遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

サマリー

このプロトコルは、マウス胚の新鮮な凍結切片から軟骨および骨を分離するためのレーザー捕捉マイクロセクションを記述する。軟骨および骨はクレシルバイオレット染色によって急速に視覚化され、正確に集めることができるので、トランスクリプト工学的分析のための高品質のRNAを得ることができます。

要約

レーザー捕捉マイクロダイセクション(LCM)は、異種組織から目的の特定の細胞タイプまたは領域を分離するための強力なツールです。骨格要素の細胞および分子複合体は、発達とともに増加する。軟骨および骨の界面や周囲の組織との界面など、組織の不均一性は、軟骨および骨を発達させる研究の障害の1つである。当社のプロトコルは、遺伝子発現解析のための高品質RNAを生み出す軟骨および骨の組織処理および単離の迅速な方法を提供します。マウス胚の新鮮な凍結組織は切り離され、短いクレシルバイオレット染色は、周囲の組織とは異なる色で軟骨および骨を視覚化するために使用される。その後、スライドは急速に脱水され、軟骨と骨はLCMによってその後単離される。このプロセス中の水溶液への暴露の最小化は、RNAの完全性を維持します。E16.5におけるマウスメッケルの軟骨と下顎骨の採取に成功し、遺伝子発現解析により骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞のマーカー遺伝子の微分発現が示された。高品質のRNAはまた、組織および胚性年齢の範囲から単離された。このプロトコルは、低温栓、断面、染色および脱水新鮮な凍結組織を含むLCMのサンプル調製、およびLCMによる軟骨および骨の正確な分離を詳細に説明し、転写分析のための高品質RNAをもたらす。

概要

筋骨格系は、筋肉、結合組織、腱、靭帯、軟骨、および骨からなる多成分系であり、神経によって内在し、血管¹によって血管化される。骨格組織は、細胞の不均一性と構造的複雑さの増加に伴って発症する。軟骨と骨は、同じ骨軟骨葉ゲニター系統から発症し、非常に関連しています。胚軟骨と骨は、筋肉、神経、血管、未分化間感に関連して発症する。軟骨はまた、メッケルの軟骨や下顎骨内の軟骨軟骨などの骨に囲まれていてもよい。これらの組織は解剖学的に関連しており、発達中に細胞外シグナルを介して互いに相互作用する。軟骨および骨の発達における遺伝子発現の研究において、1つの障害は、複数の組織型からなる骨格構造の不均一性である。目的の特定の組織の正確な分離は、転写分析を成功させるために重要です。

レーザー捕捉マイクロダイセクション(LCM)は、異種組織内の目的の細胞の種類または領域を分離するための強力なツールであり、再現性があり、単一細胞レベル²に敏感である。これは、トランスクリプトミクス、ゲノミクス、およびプロテオミクス^3、4における幅広い下流アッセイに対して目的の細胞を正確に標的にし、捕捉することができる。単離されたRNA、DNA、またはタンパク質の品質は、バイオアナライザまたは同等のプラットフォームで評価することができます。例えば、RNA品質は、RNA完全性数(RIN)5で示される。

ここでは、新鮮な凍結組織からのLCMによる軟骨および骨の迅速な染色および単離のためのプロトコルを提供する。マウス胚を使用して、このプロトコルがRNAシーケンシング(RNA-seq)などの後続のトランスクリプトミクス解析のために高品質のRNAを生成することを実証します。

プロトコル

マウスからの組織は、実験動物のケアと使用のための国立衛生ガイドに従って取得され、研究プロトコルは、マウントシナイのイカーン医学部の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。

1. 新鮮な冷凍標本の調製

1. 目的の胚または組織を解剖する。最適な切断温度(OCT)化合物を使用して、使い捨て埋め金型にサンプルを埋め込みます。先端または針で試料の向きを調整します。
2. ドライアイス/メチル-2-ブタン浴でサンプルを急速に凍結します。次のステップに進むか、-80 °Cで保存します。
   注:プロトコルはここで一時停止できます。

2. レーザー捕捉マイクロダイセクション用クライオセクション

1. 70%エタノールでクライオスタットときれいな内部表面を解凍します。RNase除染剤でアンチロールプレートと鉗子のペアを処理します。クライオスタットを所望の切断温度(-18~-22°C)に設定します。ドライアイスで蓋付き容器を準備し、凍結切除中に断面サンプルスライドを一時的に保管するために、ドライアイスにアルミニウム箔のシートを置きます。
   注意:ドライアイスは非常に寒いです。ドライアイスは常に注意して取り扱い、取り扱う時は必ず絶縁手袋を着用してください。
2. 新鮮な冷凍試料をドライアイスのバケツに移します。OCT化合物の層をクライオスタット標本ホルダーの上に置き、直ちに優しい圧力でOCTの上に標本を置きます。OCTが完全に凍結したら、ホルダーを試料でクライオスタット切断アームに固定します。
3. サンプルをクライオスタットに15分間残して、切断温度に平衡化します。
4. 組織をセクションし、12μmの厚さでポリエチレンナフタレート(PEN)膜スライド上のスライスを収集します。膜上で連続した断面を揃えます。1つのスライドが完了したら、セクションを数分間乾燥させ、必要なスライドがすべて収集されるまでドライアイス容器内のホイルにスライドを移します。
5. スライドを -80 °C のスライド ボックスに保管します。
   注:セクションの厚さは、組織の効率的な切断を可能にしながら、収集された組織の量を最大化するために選択され、および目的の組織によって異なる場合があります。プロトコルはここで一時停止できます。スライドを RNase 汚染から解放します。温度変化を避けてください。最大 6 か月間保存されたスライドからの RNA の RIN は、まだ RNA の高品質を示している可能性がありますが、できるだけ早くスライドを使用することをお勧めします。

3. レーザーキャプチャマイクロダイズセクションのサンプル調製

1. 染色および脱水のための解決策を準備する。
   1. 氷上の3つの50 mL遠心管のそれぞれに80%エタノールの45 mLを置きます。#1、#2、#3としてラベル付けします。RNase/DNaseフリーウォーターでエタノールを希釈します。
   2. 氷上の50 mL遠心管に95%エタノールの45 mLを入れます。
   3. 氷上の50 mL遠心管に100%エタノールの45 mLを入れます。
   4. 室温で50mL遠心管にキシレン45mLを入れます。
      注意:キシレンはヒュームフードに使用する必要があります。
2. PEN膜スライドを手袋の手に当てて簡単に解凍し、50 mL遠心管で攪拌を加えて80%エタノール(#1および#2)の45 mLでそれぞれ30sを2回洗浄し、OCTを除去します。
   注:染色前にOCTを除去し、染色中にOCTが緩むのを防ぎ、切片を隠さないようにすることが重要です。鉗子は攪拌によって洗い流されないOCTの除去を促進するために使用することができる。
3. アルミ箔のシートにスライドを敷きます。ピペット 0.8 mL 0.1% クレシルバイオレットを 50% エタノールでスライドに上し、30 s の染色を行い、スライドを 80% エタノール (#3) の 45 mL で 30 s で 30 s に洗浄し、次に 95% エタノール、100% エタノール、およびキシレンを 50 mL セントリフュージ チューブで 30 s ずつ 30 mL ずつ脱水します。
4. キシレンとドライセクションを排出するために5分間繊細なタスクワイパーにスライドを立ちます。
   注:スライドはLCMの前に完全に乾燥する必要があります。

4. レーザーキャプチャマイクロダイセクション

注:LCMを行いながら、粉末フリーのニトリル手袋を着用してください。

1. LCM顕微鏡、レーザー、およびコンピュータの電源を入れます。コンピュータにログオンし、ソフトウェアを起動します。キーを「オン」の位置に回してレーザーを起動します。緑色のライト(レーザー)が点灯したら、赤いボタンを押してレーザーを作動させ、レーザーが使用する準備ができていることを示す光(レーザー)が赤色に変わります。
   注:レーザーは、ウォームアップに約10分を必要とします。
2. 回収管を設定します。
   1. 0.5 mLポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブのキャップをコレクターに挿入します。
      注:目的の PCR チューブ(0.2 または 0.5 mL)の一致するコレクターを選択します。
   2. ピペット50μLの抽出緩衝液(材料の表に記載されたRNA分離キットによって提供される)を0.5 mL回収管のキャップに入れた。
   3. 回収装置を顕微鏡に挿入します。
   4. 「コレクター・デバイスの変更」ウィンドウで、「参照ポイントに移動」ボタンをクリックして、コレクターを基準点(RP)に移動します。RP をはっきりと表示するようにフォーカスを調整します。矢印をクリックして RP をビューの中央に移動します。
3. 積み込み標本スライド。
   1. ツールバーの左の[アンロード]ボタンをクリックして、スライドホルダーを下げます。
   2. 組織部を下向きにして、スライドをホルダーに入します。
      注:この向きは捕獲されたティッシュセクションが重力によって集出管の帽子に落ちるように保障する。
   3. ホルダーをステージに挿入し直します。
4. レーザー パラメータを設定します。
   1. レーザーメニューの[コントロール]オプションを選択するか、[レーザー ]アイコンをクリックします。
   2. 必要に応じてこれらのパラメータを調整する:パワー、レーザーのパワー。絞り、レーザーの幅;と速度、描画とカットモードでの切断の速度。
      注:対象外の領域でレーザーをテストします。より高い力またはより大きい開口部は切り取りが容易になるが、細胞に多くの損傷を引き起こす。力、絞り、および速度の組み合わせを調整して、組織の効率的な切断と最小限の損傷を得る。たとえば、12 μm セクションの軟骨組織の場合、Power = 40、絞り = 5、速度 = 7 です。
5. 対象領域を選択して切り取ります。
   1. 5倍の目標から始めて関心のある領域を見つけ、関心のある領域を最もよく示す目標 (5x、10x、または 40x) に切り替えます。
      注:クレシルスミレ染色後、軟骨はマゼンタに染色され、ミネラル化された組織は茶色または黒色に見え、他の組織と区別できる。イメージは、[ファイル]メニューの [名前を付けてイメージを保存]を使用して保存できます。
   2. コレクターのマークをクリックして、収集するチューブ(A、B、C、D)を選択します。
   3. [移動] を選択し、[切り取り] または [描画して切り取り] を選択します。移動およびカットモードでは、マウスまたはタッチスクリーンペンを使用して形状をフリーハンドで描画し、標本を手動でカットします。描画モードと切り取りモードでは、後続の切り取りのためにマウスまたはタッチスクリーン ペンを使用して図形をフリーハンドで描画できます。[カットの開始]ボタンをクリックして、レーザー切断を開始します。
   4. カットが完了すると、PEN膜を有する標的組織は重力によって回収管のキャップに落ちる。必要に応じて、4.5 を繰り返して複数の対象エリアをプールします。
      注:不完全な切断のために組織が回収管のキャップに落ちない場合は、切り傷を繰り返したり、パワーや絞りを増やしたりする必要があります。ミネラル化された骨(茶色または黒)はレーザーで直接切断することはできません。
6. コレクターをアンロードし、PCRチューブを慎重に閉じます。マイクロセク剖された組織をドライアイスに入れ、次のステップに進むか、-80 °Cで保存します。
   注:プロトコルはここで一時停止できます。次のサンプルについては、4.2 ~ 4.6 を繰り返します。

5. 微分組織のライシスとRNA単離

1. マイクロセ剖した組織を室温で解凍します。遠心分離機を短時間でインキュベートし、42°Cで30分間サンプルをインキュベートします。
2. インキュベーション後、lysisバッファーを0.5 mL PCRチューブにスピンダウンします。RNA分離キットを使用してDNase処理とRNA抽出を実行します(材料表を参照)。

結果

E16.5の新鮮な凍結マウス組織のコロナセクションは、メッケル軟骨(MC)、結節軟骨、およびLCMによる下顎骨の分離および採取を実証するために使用された。E16.5のマウス胚を解剖し、OCT化合物で極低温型に埋め込んだ。金型中のサンプルをドライアイスおよびメチル-2-ブタン浴中で急速に凍結し、-80°Cで保存した。

軟骨および骨のクレシルスミレ染色を実証するために、コロナ面での凍結切除を行い、顕微鏡スライド上でサンプルを採取した。上記のプロトコルに従って切片を洗浄、染色、脱水した(ステップ3.2~3.4)。スライドを空気乾燥し、永久取り付け媒体で取り付けた。検査したすべての軟骨は、染色マゼンタ(MC、顆粒軟骨、鼻中隔軟骨、肋軟骨、前駆骨の軟骨原始、半径および尺骨の軟骨原始)であり、すべてのミネラル化された組織は茶色または黒色に染色された(図1A-E)。軟骨と骨の両方が、複数の解剖学的部位で他の組織と容易に区別された。

LCMの場合、E...

ディスカッション

LCMは、異種組織からの濃縮または均質な細胞集団の単離を可能にする。その利点は、その生体内文脈における細胞の迅速かつ正確な捕捉を含むが、潜在的な欠点は、時間がかかり、費用がかかり、かつ、ユーザが指定されたサンプル³⁰内の個別の部分集団を認識する必要性によって制限されることを含む。このプロトコルは、マウス胚軟骨および骨のLCMの詳細を提供し、RNA-seqによるその後の分析のために高いRNA完全性を維持しながら、正確な組織採取のために軟骨および骨を可視化する迅速な手順でクレシルスミレ染色の使用を強調する。このプロトコルの1つの制限は、ここで使用されるLCMシステムがミネラル化された組織(例えば、図2Cの黒色の下顎組織)を直接切断することができないことです。その結果、骨領域全体を解剖する必要があります。特に、LCMによって単離された微分化されたオセジ化領域は均質ではなく、骨芽細胞、骨細胞、および破骨細胞の少なくとも亜集団を含む(表1)。それにもかかわ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-メチルブタン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	O3551-4
バイオアナライザー	アジレント	G2939BA
遠心チューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	339653	円錐形滅菌ポリプロピレン遠心チューブ、50 mL
クレシルバイオレットアセテート	Sigma-Aldrich	C5042
クライオスタット	ライカバイオシステム	CM3050 S
デリケートタスクワイパー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	06-666
使い捨て埋め込み金型	サーモフィッシャーサイエンティフィック	1220
蒸留水	Invitrogen	10977-015	DNase/RNase-Free
エタノール、絶対(200プルーフ)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BP2818	分子生物学グレード
ガラスPENメンブレンスライド	ライカマイクロシステム	11505158
LCMシステム	ライカマイクロシステム	ライカLMD6500
顕微鏡カバーガラス	サーモフィッシャーサイエンティフィック 12-545FP
顕微鏡スライド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12-550-15
OCT 化合物	電子顕微鏡科学	102094-106
フラットキャップ付きPCRチューブ、0.5 mL	Axygen	PCR-05-C	LCMコレクションチューブ
永久埋込用培地	ベクターラボラトリーズ	H-5000
RNA分離キット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	KIT0204
RNase除染剤	Sigma-Aldrich	R2020	表面洗浄用RNase除染剤
キシレン	Sigma-Aldrich	214736