用するが、ボリュームを元のボリュームの6分の1に減少させる。例えば、初期体積が500mLの場合、上清を除去した後、残りの体積は約83mL....
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結果
P.アルギノーサPAO1でインキュベーションした後、C.エレガンスは、他の2つの細菌株とインキュベーションした後に示された蛍光と比較して、ワーム体内におけるFITC-デキストラン蛍光の有意な増加を示した(図1)。大腸菌OP50、P.アルギノーサPAO1、およびE.ファカリスKCTC3206を供給したワームの蛍光強度は、それぞれ100.0±6.6、369.7±38.9、および105.6±10.6%であった。このデータは、P.エルギノーサが上皮腸関門により重要な損傷を引き起こしたことを強調し、従って、ワームは腸の透過性の劇的な増加を示した。この結果に基づいて、FITC-dextranは腸層を容易に貫通することができるので、P.エルギノーサはDIMの効果をスクリーニングするための潜在的な病原体として選ばれた。E.faecalisは、大腸上皮細胞DNA15に損傷を与える細胞外スーパーオキシドおよび.......
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ディスカッション
自動化された蛍光顕微鏡と定量画像分析を組み合わせたC.エレガンスにおける腸透過性を決定するこの新しい方法を利用することにより、腸内微生物または化学物質によって引き起こされる差異を、特にC.エレガンス腸で生体内で決定することができます。このプロトコルは、腸の透過性の調査に役立ち、その利便性と操作が容易なため、ストレス条件下での活性酸素種(ROS)決定や形態検査など、多くのタスクに適用できます。さらに、この方法は、C.エレガンスにおける複数の病原体に対する治療および予防方法の効果を決定するために使用することができる。特に、有害な細菌および有用な細菌の両方を含む異なる細菌株のメカニズムを調査するための効率的なプロトコルであり得る。類似した構造を有するいくつかの病原体およびプロバイオティクス細菌は、宿主33、34に異なる効果を発揮する。この手順は、細菌が利用しているメカニズムと、標的となる基質が細胞外または細胞内に分泌できる場所を評価する際に役立つ。さらに、この方法は、熱処理.......
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開示事項
著者たちは何も開示する必要はない。
謝辞
この研究は、韓国科学技術大学院大学の壁内研究助成金(2E29563)によって支援された。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3,3'-ジインドリルメタン | シグマ | D9568 | |
| 90回;15 mmシャーレ | SPLライフサイエンス、韓国 | 10090 | |
| 60×15 mm シャー | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| ホルムアルデヒド溶液 | シグマ | F1635 | |
| 脳心臓注入(BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| 線虫 N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | 野生型 | |
| コレステロール | Σ | C3045 | |
| コスタ アッセイ プレート、96 ウェル ブラック、透明平底 未処理、蓋なし ポリスチレン | コーニング | REF. 3631 | |
| ジメチルスルホキシ | ド | Σ D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | 韓国型文化コレクション | KCTC NO. 3206 | ファルキューティブ嫌気性 |
| 大腸菌 OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| フルオレセインイソチオシアネート - デキストラン | Sigma | FD10S | |
| Harmony ソフトウェア | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LBミディアム | メルク | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| マグネシウム七水和物 | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| フルオロマウント水性封入剤 | Sigma | F4680 | |
| オペレッタCLSハイコンテント解析システム | パーキンエルマー | ||
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Nadium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| 実体顕微鏡 | ニコン 日本 | SMZ800N | |
| 酵母抽出物 | Becton Dickinson | REF. 212750 |
参考文献
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189(2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J.
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再版と許可
