提示されたプロトコルは、フローサイトメトリーを使用して、培養マウスエンターイドにおける増殖細胞および死細胞の数を定量化する。この方法は、オルガノイドの増殖および生存に対する薬物治療の効果を評価するのに役立つ。
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この記事について
サマリー
要約
腸上皮は、病原性微生物叢や毒素などの発光内容物が身体の残りの部分に入るのを防ぐ障壁として機能する。上皮バリア機能は、腸上皮細胞の完全性を必要とする。上皮細胞の増殖はバリアを形成する細胞の連続層を維持する一方で、上皮損傷はバリア機能障害を引き起こす。その結果、明るい内容物は、制限のない経路を介して腸の障壁を越えることができます。腸内バリアの機能不全は、炎症性腸疾患などの多くの腸疾患に関連している。単離されたマウス腸管は、腸オルガノイドまたは「腸内ロイド」と呼ばれるクリプト・ビラス様構造として培養および維持することができる。腸内ロイドは、腸管上皮細胞の増殖および細胞死をインビトロで研究するのに理想的である。このプロトコルでは、培養エンテロイド中の増殖細胞および死細胞数を定量化する簡単な方法を説明する。5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)およびヨウ化プロピジウムは、腸内の増殖および死細胞の標識に使用され、増殖および死細胞の割合は、フローサイトメトリーによって分析される。これは、腸上皮細胞増殖および細胞生存に対する薬物治療の効果を試験するのに有用なツールである。
概要
腸管上皮細胞の基本的な機能は、病原性細菌および毒素1、2などの発光内容物の侵入を保護することです。このような機能を果たすために、腸幹細胞は、腸球細胞や分泌細胞を含む様々な上皮細胞に増殖し、かつ分化し、密閉結合を形成して障壁を形成する3。腸管上皮細胞の急速な再生は、細胞増殖、細胞分化、および細胞死4、5の厳密な調整を必要とする。細胞増殖の減少または過剰な細胞死は、上皮損傷および障壁機能1、6の侵害につながる。腸内バリアの機能不全は炎症性腸疾患7,8に関連付けられている。
腸管の納骨堂を培養する方法が以前に開発されている。この技術を用いて、単離されたマウスの陰窩は腸オルガノイド(腸内ロイド)に成長し、構造のような陰窩を有し、全ての腸上皮細胞系統9、10を....
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プロトコル
このプロトコルは、ケンブリッジ・スーダゲノムリソースセンター(CAM-SU)の動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 腸内オルガノイドの分離と文化
- 腸管の分離と腸内の文化
- CO2吸入で8週齢の野生型マウスを安楽死させる。約8cmの回腸を解剖するために、ティッシュ鉗子と細かい虹彩ハサミを使用してください。
- 氷冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)の約40mLを持つガベージ給餌針を持つ注射器を使用して洗い流し、ハサミで縦に切断し、回腸を開きます。
- 回腸を小さく(0.5-1.0 cm)切ります。15 mLの円錐形チューブに5mLの無菌氷冷DPBSを入れ、氷の上で5分間ロックします。
- ピペットコントローラを使用してDPBSを吸引し、10 mLのコールドバッファ1(DPBSで2 mM EDTA)に交換します。氷の上で30分間ロックします。
- ピペットコントローラを使用してバッファ1を吸引し、10 mLのコールドバッファ2(DPBSで54.9mM D-ソルビトール、43.4 mMスクロース)に置き換えます。手で2-3分(約80シェイク/分)を振ります。
- 振盪後20μLのバッファー2内容物を取り、顕微鏡で検査します。
- 70 μmの無菌細胞ストレーナーでバッファ2内容をフィルターし、50....
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結果
小腸のクリプトは、基細胞膜マトリックス中の腸ロイドとして単離し、培養した。エンターイドは、分離の2日後に芽を形成し始めました。6日目、腸内ロイドは、内腔に多くの破片(死細胞)を持つ多くの芽を持っていました。この段階で腸ロイドは継代を行う準備ができていました(図3)。
多くの研究は、炎症性サイトカインが腸上皮性恒常性の維持に不可欠であることを示している。炎症性サイトカインの異常な発現は、炎症性腸疾患11の発生と密接に関連している。例えば、我々の以前の研究は、IL-22がトランジット増幅細胞の増殖を促進するが、Lgr5+幹細胞12を枯渇させることも示した。
腸イドはIL-22で3日間処理し、その後、合成DNAをEdUで標識して細胞増殖を示した。IL-22処理されたエンチドイドは、EdU+細胞の数を増加させた(
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ディスカッション
このプロトコルは、インビトロで腸内の腸イトの培養に必要なステップを詳述し、腸内のEdU-およびPI陽性細胞をフローサイトメトリーで定量する。この戦略には、いくつかの利点があります。まず、EdU ラベリングは、腸内の増殖細胞を検出するために使用されます。従来のBrdUアッセイと比較して、EdUラベリング法はより速く、より敏感で、より正確である。EdUはチミン(T)と非常によく似ており、細胞分裂中にDNA合成でチミンを置き換えます。また、BrdU抗体と比較して、細胞内への拡散が容易で、EdUの検出にはDNA変性や抗原抗体反応は不要です。第二に、フローサイトメトリー分析は、腸内の増殖(EdU+)および死んだ(PI+)細胞を迅速かつ正確に定量することができる。
手順全体を正常に実行するには、考慮する必要がある重要な側面があります。まず、十分な条件下でエンテロイドを培養することが重要である。よく成長した腸内ロイドは、増殖細胞を含む芽をたくさん持っている必要があります。第二に、腸内ロイドを適時に分割することが重要です。内腔に蓄積された破片には死細胞が.......
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開示事項
著者たちは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、中国国立自然科学財団(31971062、31900326、31600322)、江蘇省自然科学財団(BK20190043、BK20180838)、医薬品バイオテクノロジーの国家主要研究所の研究基金、中国の国家自然科学財団によって支援されています。南京大学(KF-GN-202004)。中国江蘇高等教育機関の自然科学財団(19KJB320003)、蘇州市の生計と技術プログラム(SYS2019030)、江蘇省大学卒業生研究イノベーションプログラム(KYCX19-1981).この作品は、スーチョウ大学の唐学者によってもサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 15 mL 遠心分離管 | Corning | 430791 | |
| 22 G 強制針 | VWR | 20068-608 | |
| 24 ウェルプレート | Nunc | 142475 | |
| 40 mm 滅菌セルストレーナー | BD | 352340 | |
| 50 ml 遠心分離チューブ | Corning | 430829 | |
| 70 mm 滅菌セルストレーナー | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 | マウス南京大学 | ||
| 細胞解離酵素(TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| 遠心分離機 | Eppendorf | 5424 | |
| 遠心分離 | Eppendorf | 5424R | |
| 遠心分離機 | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 イメージングキット | 寿命技術 | C10639 | |
| CO2インキュベーター | パナソニック | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | ||
| D-ソルビトール | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR メディア | ミニガット培地、50 ng/ml EGF、100 ng/ml ノギン、500 ng/ml R-スポンジン | ||
| ウシ胎児血清 (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| ファインアイリスハサミ | Tansoole | 2037454 | |
| 蛍光顕微鏡 | オリンパス | FV1000 | |
| GlutaMAX サプリメント | GIBCO | 35050-061 | |
| ヤギ 血清 | ライフテクノロジー | ズ 16210-064 | |
| HDMEM | ハイクロン | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| マトリゲル | コーニング | 356231 | |
| Minigut 培地 | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| 非イオン性界面活性剤 (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| 手術用ハサミ (12.5cm) | タンソール | 2025785 | |
| パラホルムアルデヒド (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| 位相差顕微鏡 | Nikon | TS1000 | |
| ヨウ化プロピジウム | Σ | P4170-25MG | |
| 組換え EGF | PeproTech | 315-09 | |
| 組換えマウス Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| 組換えマウス R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| 換えマウスIL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| ショ糖 | BBI | SB0498 | |
| 組織鉗子 | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
参考文献
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regu....
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再版と許可
