ピリミジン類似体である5-ヨード-2'-デオキシウリジン(IdU)と細胞周期マーカーを使用して、マスサイトメトリープラットフォームで細胞周期相を確立します(英語)

サマリー

このプロトコルは、マスサイトメトリープラットフォームで使用するために細胞周期測定に適合させます。マスサイトメトリーのマルチパラメータ機能により、ヨウ素取り込みを直接測定することでS期の細胞を同定でき、細胞内サイクリングマーカーはさまざまな実験条件で各細胞周期状態の特性評価を可能にします。

要約

細胞周期相の調節は、細胞増殖および恒常性の重要な側面である。細胞周期を支配する調節機構の破壊は、癌を含む多くの疾患の特徴である。細胞周期の研究には、細胞周期の進行の各部分の細胞数を定義し、各細胞周期段階を明確に描写する能力が必要です。マスサイトメトリー(MCM)の出現は、元素同位体の直接測定によるハイスループットシングルセル分析の大きな可能性を提供し、MCMによる細胞周期状態の測定方法の開発は、MCMの有用性をさらに拡大します。ここでは、MCMシステムで5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)と同様に、5-ヨード-2'-デオキシウリジン(IdU)を直接測定する方法について説明します。この IdU ベースの MCM を使用すると、いくつかの利点があります。まず、IdUは合成中にDNAに急速に取り込まれるため、10〜15分の短いインキュベーションでS期の細胞を確実に測定できます。第二に、IdUは二次抗体やDNA分解を必要とせずに測定されます。第三に、IdU染色は、サイクリンB1、リン酸化網膜芽細胞腫タンパク質(pRb)、およびリン酸化ヒストンH3(pHH3)の測定と簡単に組み合わせることができ、5つの細胞周期相の明確な描写をまとめて提供します。これらの細胞周期マーカーとMCMで可能な多数のパラメータとの組み合わせにより、他の多くの指標との組み合わせが可能になります。

概要

質量サイトメトリーは、質量分析法の高分解能と定量性を利用して、約40のパラメータの検出を可能にします。蛍光色素標識抗体の代わりに金属標識抗体が使用され、より多くのチャネルが可能で、スピルオーバーが最小限に抑えられます^1,2。MCMには、フローサイトメトリーと比較して、細胞周期解析に関して長所と短所があります。MCMの主な利点の1つは、多数のパラメータにより、非常に不均一なサンプル中の多数の免疫表現型的に異なるT細胞タイプにわたる細胞周期状態を同時に測定できることです。MCMは、ヒト骨髄³およびテロメラーゼ欠損症⁴のトランスジェニックマウスモデルにおける正常造血中の細胞周期状態の測定に成功しています。急性骨髄性白血病(AML)における細胞周期状態の解析は、細胞周期が臨床療法に対する既知の反応と相関していることを示し、治療の選択に情報を提供できる機能的特徴へのin vivoの洞察を提供します⁵。マスサイトメトリー細胞周期分析の第2の利点は、細胞周期状態と相関し得る多数の他の機能マーカーを測定する能力である。最近の研究では、IdUとBRUおよびrRNA⁶に対する金属タグ付き抗体を使用することにより、タンパク質およびRNA合成を細胞周....

プロトコル

1. IdU銘柄の準備

1. 5-ヨード-2'-デオキシウリジン(IdU)をDMSOに50 mMの濃度まで溶解します。滅菌フィルター、10-50 μLチューブに分注し、-80°Cで保存
2. 冷凍庫からIdUを取り出し、室温で解凍します。IdUをRPMI-1640で希釈して、最終濃度1 mMの作業溶液を作ります。ピペットを上下にするか、ボルテックスして混合します。
   1. 通常、濃縮されたIdUを細胞が培養されている培地(DMEM、IMDMなど)に希釈するか、PBSに希釈して末梢血または骨髄穿刺サンプルに直接添加します。この予備希釈ステップは、DMSOと目的の細胞の水性媒体との混合を容易にする。
      注:インキュベーション中のIdUの最終濃度は10μMである必要があります。1 mLの溶液を培地1 mLごとに10 μLの比率で添加できます。

2. IdUインキュベーションとサンプル保存

1. 加湿された37°Cのインキュベーターでサンプルを維持します。インキュベーターからサンプルを取り出し、サンプルをバイオセーフティフードに移動します。
2. サンプル1 mLごとに1 μLの1 mM IdUを追加します。
   1. 6ウェルプレートの場合、各ウェルの3 mLの培地に30 μLの1 mM IdUを追加します。IdUは、骨髄穿刺液やマウスの研究に直接使用することもできます

結果

HL-60細胞とヒト骨髄穿刺液を利用することで、実験条件が細胞周期の分布と分析にどのように影響するかを示すことができます。まず、細胞周期相がどのように導出されるかを実証するために、ゲーティング戦略を確立する必要があります。図1では、細胞の破片とダブレットを分離し、単一細胞集団を確立するのに重要な一重項ゲートの確立を示しています。細胞株の場合、細胞周期解析に進むために必要なのは一重項ゲートだけです(図2a)。ヒトサンプルの場合、各細胞周期ゲートの正確な境界は細胞タイプによって異なる可能性があるため、通常、細胞周期解析の前に免疫表現型集団を確立する必要があります。集団が確立されたら(通常、その集団を定義する表面マーカーをゲーティングすることによって)、細胞周期ゲートを確立する必要があります。図2bは、IdU対CyclinB1二軸プロット上のS相の確立を示しています。このプロットは、G2/M相ゲートの境界を確立するためにも使用されます(

ディスカッション

ここで紹介する例は、MCM プラットフォームを使用して細胞周期分布を分析する方法を示しています。また、細胞周期解析は時間や温度などの実験条件に敏感であることが実証されており、これは研究者が細胞周期解析にMCMを検討する際に取らなければならない重要な考慮事項です¹⁴。1時間以内の短期間保管されたサンプルは、通常の状態に匹敵するIdUの取り込みになります。クローズドシステム内のサンプルを約2時間長期間使用すると、IdUの取り込みは減少しますが、相対的なサイクル画分と非サイクル画分は変化せず、粗い細胞サイクル分析が可能になります。極低温保存とそれに続く融解は、かなりの期間、正常な細胞周期分布を破壊します。極低温保存は、タンパク質およびRNA分布を破壊することが以前に指摘されていたが、細胞周期を混乱させることが最近になってようやく示された^14,15,16,17

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ血清アルブミン(BSA)	Sigma	A3059	CSM
遠心分離機	Thermo Scientific	75-217-420	サンプル遠心分離
Cleaved-PARP (D214)	BD Biosciences	F21-852	アポトーシス細胞の同定
Cyclin B1	BD Biosciences	GNS-1	G2 分解能
ジメチルスルホキシド(DMSO)	Sigma	D2650	Cryopreservative
EQ 4 要素キャリブレーション ビーズ	Fluidigm 201078		CyTOF パフォーマンス
FACS チューブ メッシュストレーナー付き	Corning	08-771-23	CyTOF 実行前に塊/破片を除去する細胞ストレーナー
胎児ウシ血清 (FBS)	VWR	97068-085	細胞培養成長サプリメント
Helios	Fluidigm		CyTOFシステム/プラットフォーム
ヘパリン	シグマ	H3393	非特異的染色を防ぐための染色添加剤
IdU(5-ヨード-2&プライム;-デオキシウリジン)	シグマ	I7125	S相に組み込み
Ki-67	eBiosciences	SolA15	G0/G1
MaxPar マルチラベルキット	Fluidigm	201300	金属ラベリングキット、金属を添付抗体
へ マイクロプレート シェーカー	Thermo Scientific	88880023	染色中のサンプルの混合
パラホルムアルデヒド(PFA)	電子顕微鏡サービス	15710	固定剤
ペンタメチルシクロペンタジエニル-Ir(III)-ジピリドフェナジン	Fluidigm	201192	CyTOF取得時の細胞同定
p-H2AX (S139)	Millipore	JBW301	DNA損傷の検出
p-HH3 (S28)	Biolegend	HTA28	M-phase Resolution
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	細胞培養用洗浄液および固定液の成分
p-Rb (S807/811)	BD Biosciences	J112906	G0/G1 Resolution
Proteomic Stabilizer	SmartTube Inc	PROT1	Sample fixative
RPMI 1640	Gibco	21870-076	細胞培養増殖培地
アジ化ナトリウム	Acros Organics AC447810250		CSM/抗体緩衝液の成分、殺生物剤

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