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方法論記事

緑膿菌の小コロニー変異体の培養とアルギン酸の定量

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DOI:

10.3791/60466

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2020年2月22日

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University, 2Progenesis Technologies LLC, Robert C. Byrd Biotechnology Science Center, 3Department of Pediatrics, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここで、緑膿菌の小コロニー変異体を培養する成長条件について説明する。また、従来のウロン酸カルバゾールアッセイとアルギン酸特異的モノクローナル抗体(mAb)ベースのELISAを用いて、P.アルギノーサが産生するエキソ多糖アルギン酸塩の検出と定量の2つの方法についても説明する。

要約

日和見グラム陰性細菌病原体である緑膿菌は、無菌性アルギン酸を過剰産生し、粘性イチと呼ばれる独特の表現型を生じさせる。アルギン酸は、嚢胞性線維症(CF)患者の予後不良をもたらす慢性肺感染症に関連している。アルギン酸の産生を調節する経路を理解することは、アルギン酸形成を標的とする新しい治療戦略の開発に役立つ可能性がある。もう1つの疾患関連表現型は小コロニー変異体(SCV)である。SCVは、細菌の増殖が遅いため、しばしば抗菌薬に対する耐性の増加に関連しています。本論文では、まずピリミジン生合成変異による遺伝子的に定義された形態のP.エルギノーザSCVを培養する方法を示す。窒素塩基、ウラシルまたはシトシンの補充は、これらの突然変異体に正常な成長を戻し、環境から遊離塩基を清掃するサルベージ経路の存在を実証する。次に、細菌性アルギン酸の測定方法を2つ検討する。第1の方法は、そのウロン酸モノマーに多糖類の加水分解に依存し、続いて発色試薬、カルバゾールによる誘導体化を行い、第2の方法は市販のアルギン酸特異的mAbに基づくELISAを使用する。どちらの方法でも、定量に標準曲線が必要です。また、免疫学的方法はアルギン酸定量に特異的であり、臨床検体におけるアルギン酸塩の測定に使用することができることも示した。

概要

緑膿菌による慢性肺感染症は、嚢胞性線維症(CF)患者における罹患率および死亡率の主な原因である。幼児期には、患者はP.エルギノーサ1、2の非粘性分離株を含む複数の細菌病原体によって植民地化される。小コロニー変異体(SCV)分離株の出現は、ムコイド分離株と同様に、慢性感染症への発症のマーカーである。SCV分離株は、その遅い成長率4のために非常に薬剤耐性3であり、P.アルギノーサによる治療連隊および他の慢性感染症5で重度の抑止力を与える。Al Ahmar et al.6の研究は、デノボピリミジン生合成によって連結されたSCVとムコイドとの間のリンクを示した。ピリミジン飢餓は、ピリミジン産生に関与する遺伝子の変異に起因して、非粘性体参照株PAO1および粘液誘導体PAO581(PAO1mucA25)におけるSCV表現型をもたらした。

CFにおける慢性肺感染症の重要な疾患マーカーであるアルギン酸過剰産生が重要な疾患マーカーであるにもかかわらず、アルギン酸の量と肺病理との間に直接的な相関関係があるかどうかは明らかではなく、また、アルギン酸塩を治療7の予後マーカーとして用いることができるかどうかは不明である。アルギン酸産生は主に2つのオペロンによって調節され、調節性オペロン(algUmucABCD)8、9および生合成オペロン(algDオペロン)10、11。アルギン酸産生は、シグマ因子AlgU9、12(別名AlgT)および抗シグマ因子MucA13の分解によって厳しく調節される。患者の痰標本からのその中のアルギン酸塩の産生を監視する能力は、新しい治療オプションの開発に役立つ可能性があります。

ここで、ピリミジン・デ・ノボを合成できない変異体によって引き起こされるSCVの存在を検出する増殖条件を説明する。ウラシルおよび/またはシトシンの補充は、ピリミジンヌクレオチドの窒素塩基を、培地に対して、サルベージ経路を活性化し、したがって突然変異体における正常な増殖を回復させる。この特定のSCV変異体の増殖方法は、患者試料中のピリミジン変異を同定するスクリーニング方法として用いることができる。また、P. eeruginosaによって生成され分泌されるアルギン酸塩の検出と測定の2つの方法について議論する。最初は、高濃度の酸を用いて多糖類を分解し、次いで、サンプル中の濃度を定量するために測色指標を加える従来の方法14、15、16である。2つ目の方法は、当社の研究室で開発された、QEDバイオサイエンスが開発した抗アルギン酸モノクローナル抗体(mAb)を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を利用しています。ELISA法は、ウロン酸アッセイよりも特異的で感度が高く、高濃度硫酸の回避により、より安全な使用を可能にします。ELISAの能力を、患者痰サンプルに直接使用してアルギン酸を測定し、感染の異なる期間に肺に存在するアルギネートの量に従うモニタリング診断ツールとして開発することができる。

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プロトコル

1. SCVの成長条件とサルベージ経路の生理的活性化

  1. SCV の検出。
    1. P.エルギノーサ株株PAO1、PAO1Δ pyrD、PAO581、PAO581、PAO581ΔpyrDをプレウォームドシュードモナス分離寒天(PIA)プレート上にストリークし、37°Cで48時間成長する。成長プレート上で、SCV表現型(通常の3〜5mmのコロニーサイズとは対照的に1〜3mmのコロニーサイズ)を有する単一コロニー分離物を特定する。
    2. 手順 1.1.1 を繰り返して、SCV の純粋な分離を取得します。
      注:SCVコロニーの成長速度が遅いため、成長には最大72時間かかることがあります。
  2. サルベージ経路の生理的活性化
    1. 無菌接種ループを使用して、PIAプレートからSCVコロニーを選び、ウラシルの0.1 mMを補充したプレウォームPIA上のストリークを選びます。プレートを37 °Cで24-48時間成長させます。
      注:このプロトコルで使用されるすべてのPIAプレートは、オートクレーブ化前に混合物に添加されたグリセロールの20 mL /Lが含まれています。オートクレーブ後および混合温度が55°C未満の後、プレートを流す前に液体培地に11.21mg/Lのウラシル(0.1 mM)を加えます。この方法は、P. eeruginosaでSCV表現型を引き起こすピリミジン突然変異を同定するのに役立ちます。SCV表現型が上記の突然変異の結果である場合、正常コロニーの成長およびサイズ(3−5mm)はウラシル補充されたPIAプレート上で観察されるであろう。株はアルギン酸を生成する能力を持っていた場合, 粘膜フェノ型もウラシル補充時に戻ります.

2. ウロン酸カルバゾールアッセイ

  1. 試験される所望の株の純粋な培養物から、単一コロニーを同定する。滅菌用の爪楊枝を使用して、コロニーを摘み取り、5 mLのシュードモナス分離ブロス(PIB)を含む培養試験管に爪楊枝を入れる。37 °Cで24時間シェーカーインキュベーターで成長します。
    注:PAO581(PAO1mucA25)、PAO581carA、PAO581 carB、PAO581の各カルブ、PAO581の各々の菌株を、測定用にアルギン酸を収穫するために、PIAプレートまたはPIAプレートを0.1mMウラシルで補って成長させた。
  2. 予め加えたPIAプレートに、150 μLの培養PIBスープ(15mm x 100mmプレート)または450μLのスープ(15mm x 150mmプレート)を加えます。滅菌セルスプレッダーを使用して、プレートの上にスープを広げます。プレートを37 °Cで24時間成長させます。
    注:プレートを片側に傾けることによって、ピペットを使用してプレートから余分な液体があれば吸引します。プロトコルで使用されるPIBおよびPIAプレートは、アルギン酸生産を助けるために細胞が炭素源として使用するグリセロールの20 mL/Lを含みます。
  3. ピペットコントローラと無菌50mLピペットを使用して、成長した芝生に0.85%NaClを加え、セルスプレッダーを使用してプレートをスクラップしてサンプルを収集します。50 mLの採取チューブに、新鮮な50mLピペットを使用してサンプルを吸引します。サンプルを高くボルテックスして、サンプルを混ぜて氷の上に置きます。
    注:添加される0.85%NaClの体積は、プレートのサイズによって異なります。15 mm x 100 mm プレートの場合は 10~30 mL、15 mm x 150 mm プレートは 20~50 mL を使用します。
  4. サンプルの600 nm(OD600)で光学密度を測定するには、サンプルの1 mLを使い捨て型キュベットに加え、分光光度計を使用してODを読み取ります。このステップ 2x を繰り返して、各サンプルの 3 倍の読み取りを取得します。
  5. 3 mLの硫酸/ホウ酸塩溶液を培養管に入れ、氷の上に座らせます。収集したサンプルの350μLを試験管の酸ミックスにゆっくりと加え、低い上に少し低くします。
    1. 水酸化カリウム(KOH)粉末を45mLに加えてホウ酸塩のストックを準備します。混合物に24.74 gのホウ酸(H3BO3)を加え、体積を100mLにします。
    2. 1 Lボトルを氷でシンクに入れ、500 mLの濃硫酸でボトルを満たします。準備したホウ酸塩ストックの15 mLをゆっくりと加えます。ボトルを冷やします。
    3. さらに10 mLのホウ酸塩ストックを合計25mL追加します。ボトルが冷めたら、ボリュームを1 Lにします。
      注意: この方法は、高濃度硫酸の使用に依存しています。サンプルの安全と適切な廃棄プロトコルを確保するために適切な個人用保護具を使用する必要があります。
      注:正の制御のためにD-マンヌロン酸および/またはP.エルギノーサのアルギン酸産生株を通して収穫し、精製された既知の細菌アルギン酸サンプル(例えば:PAO581-PAO1mucA25)。陰性制御の場合は、0.85% NaCl溶液および/またはPAO1ΔalgD(細菌を完全にアルギン酸を産生することができないalgD遺伝子のインフレーム欠失)を使用する。統計解析を支援するために、各サンプルから複数のチューブを作成して技術的な繰り返しの数を増やすことができます。各サンプルの3-5チューブを準備します。
  6. エタノール溶液に0.1%カルバゾールの100μLを酸/サンプルミックスに加える。チューブと渦を5sの媒体設定でキャップし、55°Cの乾燥したバスに30分間置きます。
  7. インキュベーション後、チューブと渦を一時的に高く取り外し、5分間冷却します。
    注: 表示される色は、紫色の色合いになります。色は1-2時間の測定のために安定したままである。
  8. クリーンキュベットに1 mLの混合物を加え、分光光度計で530nmでサンプルのODを読み取ることによって、各チューブのOD530を読み取ります。分光光度計にブランクとして0.85%NaClのチューブを使用してください。
  9. D-マンノロン酸の既知の濃度の連続希釈のOD530を測定することによって標準曲線を調製する(1,024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16g/mL、および8g/mL)。2xを繰り返します。これらの測定値から一次方程式を抽出します。
    注: 標準曲線は 1 回だけ実行する必要があります。そこから抽出された線形方程式は、後のテストに使用できます。
    1. 標準曲線を用いて各サンプル中のアルギン酸塩濃度を計算し、一次式からアルギン酸濃度をOD600で割り、OD600当たりのアルギン酸塩の総量を求める。

3. アルギン酸定量用 ELISA

  1. 手順 2.1-2.4 を繰り返して、アルギネート測定用のサンプルを取得します。
    注:使用された株はPAO1、PAO1ΔalgD、およびpHERD20T-algUを運ぶPAO1でした。
  2. マイクロピペットを使用して、収集されたサンプルの50 μLを未処理の96ウェルプレートに加える。50 μLのコーティングバッファー(炭酸塩/重炭酸塩バッファーpH 9.6)をウェルに加えます。プレートを37 °Cで2時間インキュベートします。
    注:陽性対照のために、D−マンヌロン酸および/または既知の安定アルギネート産生株(例えば:PAO581-PAO1mucA25)の既知の濃度を使用することができる。陰性制御の場合は、0.85% NaCl溶液および/またはPAO1ΔalgD(algD遺伝子のフレーム内欠失は、細菌がアルギン酸塩を産生することができないことを完全にレンダリングする)を使用する。 統計分析を支援するために、各サンプルから複数の井戸を作り、技術的な繰り返しの数を増やすことができます。各サンプルの3-5ウェルを準備します。
  3. ホヤボトルを使用して、プレートウェルを1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で0.05%Tween 20(PBS-T)で洗浄し、プレートをひっくり返して水切りします。
  4. マイクロピペットを使用して、200 μLのブロッキングバッファー(PBS-Tでは10%のスキムミルク)をウェルに加えます。一晩4°Cでインキュベート。
    注:パラフィンフィルムまたはシュリンクラップでプレートをラップし、冷蔵庫の蒸発を防ぐのに役立ちます。
  5. ホヤボトルを使用して、井戸を充填し、プレートをひっくり返すことによってそれらを排出することによって、PBS-Tでプレートウェル2xを洗います。
  6. マイクロピペットを使用して、希釈された一次抗体(マウス抗アルギン酸モノクローナル抗体)をウェルに100μL添加し、37°Cで1〜2時間インキュベートします。
    注:一次抗体(マウス抗アルギン酸モノクローナル抗体)は、抗体希釈液中の0.5μg/mL(1mg/mL株の1:2,000の希釈)の濃度で提供された(1x PBSで1%スキムミルク)。
  7. ホヤボトルを使用して、井戸を充填し、プレートをひっくり返すことによってそれらを排出することによって、PBS-Tでプレートウェル3xを洗います。
  8. マイクロピペットを使用して、希釈された二次抗体の100 μLをウェルに加え、37°Cで1〜2時間インキュベートします。
    注:2次抗体を使用した、抗マウス抗マウスポリHRP抗体を、0.25 μg/mLの濃度(0.5 mg/mL株の1:2,000の希釈)に対する抗体希釈液中に用いた。
  9. ホヤボトルを使用して、井戸を充填し、プレートをひっくり返すことによってそれらを排出することによって、PBS-Tでプレートウェル3xを洗います。
  10. マイクロピペットを使用して、100 μLのTMB-ELISA溶液(材料表)を加え、室温で暗闇の中で30分間インキュベートします。
    注: 正反応の色は、青の色合いになります。
  11. マイクロピペットを使用して、100 μLの停止溶液(2N硫酸)を加えます。
    注: ストップ ソリューションを追加すると、色が青から黄色に変わります。反応停止後、最大30分間安定した色です。
  12. プレートリーダーを使用して、450 nmのODを読み取ります。
  13. D-マンノロン酸(1,024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16g/mL、および 8g/mL)の既知の濃度の連続希釈のOD450を測定することにより、標準曲線を生成します。2xを繰り返します。これらの読み取り値から、線形方程式が抽出されます。
    注: 標準カーブは 1 回だけ実行する必要があります。そこから抽出された線形方程式は、後のテストに使用できます。
    1. 標準曲線を用いて各サンプル中のアルギン酸塩濃度を計算し、一次式からアルギン酸濃度をOD600で割り、OD600当たりのアルギン酸塩の総量を求める。

4. アルギン酸測定の統計解析

  1. グラフィカルソフトウェアシートで、標準曲線から導出された一次方程式を持つ列を設定します。y軸の結果をアルギン酸濃度とX軸結果をウロン酸アッセイ用OD530として設定し、ELISA用OD450として、各試料中のアルギン酸濃度を得る。
  2. 各サンプル中のアルギン酸量を5.5 x108 CFU/mL(1 OD600)当たりの量に正規化するには、上記の各サンプルの濃度をそれぞれのOD600値で除算します。各サンプルについて複数のOD600を測定した場合、平均OD600で除算する。
  3. 好ましい統計ソフトウェア(例えば、GraphPad Prism 7.02)を用いて統計解析を行う。
  4. ソフトウェアを開きます。[新規テーブルとグラフ] で[列] を選択し、一方向の分散分析データ セットを選択します。
  5. 各列にテスト済みのひずみで名前を付け、下にアルギン酸濃度を追加します。
  6. すべてのデータを入力した後、トップメニューの[分析]をクリックします。解析設定ウィンドウが開きます。テストに適したパラメーターを選択し、複数の比較を実行する必要があるかどうかを示します。
    注: 分析後、データ・セットには、データの統計的有意性を判別するのに役立つ p 値が含まれます。p値が設定されたα値よりも小さい場合、データは統計的に有意であると考えられます(通常α値はp < 0.01に設定されます)。
  7. グラフタブで、棒グラフタイプを選択します。これにより、入力データ シートから示されたタイトルのデータが自動的にグラフ化されます。必要に応じて、対象バー間の結合線の上に * 記号を示すことで、データの統計的有意性を示します。

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結果

図1は、PyrD遺伝子(ピリミジン生合成経路の遺伝子)中でフレーム内欠失の有無に関するPAO1およびPAO581のプレートを示す。このPAO1 SCV変異体は、ウラシル補給に応答して正常な成長に回復した(図1A、B)。さらに、PAO581ΔのsCV変異体は、同じウラシル処理で粘膜に戻されたが、親株PAO581はさらなるmucA25突然変異を有するため(図1C、D)。ウロン酸カルバゾールアッセイの結果を図26に示す。このデータは、PIAおよびPIAで増殖したピリミジン・デ・ノボ生合成を調節する遺伝子の変異を有するPAO581...

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ディスカッション

SCVおよびアルギン酸は、いずれもいくつかの慢性感染症に関与する重要な疾患マーカーである。したがって、SCVを成長させる能力だけでなく、P.エルギノーサによるアルギネートの調節と生産を研究することは、これらの慢性疾患に対する新しい治療法の発見に不可欠です。

SCV株は、その他のP.エルギノーサ株と比較して成長速度4が遅いために成長が難しいことで有名であり、それらはその抗菌性3を助ける。我々の研究は、デノボピリミジン生合成における突然変異の結果であるP.アルギノーサSCVの特定の形態を特定する。ここでは、ヌクレオシドウラシルが供給されたときにSCVが正常な成長表現型に戻るための成長条件について議論する。しかし、培地に UMP/UTP を追加した場合、欠陥のある成長は復元されませんでした (データは示されていません)。この選択性を担うポリンをさらに研究する必要があります。ウラシルを用いた成長培地の補充は、ピリミジン飢餓から誘発されるストレ...

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開示事項

著者のHongwei D. Yuは、プロジェネシス・テクノロジーズLLCの最高科学責任者兼共同創設者です。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所(NIH)助成金R44GM113545とP20GM103434によってサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1ステップウルトラTMB-ELISAThermo Scientific34028via Fisher Scientific
Absolute Ethanol (200 Proof)Fisher ScientificBP2818-4Molecular Bio-grade
Accu Block Digital Dry BathLabnetNC0205808via Fisher Scientific
Assay Plates 96-wellCoStar2021-12-20
Bench Top Vortex-Genie 2科学産業G560
ホウ酸研究製品インターナショナル株式会社10043-35-3
キャビネット インキュベーターVWR1540
カルバゾールシグマC-5132
炭酸塩-重炭酸バッファーシグマC3041
遠心分離管 (50 mL)フィッシャー サイエンティフィ05-539-13フィッシャー サイエンティフィ
カルチャー テスト チューブフィッシャー サイエンティフィ14-956-6D経由サイエンティフィック
キュベットポリスチレン(1.5 mL)フィッシャーサイエンティフィ14955127ッシャーサイエン
シトシンクロスオーガニックス71-30-7
Diposable Vaccination Loopsフィッシャーサイエンティフィック22-363-597
D-マンヌロン酸ナトリウムグマアルドリッチSMB00280
FMCアルギン酸塩FMC2133
グリセロールフィッシャーサイエンティフィBP906-5分子生物学マウス
抗アルギン酸モノクローナル抗体QEDバイオサイエンス/ Aロット#:15725/15726
リン酸塩緩衝生理食塩水粉末(PBS)シグマP3813
ピアスヤギ抗マウスPoly-HRP抗体サーモサイエンティフィック32230フィッシャーサイエンティフィック
経由水酸化カリウムFisher Scientific1310-58-3via Fisher Scientific
Prism 7GraphPad
Pseudomonas Isolation Agar (PIA)Difco292710via Fisher Scientific
<>Pseudomon Isolation Broth (PIB)Alpha BiosciencesP16-115via Fisher Scientific
Round Toothpicksダイヤモンド任意のブランド
海藻アルギン酸塩 (Protanal CR 8133)FMC Corporation
Skim MilkDifco232100via Fisher Scientific
SmartSpec Plus SpectrophotometerBioRad170-2525or preferred vendor
塩化ナトリウム (NaCl)SigmaS-5886
SpectraMax i3x マルチモード マイクロプレート リーダー分子デバイスi3xまたは優先ベンダー
滅菌ペトリ皿 100 mm x 15 mmフィッシャーサイエンティフィFB0875713via フィッシャーサイエンティ
硫酸ッシャーサイエンティフィA298-212テクニカルグレード
硫酸 (2 ノーマルストップソリューション)R&DシステムズDY994
イーン20シグマP2287
ウラシルアクロスオーガニックス66-22-8
ック ック ック ックフィティフィックアシックN ック フィック フィック トゥ

参考文献

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