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方法論記事

鎖特異的RT-PCRによる患者におけるヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)アンチセンスタンパク質(ASP)RNA転写物の検出

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DOI：

10.3791/60511

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2019年11月27日

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1Division of Immunology and Allergy, Lausanne University Hospital, 2Department of Fundamental Neuroscience, University of Lausanne, 3Department of Biochemistry, Erasmus Medical Center, 4Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratories, 5Department of Biochemistry, University of Lausanne

この記事について

サマリー

RNAヘアピンおよびループは、配列特異的プライマーがない逆転写(RT)のプライマーとして機能し、アンチセンス転写物の重複の研究を妨害する。鎖特異的RNAを同定できる技術を開発し、それを用いてHIV-1アンチセンスタンパク質ASPの研究に取り入れきました。

要約

レトロウイルスにおいて、アンチセンス転写は、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)およびヒトTリンパ球性ウイルス1(HTLV-1)の両方に記載されている。HIV-1において、アンチセンスタンパク質ASP遺伝子は、envの陰性鎖上に位置し、読み取りフレーム-2において、接合部gp120/gp41にまたがる。意味的な向きでは、ASP オープン読み取りフレームの 3' 終端が gp120 超可変領域 V4 および V5 と重複します。ASP RNAの研究は、RT自己プライミングとして知られている現象によって阻止され、それによってRNA二次構造は、特定のプライマーがない場合にRTをプライミングする能力を有し、非特異的cDNAを生成する。RT反応におけるビオチン化逆プライマーとの高RNA変性の併用により、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズに対するcDNAの親和性精製と共に、HIV-1に感染した個体由来のCD4+T細胞においてASP RNAを選択的に増幅することができました。当社の方法は、比較的低コストで、実行が簡単で、信頼性が高く、簡単に再現可能です。この点で、HIV-1だけでなく、他の生物学的システムにおいてもアンチセンス転写の研究のための強力なツールを表しています。

概要

アンチセンスタンパク質(ASP)遺伝子は、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)エンベロープ(env)遺伝子の陰性鎖上に位置する開いた読み取りフレーム(ORF)であり、接合片gp120/gp4111にまたがっている。過去30年間にわたり、HIV ASP遺伝子が実際に転写され、翻訳された2、3、4、5、6、7、8、9であることが示されています。ASPアンチセンス転写物はインビトロで完全に特徴付けられてきたが、最近まで患者におけるASP RNAの実際の産生に関する情報はまだ欠落していた。

ASP のシーケンスは逆で、env を補完します。これは、ASP のトランスクリプトを検出しようとする際の大きな障害を表します。標準的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)法は、遺伝子特異的アンチセンスプライマーを使用して、正極性の相補的なDNA(cDNA)を合成します。しかしながら、このアプローチは、RNAヘアピンまたはループがプライマー10の不在で両方向にRTをプライミングすることができるので、初期RNAテンプレートの向き(センスまたはアンチセンス)を決定することを可能にしない、RT自己プライミングとして知られている現象である。ほとんどのASP研究者は、HIV-111、12に関連しないシーケンスでタグ付けされたプライマーを使用してRTセルフプライミングの問題を回避します。しかしながら、この戦略は、現象の発生を排除するものではなく、PCR11への非特異的CDNAの潜在的な持ち越しにつながる可能性がある。

我々は最近、アンチセンスRNAの研究のための新規な鎖特異的RT−PCRアッセイを開発し、表1に示すように、6人のHIV感染患者のコホートにおけるASP RNA検出に使用した。以下に説明する手順は、アントニオ・マンカレラら13によって以前に公開されています。このプロトコルでは、デュアルアプローチによる非特異的cDNAの生産を回避します。まず、高温(94°C)でRNAを変性させることによりRNA二次構造を排除し、次に、ビオチン化ASP特異的プライマーを用いてASP RNAを逆書き起こし、得られたcDNAをアフィニティー精製します。このアプローチにより、他の非特異的RT産物が生成されるのを防ぐか(RNAの高温変性)またはPCR(アフィニティー精製)の前に排除されるため、ターゲットcDNAのみを増幅することができます。

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プロトコル

この研究は、センターホスピタリエ大学ヴォードワ(CHUV)の機関審査委員会によって承認されました。

1. HIV-1HXB2型菌による末梢血単核細胞(PBMC)の感染

  1. 1日目:PBMC刺激
    1. 健康なドナーバフィーコートからPBMCを分離します。
    2. 完全なロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地で1x106/mLの濃度でPBMCをカウントし、1%の胎児ウシジン血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(R-10)を含む培地で、インターロイキン-2(IL-2)と3μg/mLを50 U/mL添加します。
    3. 2つの6ウェルプレート(3 mLのセル懸濁液/ウェル)でセルを上下にパイプし、分割します。
    4. 37°で3日間インキュベートし、5%CO2.
  2. 3日目:PBMC感染
    メモ:ステップ1.1.3のように2つのプレートのいずれかを負のコントロールとして使用します(これらの細胞に感染しないでください)。
    注意: バイオセーフティレベルIIIラボ(P3)で手順全体を実行します。
    1. プールPBMCを1つのプレートから50 mLのハヤブサチューブに、300 x gで10分間遠心分離機を取り込みます。
    2. 上清を廃棄し、IL-2と2μg/mLポリブレンの20 U/mLを含むR-10の2.2 mLで細胞を再サスペンドします。
    3. HIV-1HXB2ウイルスを含むバイアルを解凍し、1.8 mLのウイルス懸濁液(0.376 ng/μL)を細胞に添加します。
    4. 細胞を37°Cで2時間インキュベートし、30分ごとにチューブを軽く旋回する。
    5. 細胞を300 x gで10分間遠心分離する。
    6. 上清を破棄し、IL-2 (50 U/mL) を含む R-10 の 1x106/mL でセルを再中断します。
    7. 細胞懸濁液を1mL/ウェルの濃度で24ウェルプレートに移し、37°Cおよび5%CO2で5日間インキュベートする。
    8. 毎日1をよく収穫し、細胞を1.5 mLチューブ(感染の日で標識)に移す。
      注:遠心分離の前に、150μLの細胞懸濁液をPBMC感染品質管理のためのフローサイトメトリーチューブに移す(ステップ1.3を参照)
    9. 400 x gでチューブを10分間遠心分離し、上清を捨てます。
    10. 使用するまで-80°Cで細胞ペレットを凍結します。
  3. PBMC感染:品質管理
    1. 感染の日ごとに、感染したPBMCの150 μLを収集し、フローサイトメトリーチューブに移します。
    2. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を1mL加え、400 x gで5分間遠心分離機を加えます。
    3. 上清を捨て、アクアライブ/デッドダイス(以前にPBSで1:10希釈)の1μLを含むPBSを50°L加えます。
    4. 4 °Cで15分間インキュベートします。
    5. 1 mL の PBS を加え、400 x gで 5 分間遠心を加え、上清を廃棄します。
    6. 250°Lの固定/透過液を加え、暗闇の中で室温で20分間インキュベートします。
    7. 1x Perm/Washバッファー(FBSとサポニン希釈1:10の両方を含む10xストック溶液)を1mL加え、400 x gで5分間遠心分離機を加えます。
    8. 上清を廃棄し、HIV Gag p24フルオレセインイソチオシアネート(FITC)共役抗体(希釈1:10)を含むPBSを50μL添加します。
    9. 暗闇の中で室温で20分間インキュベートする。
    10. 1 mL の PBS を加え、400 x gで 5 分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    11. x CellFIX(10%ホルムアルデヒド、3.55%メタノール、0.93%アジ化ナトリウム希釈1:10)を含む150μLのx CellFIXを加え、フローサイトメトリーによって細胞を分析します。

2. 抗CD3/CD28抗体によるヒトCD4+T細胞の刺激

  1. HIV-1感染患者と健康なドナーの両方のPBMCからCD4+T細胞を分離する。
  2. PBSで抗CD3(1:100)と抗CD28(1:50)を希釈することにより、ヒト抗CD3/CD28抗体ミックスを調製します。
  3. ウェル当たり200μLの抗体ミックスをウェル当たり200μLをウェルに加えて48ウェルプレートをコートし、37°Cで2時間インキュベートする。
  4. 抗体溶液を吸引し、1x106/mLのCD4+T細胞を抗CD3/CD28抗体コーティングウェルに添加します。
    注:5日までCD4+T細胞を刺激します。

3. 逆転写

注:患者特異的プライマーを得るために、各患者からCD4+T細胞から単離されたプロウイルスDNAを、HIV-1HXB2 Pan ASPプライマーを用いて増幅した。患者特異的プライマーは、パンASPプライマー内部のプロウイルス配列を用いて設計された。この研究で使用されるすべてのプライマーとプローブを表 2に示します。

  1. 細胞から全RNAを分離する
    1. RNAを定量化し、DNaseでサンプルを処理することによりDNA汚染を排除します。
    2. 50°Lの体積でRT反応を行い、合計RNAの0.1~1μgを96ウェルPCRプレートの適切な数のウェルに転写します。次の成分を RNA に追加して、RNA 混合物を準備します。
      5 μL のビオチン化 ASP リバースプライマー (20 μM)
      デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)の2.5 μL(10 mM)
      25 μLのジエチルピロカーボネート(DEPC)処理蒸留水(dH2O)。
      ビオチン化ASP逆プライマーの代わりに5μLのヌクレアーゼフリー水を添加して内因性RTコントロールを準備します。
    3. 96ウェルPCRプレートをサーモサイカーに入れ、RNA混合物を94°Cに5分間加熱します。
    4. 直ちに少なくとも1分間氷水中のRNA混合物を冷却する。
    5. 1.5 mLチューブに以下の成分を加えて反応混合物を調製します(サンプルの総数に1を加えたものを計算します)。
      5x RT バッファの 10 μL
      1,4-ジチオトレイトール(DTT)の0.1 Mの2.5 μL
      2.5°LのRNase out(40単位/°L)
      RT酵素の2.5 μL(200単位/°L)
    6. この混合物の17.5μLを各RNA含有ウェルに移す。逆転写酵素をヌクレアーゼフリー水の2.5°Lに置き換えるRT-マイナスコントロールを準備します。
    7. 軽く混ぜ、サーモサイカーを使用して55°Cでプレートをインキュベートします。
    8. 70°Cで15分間加熱して反応を不活性化する。

4. ASPビオチン化cDNAのアフィニティー精製

注:RTマイナス反応を浄化しないでください。

  1. 10 mM トリス HCl (pH 7.5),1 mM エチレンジアミンテトラ酢酸 (EDTA) および 2 M NaCl を含む 2x 洗浄/結合バッファーの 1 L を調製します。ソリューションをフィルター処理します。
    1. PCRグレードの水を使用して、1x洗浄/結合バッファーの50 mLを準備します。
    2. 反応ごとに、ストレプトアビジン共役磁気ビーズを10μL使用します。反応数に基づいて、ビーズの適切な量を1.5 mLチューブに移す。
    3. ビーズを洗い、2倍の洗浄/結合バッファーと渦を15sに等量加えて洗浄します。
    4. チューブを磁気分離ラックに入れ、室温で3分間インキュベートします。
    5. ビーズを邪魔することなく慎重に上清を取り除き、ビーズの初期容積と同じ量の洗浄/結合2xバッファーを追加します。
    6. 30s用ボルテックスとビーズ懸濁液の10μLを適切な数の1.5mLチューブに転写する。
    7. チューブを磁気分離ラックに入れ、室温で3分間インキュベートします。
    8. 上清を捨て、50μLの洗浄/結合2x緩衝液を加えます。
    9. ビーズを含む対応するチューブに50μLのビオチン化cDNAを加えます。
    10. 室温で30分間インキュベートし、穏やかに回転する。
    11. 室温で3分間、磁石分離ラックで上清からビーズを分離します。
    12. 1x洗浄/結合バッファーの200°Lを加えてビーズを洗浄します。室温で3分間磁石分離ラックにチューブを置き、上清を捨てます。2 回繰り返します。
    13. PCRグレードの水でビーズを10°Lで再サスペンドします。

5. 標準PCR

注:標準的なPCRの目的は、ASP遺伝子のORF全体を増幅することです。増幅産物をpCR2.1プラスミドにクローニングし、リアルタイムPCRによるASP RNA定量のための標準曲線を開発します(段落リアルタイムPCRを参照)。

  1. 標準 PCR を合計ボリューム 50 μL で実行します。サンプルごとに、次のコンポーネントを 1.5 mL チューブに追加します。
    1 μL の 1 0 μM ASP プライマー (前方および逆方向)
    10 mM dTP の 1 μL
    塩化マグネシウム(MgCl2)(濃度は使用するプライマーに依存)
    dH2O から 49°L の最終容積
    1. よく混ぜ、すぐに内容物をスピンダウンし、PCRマスターミックスの49°L/ウェルを96ウェルPCRプレートに転送します。
    2. 慎重に15sのためのASP cDNA親和性精製に使用されるビーズを含むチューブを渦。
    3. 対応する井戸に1μLのビーズを追加し、次のプログラムを使用してPCRを実行します:95°Cは2分、40sでは95°C、30sは55°C、40sの場合は68°C、7分間は68°Cです。
    4. PCR製品を1%アガロースゲルに分離し、バンドをカットし、増幅された製品をpCR2.1プラスミドにクローンします。
    5. 各クローンのシーケンスをシーケンスして分析します。

6. リアルタイム定量PCR(qPCR)

注:ステップ3「逆転写」で説明したアプローチを使用して、患者固有のプライマーとプローブを開発します。qPCRの場合、標準曲線のASPプラスミド希釈が含まれる。患者特異的な挿入物を含むプラスミドは、ステップ5「標準PCR」の冒頭のノートに記載されているように開発される。

  1. 3 x 106コピー/μL から 3 コピー/μL までの 1:10 ASP プラスミド シリアル 希釈を使用して標準曲線を準備します。
    1. 第1ラウンドPCR(プリアンプ)。25°Lの総体積で反応を行い、PCRマスターミックスの適切なボリューム(サンプル数+1)を準備します。サンプルごとに、次のコンポーネントを 1.5 mL チューブに追加します。
      0.5 μL の ASP または env プライマー ミックス (最終濃度 0.2 μM それぞれ) (順方向と逆方向)
      0.5°LのdNTPミックス(最終濃度はそれぞれ0.2mM)
      MgCl2 (濃度はプライマー対によって異なります)
      dH2O から 24°L の最終容積
    2. PCRマスターミックスの24°Lを96ウェルPCRプレートの適切な数のウェルに転送します。
    3. 慎重に15sのためのcDNAとビーズを含むチューブを渦。
    4. 対応する井戸に1μLのビーズを加えます。プラスミド希釈についても同じことを行います。
    5. 次のアルゴリズムを使用してPCRを実行します: 95 °C で 2 分間変性;95 °Cで 30 s、 55 °C で 30 s、18 サイクルの 68 °C で 40 s;7分間68°Cで延長。
    6. PCRグレードの水で最初の丸いPCR反応を1:5に希釈します。
    7. 第2ラウンドqPCR。20°Lの総体積で反応を行い、PCRマスターミックスの適切なボリューム(サンプル数+1)を準備します。サンプルごとに、次のコンポーネントを 1.5 mL チューブに追加します。
      1.8°L 10°Mプライマー(前方および逆方向)
      5 μM プローブの 1 μL
      6.2 μL の dH2O
    8. 19 μLのqPCRマスターミックスを96ウェルqPCRプレートの適切な数のウェルに移し、希釈された第1ラウンドPCR反応の1μLを対応するウェルに追加します。プラスミド希釈についても同じことを行う。
    9. 次のアルゴリズムで qPCR を実行します: 95 °C で 10 分間変性;95°Cで15s、40サイクルで60°Cで1分。

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結果

ビオチン化cDNAのアフィニティー精製に結合された高温RNA変性は、患者から分離されたインビトロおよびCD4+T細胞におけるPBMc中の非特異的ASP産物の増幅を防止する。RT自己プライミングは、アンチセンスRNA10、14、15、16、17の逆転写中に起こることが示されている。この現象を防ぐために、もともとHeist et al.10で記述された技術を用いて新しいアプローチを開発した。我々の手順は、RTの前にRNAの高温変性およびRTを行うためにビオチン化プライマーを使用し、続いてストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズ13にビオチン化されたcDNAの親和性精製を含む。この方法で得られた cDN...

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ディスカッション

本報告では、HIV-1に感染した個体から単離されたCD4+T細胞におけるASP RNAの検出に適用される鎖特異的RTアッセイについて説明する。RT中の非特異的プライミングの発生は、正しい極性を有するRNA転写物の検出を妨げ、結果の誤解釈につながる。以前のグループは、RT反応中にプライマーに依存しないcDNA合成を防止することを目的としたいくつかの戦略を開発しました。HIVに関連しない配列で3'末端に逆プライマーをタグ付けすることは、鎖特異的増幅6、8、9を達成するのに有効であることが証明された。しかし、このアプローチでは、誤ったプライム付きcDNAを回避するのではなく、PCR反応に漏洩するリスクを伴い、非特異的DNA産物(すなわち、ASPの代わりにenv)の増幅を引き起こす可能性があります。

ASP RNAを検出する最初のRT-PCRの試みは、標準的なアンチセンスプライマーを使用して行われました。...

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開示事項

著者らは、利益相反がないことを宣言する。

謝辞

パトリツィア・アメリオ、アレッサンドラ・ノト、クレイグ・フェンウィック、マチュー・ペローは、常に私たちの仕事とエイズ免疫病原性研究所の全ての人々に、彼らの貴重な技術支援について話し合うために利用できることに感謝します。また、優れたアートワークに貢献してくれたVSBアソシエイテッド社のジョンとアーロン・ウェドルにも感謝申し上げたいと思います。最後に、この仕事は不可能だったすべての患者に多くの特別な感謝。この作業は、どの資金調達機関からも特定の助成金を受け取っていません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BD LSR IIBecton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing KitApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4337450
dNTP Set (100 mM)Invitrogen, Thermo Fisher Scientific10297018
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen, Thermo Fisher Scientific11205D
EasySep Human CD4+ T Cell単離キットStemcell Technologies19052
ウシ胎児血清BiowestS1010-500
固定/透過化溶液キットベクトン・ディキンソン 554714
HIV Gag p24 フローサイトメトリー 抗体 - Kc57-FITCベックマン・コールター6604665
ヒト IL-2ミルテニー バイオテック130-097-743
Phaseolus vulgaris (PHA)由来レクチンSigma-Aldrich61764-1MG
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogen, Thermo Fisher ScientificL34967
Mouse Anti-Human CD28Becton Dickinson55725
Mouse Anti-Human CD3Becton Dickinson55329
Primers and ProbesIntegrated DNAテクノロジーズ (IDT)
Penicillin-StreptomycinBioConcept4-01F00-H
Platinum Taq DNA Polymerase High FidelityInvitrogen, Thermo Fisher Scientific11304011
Polybrene Infection / Transfection ReagentSigma-AldrichTR-1003-G
RNeasy Mini KitQiagen74104
ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI) 1640 MediumGibco, Thermo Fisher Scientific11875093
StepOnePlus Real-Time PCR SystemApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4376600
SuperScript III Reverse TranscriptaseInvitrogen, Thermo Fisher Scientific18080044
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific
TOPO TA クローニングキット、One Shot TOP10 ケミカルコンピテント大腸菌細胞、Invitrogen、Thermo Fisher ScientificK450001
TURBO DNase (2 U/µL)Invitrogen、サーモフィッシャーサイエンティフィックAM2238
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystem、サーモフィッシャーサイエンティフィ4375786
4369016ック

参考文献

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