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方法論記事

3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク

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DOI:

10.3791/60434

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2019年12月13日

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

脱細胞細胞細胞細胞外マトリックス(dECM)は、工学的構造における標的組織の固有の機能を再現するための適切なマイクロ環境手掛かりを提供することができる。本稿では、膵組織の脱細胞化、膵臓組織由来dECMバイオインクの評価、バイオプリンティング技術を用いた3D膵臓組織構築物の生成に関するプロトコルを解明する。

要約

膵島の移植は、低血糖および二次合併症を伴う1型糖尿病に罹患した患者のための有望な治療法である。しかしながら、島の移植はまだ貧しい島の生着や敵対的な環境による移植された島の生存率の低さのようないくつかの制限を持っています。さらに、ヒト多能性幹細胞から分化したインスリン産生細胞は、血糖値を調節できる十分なホルモンを分泌する能力が限られている。そのため、適切なマイクロ環境的手掛かりを持つ細胞を培養して成熟を改善することは強く求められている。本稿では、膵島のグルコース感受性を高めることができる有益な微小環境を提供するために、膵組織由来の細胞外細胞外細胞外マトリックス(pdECM)バイオインクを調製するためのプロトコルを解明し、マイクロ押出ベースのバイオプリンティング技術を用いて3D膵臓組織構築物を生成するプロセス。

概要

近年、膵島移植は1型糖尿病患者に対する有望な治療法と考えられている。手順の相対的な安全性および最低の侵襲性は、この処置1の大きな利点である。しかし、島の孤立の成功率が低い、免疫抑制薬の副作用など、いくつかの制限があります。さらに、生着島の数は、敵対的な環境2に起因する移植後に着実に減少する。これらの困難を克服するために、アルギン酸塩、コラーゲン、ポリ(乳酸共グリコール酸)(PLGA)またはポリエチレングリコール(PEG)などの種々の生体適合性物質が膵島移植に適用されています。

3D細胞印刷技術は、その大きな可能性と高性能のために組織工学で出現しています。言うまでもなく、バイオインクは、適切な微小環境を提供し、印刷された組織構造における細胞プロセスの改善を可能にするための重要なコンポーネントとして知られています。フィブリン、アルギン酸塩、コラーゲンなどのせん断薄ヒドロゲルの相当数は、バイオインクスとして広く使用されています。しかしながら、これらの物質は、天然組織3における細胞外マトリックス(ECM)と比較して構造的、化学的、生物学的、および機械的複雑性の欠如を示す。小島とECMの相互作用などの微小環境上の手掛かりは、島の機能を高めるための重要なシグナルです。脱細胞化ECM(dECM)は、コラーゲン、グリコサミノグリカン(GAG)、および....

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プロトコル

豚膵臓組織は地元の食肉処理場から採取された。動物実験は、韓国ソウルのアサン医療センターの制度動物ケア利用委員会(IACUC)によって承認された。

1. 組織脱細胞化

  1. 脱細胞化のための溶液を準備します。
    注:すべての溶液調製物に使用される1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)は、10x PBSに蒸留水を添加して希釈する。
    1. 1% Triton-X 100溶液の場合、1x PBSの900 mLに100mLの100 mLを溶解し、磁気攪拌バーを使用して150 rpmで6時間攪拌しながら、1%Triton-X 100溶液の40mLを10%Triton-X 100溶液で40mLにし、16xの16xmL溶液を100mLで100mLにする。使用直前に準備された PBS。
      メモ:10%Triton-X 100溶液は、必要になるまで室温で保存することができます。
    2. 0.1%の過酢酸溶液の場合、8.5 mLの4.7mLの1酢酸を、使用直前の蒸留水368.7mLで70%エタノールの22.8 mLに希釈します。
  2. 膵臓の末梢組織を取り除き、脱細胞化する前に組織をスライスします。
    1. 切除した豚の膵臓を水道水で洗い、殺菌されたはさみを使って周辺組織を取り除きます。
    2. 鉗子が付いているビニール袋に膵臓を移し、次のステップのために膵臓を効果的に切断するのを助けるために1....

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結果

膵組織の脱細胞化
pdECMバイオインクを調製し、3Dバイオプリント組織構築物における膵島の機能を高めるための膵臓組織特異的微小環境を提供するプロセスを開発した(図2A)。脱細胞化プロセスの後、dsDNAの97.3%を除去し、コラーゲンおよびGAGなどの代表的なECM成分は、それぞれ天然の膵臓組織と比較して1278.1%および96.9%であった(図2B)。

バイオインク調製物
印刷プロセスでpdECMを適用するために、pdECM粉末をペプシンで弱酸で可溶化し、10M NaOH溶液を使用して中和した。消化されたpdECM溶液は、細胞培養培地または1x PBSと混合することによって希釈すること.......

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ディスカッション

このプロトコルは、pdECMバイオインクの開発と3D細胞印刷技術を用いた3D膵臓組織構築物の製造について説明した。3D工学組織構築物中の標的組織の微小環境を再現するには、バイオインクの選択が重要である。以前の研究では、組織特異的dECMバイオインクが幹細胞分化および増殖10を促進するのに有益であることを検証した。合成ポリマーと比較して、dECMは、組織特異的な組成およびアーキテクチャ11のために細胞有利な環境として機能することができる。したがって、脱細胞化プロセスは、dECM中の主要成分の高い保持のために真剣に考慮されるべきである。

膵組織の脱細胞化のための異なる洗剤の選択は、残留ECM構成成分12を変化させる。脱細胞化の過程で、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の使用がECMタンパク質13の損失に影響を及ぼす可能性があることに気づいた。したがって、トリオン-X 100、または3-[(3-コリン.......

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謝辞

この研究は、韓国政府(MSIT)が出資する国立研究財団(NRF)の生物・医療技術開発プログラム(2017M3A9C6032067)と「ICTコンシレンス・クリエイティブ・プログラム」(IITP-2019-2011-1-00783)によって支援されました。IITP(情報通信技術企画評価研究所)が監修。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
生物学的安全キャビネットCRYSTEPURICUBE 1200
ディープフリーザーThermo Scientific Forma957
デジタルオービタルシェーカーDAIHAN ScientificDH.
ドライオーブンダイハン・サイエンティフィックWON-155
凍結乾燥機ラブコンコ7670540
冷蔵庫三星CRFD-1141
おろし金ABM1415605793
倒立顕微鏡ライカDMi1
微量遠心機クライステプリスピン 17R
マイクロプレートリーダーサーモフィッシャーサイエンティフィックムルチスカン GO
ミニ遠心分離機ダイハンサイエンティフィックCF-5
マルチホットプレートスターラーダイハンサイエンティフィックSMHS-6
ナノドロップサーモフィッシャーサイエンティフィックND-LITE-PR
pHベンチトップメーターサーモフィッシャーサイエンティフィックSTARA2110
レオメーターTA機器ディスカバリー HR-2
ボルテックスミキサーダイハンサイエンティフィックVM-10
<ストロング>シラジカル インスツルメンツ
手術ハサミヒロセHC.13-122
フォーセプコリア エース サイエンティフィックHC.203-30
<ストロング>素材
1.7 mLマイクロ遠心チューブAxygenMCT-175-C
10 mlガラスバイアルScilabSL。VI1243
40 µm細胞ストレーナーFalcon352340
5 L ビーカーDong Sung ScienceSDS 2400
50 mL コーニカルチューブFalcon352070
500 mL ビーカーKorea Ace ScientificKA.23-08
500 mL ボトルトップ真空フィルターCorning431118
500 mL プラスチック容器LOCK&LOCKINL301
96well plateFalcon353072
アルミ箔大京
KimwipeKimtech
磁気バーKorea Ace ScientificBA.37110-0003
乳鉢と乳棒DAIHAN ScientificSC.MG100
マルチチャンネルピペッターエッペンドルフ4982000314
ペトリ皿SPL10100
pH インジケーターストリップSigma-Aldrich1095350001
Sieve フィルターメッシュDAIHAN Scientific
Decellularization
10x pbsハイクロンSH30258.01
4.7% 過酢酸オメガファーム
70% エタノールサムチュン ケミカルE0220 SAM
蒸留水
IPAサムチュン ケミカルサムチュン I0348
トリトン-X 100バイオセサンT1020
Biochemical assay
1,9-ジメチルメチレンブルー塩化亜鉛二重塩Sigma-Aldrich341088
10 N NaOHBiosesangS2018
クロラミン TSigma-Aldrich857319
コンドロイチン硫酸 ASigma-AldrichC4384
クエン酸Supelco46933
システイン-HClSigma-AldrichC1276
氷酢酸メロック100063
グリシンSigma-Aldrich410225
HClSigma-AldrichH1758
Na2-EDTASigma-AldrichE5134
NaClSAMCHUN CHEMICALSS2097
パパインSigma-Aldrichp4762
P-DABSigma-AldrichD2004
過塩素酸Sigma-Aldrich311421
酢酸ナトリウムSigma-AldrichS5636
水酸化ナトリウムSupelcoSX0607N
リン酸ナトリウム(一塩基性)Sigma-AldrichRDD007
トルエンSigma-Aldrich244511
Bioink
Charicterized FBSHycloneSH30084.03
ペニシリン-ストレプトマイシンサーモフィッシャーサイエンティフィ15140122
PepsinSigma-AldrichP7215
Rose bengalSigma-Aldrich198250
RPMI-1640 中型サーモフィッシャーサイエンティフィック11875093
トリパンブルー溶液Sigma-AldrichT8154
WSO04010ズ ズ ック

参考文献

  1. Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268(2017).
  2. Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeu....

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再版と許可

タグ

膵臓組織由来ECM脱細胞化細胞外マトリックスバイオインク調製3Dバイオプリンティング技術膵島封入組織特異的組成押出成形プリントレオロジー特性評価ゾル-ゲル転移グルコース応答性評価