クリアされた心臓3次元イメージングによる標的細胞集団の心臓損傷応答のキャプチャ

サマリー

心筋細胞増殖後の傷害は、非筋細胞集団からの細胞外の手がかりの交響を必要とする動的プロセスである。系統トレース、パッシブクラリティ、3次元全型共焦点顕微鏡技術を利用して、様々な細胞タイプが心臓修復および再生に及ぼす影響を分析することができます。

要約

心血管疾患は、他のすべての死因を上回り、世界中の死亡率の驚異的な31%を占めています。この疾患は、主に急性心筋梗塞の形で、心臓傷害に現れる。傷害後の回復力がほとんどなく、かつて健康な心臓組織は繊維状の非収縮性瘢痕組織に置き換えられ、しばしば心不全の前兆となる。再生医療における新しい治療法の選択肢を特定するために、研究は生来の再生能力を持つ脊椎動物に焦点を当てています。そのようなモデル生物の1つは新生児マウスであり、強い心筋再生で心臓損傷に反応する。臨床的に関連する新生児マウスの傷害を誘発するために、我々は、ヒト心臓のアテローム性動脈硬化症によって引き起こされる心筋梗塞を反映して、左前下降動脈(LAD)を閉塞させる手術を開発した。心筋細胞と非筋細胞集団の両方の変化を追跡する技術と一致すると、このモデルは心臓再生を導くメカニズムを特定するプラットフォームを提供します。傷害後の心臓細胞集団の変化に関する洞察を得ることは、かつて組織切片や組織学的検査などの方法に大きく依存していました。さらに、これらの方法は、細胞系の変化を追跡する能力を欠き、代わりに傷害応答のスナップショットを提供するだけである。系統追跡モデル、全臓器のクリアリング、3次元(3D)全実装顕微鏡の技術的に高度な方法を用いて、心臓修復のメカニズムを解明する方法を説明する。新生児マウス心筋梗塞手術、組織クリアリング、3D全臓器イメージングのプロトコルにより、心筋細胞増殖を誘導する複雑な経路が解明され、心臓再生のための新しい治療標的が明らかになりました。

概要

心臓は長い間、マイトアティック後の器官であると考えられてきましたが、最近の証拠は、心筋細胞の再生^が成人の人間の心臓で1年に約1%で起こることを示しています。しかし、これらの低い心筋細胞の回転率は、傷害後に起こる組織の大規模な損失を補充するには不十分である。心筋梗塞に苦しんでいる心臓は約10億個の心筋細胞を失い、しばしば心不全と突然の心臓死の前兆として^22,33を果たします。世界中で2,600万人以上の人々が心不全の影響を受けているので、心臓病⁴によって引き起こされた損害を取り消すことができる治療のための満たされていない必要性があります。

治療におけるこのギャップを埋めるために、科学者たちは、傷害後の内因性再生の根源である進化的に保存されたメカニズムの調査を開始しました。哺乳類の心臓再生を研究するための1つのモデルは、新生児マウスである。生後1週間以内に、新生児マウスは心臓損傷⁵に続く強い再生応答を有する。我々は以前、新生児マウスが心尖^部切除5に続く心筋細胞増殖を介して心臓を再生できることを実証した。この技術は新生児の心臓再生を呼び起こす可能性があるが、手術は人間の心臓傷害との臨床的関連性を欠いている。新生児マウスモデルにおける人的傷害を模倣するために、冠状動脈閉塞6を通して心筋梗塞を誘発する技術を^{開発した。}この技術は、左心室心筋^6,7に血液の40%〜50%を送達する役割を果たす左前下降下動脈(LAD)の外科的結紮^{を必要とする7}。したがって、手術は左心室壁のかなりの部分に影響を与える梗塞をもたらす。心筋へのこの損傷は、新生児における心筋細胞増殖および心臓再生を刺激する^5.

冠状動脈閉塞手術は、心臓再生の内部の働きを明らかにするために、非常に再現性の高い、直接翻訳方法を提供します。新生児手術は、ヒト心臓における冠動脈アテローム性動脈硬化症と平行して、動脈の内壁内にプラークが蓄積すると閉塞とその後の心筋梗塞8を引き起こす可能性^がある。心不全患者の治療治療の空隙のために、LADの閉塞は傷害⁹後1年以内に最大26%に達する死亡率に関連しており、その結果、「未亡人メーカー」と呼ばれています。治療の進歩には、心臓損傷の複雑な生理学的および病理学的影響を正確に反映するモデルが必要です。新生児マウス心臓損傷のための当社の外科プロトコルは、研究者が損傷後に哺乳類の心臓再生を知らせる分子および細胞の手がかりを調査することを可能にするプラットフォームを提供します。

最近の研究では、細胞外環境と増殖型心筋細胞との動的関係が明示されています。例えば、心部¹⁰を取り巻く細胞外マトリックスの剛性を減少させることにより、出生後回生期の窓を延長することができる。新生児細胞外マトリックスからの生体材料はまた、心臓損傷¹¹に続く成人哺乳類の心臓における心臓再生を促進することができる。また、心筋細胞増殖に伴う血管形成応答^12,13;12,新生児マウスの再生心臓に特有の副動脈形成は、心臓再生¹²を刺激するために不可欠であることが示された。さらに、我々の研究室は神経シグナル伝達が成長因子レベルの変調を介して心筋細胞増殖および心臓再生を調節することを実証^した。これらの知見は、心臓損傷に応答して非筋細胞集団を追跡する必要性を強調している。この目的を達成するために、トランスジェニックマウスラインにおけるCre-lox組換えシステムを利用して、系統トレースのための蛍光レポータータンパク質の構成的または条件的な発現を組み込んでいます。さらに、高度な方法を用いて、Cre依存型の多色蛍光レポーターの確率的発現に依存するレインボーマウスラインを用いてクローン拡張パターンを決定し、標的細胞集団¹⁵のクローン拡張を決定することができる。新生児冠動脈閉塞手術で系統トレースを採用することは、心臓再生の複雑な細胞機構を解剖するための強力なツールです。

3次元(3D)の臓器全画像を用いて蛍光標識細胞の系統を追跡することは、特に神経線維や血管などの細胞集団が壊れやすい場合に、従来の断面化と再構成技術を用いて達成することは困難である。光学断面による臓器の直接全実装イメージングは表面的な細胞集団を捕捉することができるが、組織の奥深くに存在する構造はアクセスできないままである。これらの障壁を回避するために、組織クリア技術は、臓器組織全体の不透明度を低減するために開発されています。近年、脂質抽出¹⁶を介して固定組織をクリアする透明脂質交換アクリルアミドハイブリジッドリジッドイメージング適合組織hYdrogel(CLARITY)ベースの方法に大きな進歩がなされている。また、屈折率を均質化し、その後、撮像しながら光散乱を低減するステップも取^られる。そのような方法の1つは活性なCLARITYであり、電気泳動を用いて組織¹⁸全体に洗浄剤を浸透させることによって脂質分解を促進する。効果的であるが、この組織の清算方法は高価な機器を必要とし、組織損傷を引き起こす可能性があり、心臓神経¹⁹のような脆弱な細胞集団との相容れないアプローチを作る。したがって、我々は穏やかに洗剤の浸透を促進するために熱に依存する受動的なCLARITYアプローチを採用し、したがって、複雑な細胞構造^20、21,21の保持を支援する。

受動クラリティは、通常、アクティブなCLARITY¹⁸よりも効率が悪いと考えられていますが、この技術には、臓器の深さ全体をクリアできないことと、成人組織をクリアするために必要な膨大な時間という2つの大きな障害がしばしば伴います。私たちの受動的なCLARITYアプローチは、新生児および成人心臓組織を完全にクリアすることができる迅速な清算プロセスでこれらの障壁の両方を克服する。当社の受動的なCLARITY組織クリアリング技術は、成人心臓全体に分布する稀な集団を含む様々な心臓細胞集団の可視化を可能にする効率に達した。クリアされた心臓を共焦点顕微鏡で画像化すると、発達中、疾患、再生中の細胞特異的パターニングのアーキテクチャを照らすことができます。

プロトコル

実験はすべて、実験動物の使用とケアのためのガイドに従って、ウィスコンシン大学マディソン校医学公衆衛生学部の施設動物のケアと使用委員会に従って行われました。すべての方法は、野生型C57BL/ 6J(B6)およびジャクソン研究所から得られたトランスジェニックマウスラインで行われました。

1. 1日齢の新生児マウスにおける左前前下方動脈(LAD)の結紮により誘発された冠動脈閉塞(心筋梗塞)⁶

1. 1日齢の新生児の子犬を母親から分離し、元のネスティング材料と一緒にきれいなケージに入れます。
2. ケージの半分を中火に設定した加熱パッドに置きます。子犬はケージの非加熱側に残り、手術後に加熱された側に置かれるだけです。
3. 手術顕微鏡の下で生殖不能の外科区域を作成しなさい。滅菌された外科装置を集める(表1)。
4. 低体温症を介して子犬を麻酔する:氷との直接の皮膚接触を避けるためにガーゼで子犬を包み、約3〜4分間氷床に埋める。しかし、新生児は低体温症を十分に許容し、低体温症への長期暴露は凍傷とその後の死亡率をもたらす可能性がある。
5. 麻酔をしたら、マウスをスピーヌ位置の外科領域に置き、腕と脚をテープで固定します。消毒液でマウスの手術領域を殺菌します。
6. 下胸部領域を見つけ、小さな解剖ハサミで皮膚に横断切開を行います。肋骨の外科的ビューを広げるには、ドレッシング鉗子で皮膚を穏やかに持ち上げて筋肉から皮膚を分離し、閉じた位置の小さなはさみで肋間筋にそっと押し付けます。
7. 第4肋間空間(図1A)を見つけ、鋭利な鉗子を使って小さく表面的な穿刺を行い、内臓を穿刺しないように注意する。ドレッシング鉗子で肋間筋の間の領域を広げることによって鈍い解剖を行う。切開の適切な解剖学的位置決めは、心臓への適切なアクセスに不可欠である。
8. 指を置き、ドレッシング鉗子で開いた肋間空間を保持しながら腹部の左側に圧力を加えることによって、胸腔から心臓をそっと導く(図1B)。心臓が胸の外に出たら、ドレッシング鉗子を取り除き、圧力を和らげ、心臓が肋間筋の上で休むことを可能にする。
9. LAD を、血のプールが少なく、正しい解剖学的位置にある心臓の領域として見つけます(図1C)。LADは、心臓が手術を開始してから数分以内にアクセスされた場合にのみ顕微鏡下で見ることができます。
10. LADを6-0縫合で縫合することによりLADライゲーションを行う(図1D)。四角い結び目を2回結んで心筋梗塞を誘発する(図1E)。心筋への縫合の深さはさまざまですが、LAD結紮の適切な解剖学的位置決めは再現性にとって非常に重要です。LADを結ぶとき、縫合糸はLADを切断しないようにしっかりと引っ張られるべきである。心臓の頂点でのブランチングは、すぐに見られます (図 1E)
11. 心臓が胸腔に戻って滑るようにします。このプロセスは、ドレッシング鉗子で穏やかに促進することができる。肋骨を外科医の結び目と一緒に縫合し、続いて正方形の結び目を縫い合わせると、鈍い鉗子を使用して肋骨の上のセットを持ち上げ、肋骨の上下のセットを通して6-0の縫合糸を通過する。
12. 子犬の後ろ足を固定するために使用されたテープを取り外します。
13. 上部腹部に少量の皮膚接着剤を置くことによって、皮膚を一緒に接着します。次に、下腹部の皮膚を細かい鉗子でつかみ、露出した胸部領域を覆う。これは、母親による拒絶とカニバリズムの可能性を高めることができるので、子犬に残っている余分な接着剤の量を制限します。
14. すぐに中熱に設定された加熱パッドに子犬を置くことによって麻酔からの回復を容易にします。定期的に体のすべての部分を均等に暖かくするために新生児の配置を切り替えます。
15. 新生児が10〜15分間加熱パッドに直接残るようにします。通常、動きは熱に置かれる5分以内に取り戻されます。
16. 残りの血液を洗浄し、アルコール拭きで接着します。
17. 元のケージから寝具で全身をこすることによって新生児に異物の香りをカバーします。他の手術が行われている間、加熱された側のケージに子犬を置きます。
18. すべての手術が完了し、子犬が暖かく移動したら、元の入れ子材料と一緒にゴミを母親のケージに移します。
19. 手術後30~60分間マウスを監視し、母親が巣やグルーミングを行って子犬を受け入れるのを見守ります。
20. 手術後の朝、マウスを確認してください。母親が苦しんでいて、子犬を巣化していない場合は、子犬のための里親を検討してください。

2. パッシブクラリティ^21,22,2322でマウスの心臓^を23クリア²¹

1. イオブルランでマウスを麻酔します。つま先ピンチを実行して、マウスが完全に鎮静されていることを確認します。
2. マウスを、スピーヌ位置の清潔な外科領域に置き、腕と脚をテープで固定します。
3. マウスのイオブルラン沈下を、鼻コーンを使用して心臓が抽出されるまで維持します。
4. シフォイドプロセスのすぐ下に毛皮を組織鉗子で保持して下胸部を開き、大きな解剖ハサミを使用して胸部の幅にまたがる切開を行います。
5. 肋骨ケージの遠位部分と一緒に外科用はさみで切る。
6. 組織鉗子でxiphoidプロセスをつかんで横隔膜の筋肉を露出させる。湾曲した鉗子を使用してダイヤフラムを取り外します。
7. xiphoidプロセスの把握を維持しながら、鼓動心臓がアクセス可能になるまで組織をクラニヤ的に引っ張る。
8. 湾曲した鉗子で基部の心臓をつかみ、大大小と優れた静脈を虹色のはさみで切断することによって胸腔から心臓を解剖する。
9. 心臓がまだ鼓動している間、心臓が鼓動し続けるにつれて心臓が中の血液を送り出すように、PBSで満たされたペトリ皿に心臓を置きます。心筋梗塞は、縫合糸の配置がLAD結紮のための適切な解剖学的位置にあることを確認することによって確認することができる。
10. 心臓を鉗子で軽く絞り、心臓が残留血液を排出できるようにします。
11. 2 mLのPBSで使い捨ての2.5 mLガラスシェルバイアルにマウスの心臓を移します。シェーカーで心臓を室温(RT)で数回10分間インキュベートして、残留血液を洗い流します。PBSが明確になるまで、毎回PBS溶液を変更してください。
12. PBSを廃棄し、2 mLのコールド4%パラホルムアルデヒド(PFA)でバイアルを充填します。RTで4時間インキュベートする(図2A)。
13. インキュベーション後、2 mLのPBSでPFAとバイアルを捨てます。RTで10分間シェーカーで心臓を洗い、洗浄工程を2回繰り返し、毎回バイアルに新しいPBSを注入して充填し、余分なPFAを完全に洗い流します。
14. PBSを廃棄し、4%アクリルアミドと0.5%VA-044溶液の2 mLでバイアルを充填します。4°Cで一晩インキュベートする。
15. 翌日、37°Cのヒートブロックセットにバイアルを3時間移して重合を行う。
16. 心臓を新しいガラスシェルバイアルに移し、ステップ2.12(PBS洗浄サイクル)を繰り返します。
17. PBSを廃棄し、2 mLのクリアソリューション(表2)でバイアルを充填する。心臓がクリアされるまで37°Cでインキュベートする。ソリューションを変更し、2~3日ごとにフレッシュクリアリングソリューションを補充します。クリア処理には数週間かかる場合があります (図 2B-C)。
    注:P1心臓は通常3〜5日程度かかりますが、P21心臓はクリアソリューションインキュベーションが完了するまでに1ヶ月近くかかることがあります。
18. PBSを廃棄し、2 mLのPBSでバイアルを充填し、ステップ2.12(PBS洗浄サイクル)を繰り返します。新鮮なPBSでバイアルを補充し、37°Cで一晩インキュベートします。
19. 免疫染色を行う場合は、ステップ2.21~2.22をスキップし、免疫染色のセクション3に進みます。内因性蛍光のみに頼る場合は、ステップ2.21~2.22を進め、セクション3をスキップする。
20. PBS を破棄し、ソリューションを屈折インデックス一致ソリューション (RIMS) に変更します (表 3)。37°Cで一晩インキュベートする。
21. インキュベーション後、クリアされた組織はRTでRIMS溶液に保存することができます。組織は、室温で数週間リンキュベートされた後に透明になるはずです(図2D)。

3. オプション:マウス全粒の免疫染色染色

1. RIMS溶液からクリアした心臓を取り出し、PBSTの2 mL(0.1%トリトンX 100のPBS)できれいな2.5 mLガラスバイアルに入れます
2. RTで30分インキュベーションで軌道回転子でPBSTで心臓を3回洗浄します。
3. 2mLの2mLのブロッキングバッファー(PBSTで希釈)に心臓を浸漬し、RTで3時間回転してインキュベートする非特異的抗体結合をブロックし、4°Cに移して一晩回転して染色する。
   注意:ブロッキング緩衝液は、二次抗体が上昇した種に一致する正常な血清からなされる。
4. RTで5分間の回転でPBSTで心臓を3回洗浄します。
5. 心臓を一次抗体に浸し(PBSTで2%ブロッキングバッファーに希釈)、ガラスバイアルをアルミニウム箔で包むことで光の露出を防ぎます。RTで一晩回転してインキュベートします。
   注:この時点から、アルミ箔は、周囲光の露出から二次を保護するために継続的に使用する必要があります。
6. 4°Cでの回転で24時間インキュベートする。
7. 一次染色に続いて、ステップ3.2(長いPBST洗浄サイクル)を繰り返し、組織から非結合一次抗体を除去する。RTで回転して一晩インキュベーションで洗浄を延長します。
8. 二次抗体の光暴露を防ぐために限られた照明のある領域で働き、二次抗体に心臓を浸し(PBSTで2%ブロッキングバッファーに希釈)、RTで3時間回転してインキュベートし、4°Cに移して一晩回転して染色します。
9. 翌日、ステップ3.2(長いPBST洗浄サイクル)を繰り返して、結合していない二次抗体を除去する。
10. 溶液を2%ブロッキングバッファー(PBSTで希釈)に交換してください。RTで回転して一晩洗浄することにより、残留非結合抗体を除去する。
11. 翌日、過剰な二次抗体が共焦点顕微鏡を用いて除去されたことを確認する。必要に応じて洗浄を延長し、2%のブロッキングバッファ溶液を毎日交換します。非特定のセカンダリが存在しない場合は、一度だけ処理を行います。
12. 4°CのPBSで免疫染色された心臓を保管してください。
13. 全実装顕微鏡の直前に、37 °Cで一晩RIMS溶液中の心臓をインキュベートします。組織がまだ完全にクリアされていない場合は、インキュベーションをさらに24時間延長します。
14. 完全にクリアされ、免疫染色された心臓をRIMSにRTで保管してください。

4. クリアマウス心臓の単一光子共焦点顕微鏡イメージングによる非筋細胞集団の3D可視化

注: マウスの心臓が胚的に収穫された場合は、セクション 4.1 に進みます。出生後に収穫されたマウスの心臓については、セクション4.2に進みます。

1. クリアされた胚マウスの心臓をイメージングする
   1. 顕微鏡うつ病スライドにPBS溶液を充填します。
   2. 慎重に湾曲した鉗子でクリアされた心臓を拾い、スライドにティッシュを置く。
   3. スライドをガラスカバースリップで取り付けます。組織は、共焦点顕微鏡の下で画像化できるようになりました。
2. クリアされた出生後マウスの心臓をイメージングする
   1. うつ病スライドのチャンバーの半分をPBS溶液で満たします。大人のマウスの心臓に合うほどの大きさのチャンバーを作るために、3Dプリントポリプロピレンうつ病スライドをカスタムメイドした(図4)。
   2. 慎重に湾曲した鉗子でクリアされた心臓を拾い、チャンバーにティッシュを置く。チャンバーの残りの容積をPBSで満たします。
   3. 液体の表面がチャンバーの上部の上にドームを形成するようにPBSでチャンバーを充填します。カバースライドを取り付けます。組織は直立共焦点顕微鏡の下でイメージ化できるようになりました。

結果

多くの場合、2つの最も困難なステップは、胸腔から心臓を導き出し、LADを結び付けることです。これらの手順をトラブルシューティングするために、第 4 肋間筋肉間の最初の穿刺の配置に調整が加えられることがあります。穿刺と鈍い解剖が胸骨に近すぎると、心臓が胸腔から出ることができない場合があります(図1A)。

さらに、このプロセスを容易にするために左腹部への圧力の増加が必要になる場合があります(図1B)。合併症は、肋間筋で心臓を休ませる場合にも起こり得る。鈍い解剖が最小限のサイズに保たれ、主に水平方向に行われると、心臓は引き出すことなく空洞の外にとどまることがわかりました。この方向により、LAD (図 1C)への明確な視覚化とアクセス可能性も可能になります(

ディスカッション

心筋細胞と非筋細胞集団との細胞間相互作用は、心臓が線維症を受けるか、損傷後に修復するかの決定要因である。神経14、心外膜細胞^,24、腹膜マクロファージ^1425、動脈^12、13、リンパ管内皮細胞^26、およびリンパ管内皮細胞26を含む様々な細胞タイプが、すべて心臓修復を媒介する上で不可欠な役割を果たしていることを実証している。¹³これらの細胞系統および他の関心のある系統は、マウスにCre-loxおよびCRISPR-Cas9技術を適用することによって、開発、疾患、および再生中に遺伝的に追跡することができる。臓器の透明化および高度な顕微鏡法と組み合わせると、非筋細胞集団の寄与を正確に評価することができ、傷害後の心筋再生の細胞および分子標的を解明する扉を開く。

プロトコルの効率は、冠状動...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-チオグリセロール
6-0 プロレン縫合糸	Ethicon	8889H	ポリプロピレン縫合糸アクリル
アミド
ホウ酸
湾曲鉗子	エクセルタ	16-050-146	半湾曲、鋸歯状、4 in
ドレッシング鉗子	Fisherbrand	13-812-39	解剖、4.5インチ
ガラスバイアル	フィッシャーブランド	03-339-26A	12 x 35 mm バイアル、キャップ付き
Histodenz	Sigma-Aldrich		密度勾配中 虹
彩切除術用ハサミ	ファインサイエンスツール	15000-03	2 mm カッティングエッジ
大型解剖用ハサミ	フィッシャーブランド	08-951-20	ストレート、6インチ
ニードルホルダー	フィッシャーブランド	08-966	Mayo-Hegar、6 in
パラホルムアルデヒド
リン酸緩衝液
シャープ鉗子	Sigma-Adrich	Z168777	細い先端、ストレート、4.25 in
Small Dissecting Scissor	Walter Stern Inc	25870-002	30 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl硫酸塩(SDS)
組織鉗子	エクセルタ	16050133	中組織 1X2歯
VA-044	和光化学工業		水溶性アゾ開始剤