我々は、脂肪組織代謝表現型に寄与するマトリックスおよび脂肪細胞の役割の解剖を可能にする3Dヒト細胞外マトリックス脂肪細胞in vitro培養システムを記述する。
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この記事について
サマリー
要約
細胞外マトリックス(ECM)は、組織恒常性を調節し、細胞とのクロストークに従事し、細胞機能の複数の側面を調節する上で中心的な役割を果たします。ECMは、肥満における脂肪組織機能において特に重要な役割を果たし、脂肪組織ECM堆積および組成物の変化は、マウスおよびヒトにおける代謝疾患と関連している。グローバル組織表現型に寄与するECMおよび細胞の役割の解剖を可能にするトラクティン可能なインビトロモデルはまばらである。我々は、脂肪組織代謝表現型を調節するECMおよび脂肪細胞の特定の役割の研究を可能にするヒトECM-脂肪細胞培養の新しい3D体外モデルを記述する。ヒト脂肪組織は、ECMを単離するために脱細胞化され、その後、ECM内で成熟脂肪細胞に分化するプレディポサイトで再設定される。この方法は、代謝活性であり、それらが由来する組織および患者の特性を保持するECM-脂肪細胞構築物を作成する。このシステムを用いて、ヒト脂肪組織における疾患特異的なECM-脂肪細胞クロストークを実証した。この培養モデルは、世界的な脂肪組織代謝表現型に寄与するECMおよび脂肪細胞の役割を解剖するためのツールを提供し、脂肪組織恒常性を調節するECMの役割の研究を可能にする。
概要
細胞外マトリックス(ECM)は、組織の機械的足場を提供するだけでなく、その中に存在する細胞との複雑なクロストークにも従事し、細胞増殖を含む組織恒常性に必要な多様なプロセスを調節し、分化、シグナル伝達、代謝1.健康なECMは正常組織機能の維持に不可欠な役割を果たしているが、機能不全ECMは多重疾患2に関与している。
脂肪組織は、代謝性疾患の病因において重要な役割を果たす。肥満は、過剰な脂肪細胞肥大および細胞低酸素症、脂肪細胞細胞代謝の欠陥、および脂肪組織小胞体および酸化ストレスおよび炎症に関連している。十分に理解されていないが、これらの複雑なプロセスは、脂肪組織の栄養緩衝能を損なう陰謀を引き起こし、脂肪組織からの栄養オーバーフロー、複数の組織における毒性、および全身代謝疾患3、4を引き起こす、5.脂肪組織の不全の根底にある一連の事象および特定のメカニズムは十分に理解されていないが、脂肪組織ECMの改変は関与している。ECM組成物は、ヒトおよびマウス肥満における脂肪組織内で改変され、ECMタンパク質の堆積と、ヒト代謝疾患に関連する脂肪組織ECMの定性的生化学的および構造的差異が増加した。2型糖尿病および高脂血症6、7、8、9、10、11.
これらの観察にもかかわらず、脂肪組織機能障害を媒媒を媒取する脂肪組織ECMの役割は十分に定義されていない。これは、ECMおよび脂肪細胞の特異的役割の解剖を可能にする、究極の脂肪組織機能の調節を可能にするトラクタブル実験モデルの欠如によるものである。ECM-脂肪細胞培養は、少なくとも2つの点において在来脂肪組織の生体内環境をより良くシミュレートする。まず、ECM培養は、天然のコラーゲン、エラスチン、および標準的な2D培養に存在しない他のマトリックスタンパク質を含む天然脂肪組織と同様の分子環境を提供する。第二に、2Dプラスチック上の培養は、ECM培養が排除するプラスチック基板12の弾性低下による機械的効果を介して脂肪細胞代謝を変化させることが示されている。
脱細胞化脂肪体および他の組織からのECMの単離によって生物学的足場を設計する方法は、再生・再建医学及び組織工学13、14の文脈で検討されている。 15、16、17、18.我々は、ヒト内臓脂肪組織11に由来するECMおよび脂肪細胞幹細胞(プレディポサイト)を用いて、ヒトECM-脂肪細胞培養のインビトロ3Dモデルを開発するためにこれらの方法を適応させた方法論をこれまでに公表した。本稿では、これらの方法について詳しく説明する。ヒト脂肪組織の脱細胞化手順は、細胞および脂質を除去するための機械的および酵素的処置を伴う4日間のプロセスであり、由来する組織の特性を維持する生物学的足場を残す。脱細胞化ECMは、ヒトのプレジポサイトの脂肪族分化をサポートし、脂肪細胞で再構成されると、マイクロアーキテクチャと生化学的および無傷の脂肪組織の疾患特異的特性を維持し、代謝に従事するネイティブ脂肪組織の特徴的な機能。このマトリックスは、単独で研究したり、細胞で再播種することができ、脂肪組織の細胞および細胞外の成分との間の相互作用およびクロストークの研究を可能にする。
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プロトコル
脂肪組織は、制度的審査委員会の承認の下で選択的なバリヤード手術を受けているヒト被験者から調達される。
1. プレディポサイト単離と培養試薬調製
- 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2%ウシ血清アルブミン(BSA)を調製する。フィルターは殺菌し、4 °Cで保管してください。
- II型コラゲラーゼを調製する: 2% BSA で 2 mg/mL 1x PBS.使用直前に準備してください。
- 赤血球(RBC)溶解液を調製する: 1.5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 10 mM 二ナトリウム EDTA 脱イオン水中 (DI/H2O).4°Cで保管してください。使用直前にDI/H2 Oで10xストック溶液から1xRBCライジングソリューションを準備します。
- 成長培地を調製する: 15% 胎児ウシ血清 (FBS), 1% 抗生物質抗粘液 (ABAM) ダルベッココの修飾イーグル培地:栄養混合 F-12 (DMEM/F12).フィルターは殺菌し、4 °Cで保管してください。
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結果
脂肪組織ECMの調製、プレディポサイトによる播種、および成熟脂肪細胞への体外分化により、プロトコル全体の進行を視覚的に評価できる組織の明らかな逐次形態変化をもたらす(図1).ECMの播種に用いられるプレディポサイトは、別々のVATサンプルからのコラゲネアゼ消化を用いて単離される(図2)。処理の各段階におけるECM-脂肪細胞構築物の走査型電子顕微鏡は、ECMの脱細胞化および再播種および分化時の脂質含有脂肪細胞のその後の再分類を明らかにする(図3)。脱細胞ECMのコラーゲン1特異的免疫組織化学は、コラーゲンマイクロアーキテクチャの維持を明らかにし、オイルレッドオー染色は、生と固定/断面化された3D ECM-脂肪細胞構築物は、脂質含有脂肪細胞を明らかにする(図4)A).ECMで分化した脂肪細胞からのqrtPC...
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ディスカッション
ECM-脂肪細胞培養モデルは、ECMおよび細胞の個々の役割を究極の組織表現型のディクテーションで解剖するための貴重なツールを提供します。ECM分離プロトコルは非常に再現可能であるが、脱細胞化プロセスにおける変動性が観察され得る。3日目の脂質異常ステップは、プロトコルの重要なポイントです。一晩の抽出の完了時に、マトリックスの脱脂は、極性溶媒溶液が黄色に変わるように、マトリックスは無傷の脂肪組織の黄色オレンジ色の特徴から半透明に移行する必要があります/白 (図 1) 。これらの色の変化が発生しない場合は、脱脂が完了していない可能性があります。脱脂効率における患者間変動は一般的であるが、現在まで、被験者DMステータス、年齢、BMI、または他の臨床変数との脂質脱脂の効率の相関関係は観察されていない。大きなサンプル(20gを超える)は効率的な脂質を受けりません。サンプル <20 g を処理すると、この問題が発生する可能性があります。3日目以降にサンプルが完全に脱脂して表示されない場合は、サンプルを滅菌ハサミで半分に分割し、サンプルを新鮮な15~20mLの極性溶媒抽出液に移し、3~5時間軌...
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開示事項
著者たちは相反する利害関係を宣言しない。
謝辞
ダニエル・ベルガー、マリリン・ウッドラフ、シモーネ・コレア、レサ・ガイスの研究コーディネートに感謝します。SEMはミシガン大学顕微鏡・画像解析研究所バイオメディカル研究コア施設によって行われました。このプロジェクトは、NIH助成金R01DK097449(RWO)、R01DK115190(RWO、CNL)、R01DK090262(CNL)、退役軍人功労助成金I01CX001811(RWO)、パイロットおよび実現可能性付与ミシガン糖尿病研究センター(NIH P30-D)から支援されました。退役軍人管理VISN 10スパークパイロットグラント(RWO)。ミシガン大学顕微鏡画像解析研究所バイオメディカル研究コア施設による走査型電子顕微鏡この原稿の図4は、もともとベーカーら、Jクリン円doMetab 2017で出版されました。3月1;102 (3), 1032-1043.doi:10.1210/jc.2016-2915、オックスフォード大学出版局の許可により再現https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329。この資料の再利用の許可については、http://global.oup.com/academic/rightsをご覧ください。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.25% トリプシン-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL クライオバイアルチューブ | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin VWR | International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm ナイロンメッシュフィルター | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-デオキシ-D-グルコース | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3',5-Triiodo-L-thyronine ナトリウム塩 (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス | Cat#I5879 | |
| 96ウェル組織培養プレート | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| 抗生物質-抗真菌剤溶液 (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス | Cat#B4639 | |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼI、II型 | Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス | Cat#D4513 | |
| デキサメタゾン | Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス | Cat#D4902 | |
| ジメチルスルホキシ | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | 可燃性、苛性 |
| EDTA 二ナトリウム | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MAUSA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. アメリカ ミズーリ州セントルイス | Cat#21210 | |
| Dulbecco'Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc.,米国マサチューセッツ州ウォルサム | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | 苛性 |
| ヘキサメチルジサリザン | Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス | Cat#440191 | 可燃性、苛性ヒト |
| インスリン溶液 | Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス | Cat#I9278 | |
| イソプロパノール | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. 米国 ミズーリ州セントルイス | Cat#P5655 | |
| ブタ膵臓由来リパーゼ、VI-S Sigma-Aldrich | , Inc. 米国ミズーリ州セントルイス | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. 米国 ミズーリ州セントルイス | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| 最適な切断温度(OCT)化合物 | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| 四酸化オスミウム | Sigma-Aldrich, Inc. 米国 St Louis, MO, USA | Cat#201030 | 苛性アルカリ |
| フッ化フェニルメチルスルホニル (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス | Cat#93482 | 苛性 |
| リン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat | #SH3025601 | |
| 牛膵臓由来のリボヌクレアーゼA, III-A型 | Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen,ヒルデン、ドイツ | Cat#74704 | |
| シンチレーション液 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| シンチレーションカウンター | |||
| ハサミ、鉗子、滅菌 | |||
| ソレンセンのリン酸塩緩衝液 | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 培養フラスコ | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. 米国ミズーリ州セントルイス | Cat#T3309 | |
| トリグリセリド測定キット | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II コラゲナーゼ | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel濾紙、グレード201、150mm | Sigma-Aldrich, Inc.、米国ミズーリ州セントルイス | Cat#WHA5201150 |
参考文献
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