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方法論記事

ラットにおける複雑な局所疼痛症候群タイプIに対する慢性虚血後疼痛モデル

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DOI:

10.3791/60562

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2020年1月21日

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1Department of Neurobiology and Acupuncture Research, The Third Clinical Medical College, Zhejiang Chinese Medical University, Key Laboratory of Acupuncture and Neurology of Zhejiang Province, 2Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、慢性虚血後疼痛(CPIP)の動物モデルを確立するためのステップを詳しく説明するプロトコルです。これは、ヒト複合局所疼痛症候群タイプIを模倣したよく知っているモデルである。機械的および熱過敏症はさらに評価され、CPIPラットモデルで観察されるカプサイシン誘発性ノシフェンシブ挙動も評価される。

要約

複雑な局所疼痛症候群I型(CRPS-I)は、患者の間で激しい痛みを引き起こし、未解決の病状のままである神経疾患である。しかし、CRPS-Iの根本的なメカニズムはまだ明らかになっていません。虚血/再灌流はCRPS-Iを引き起こす主要な要因の一つであることが知られている。後肢の長引虚血および再灌流によって、ラット慢性虚血後疼痛(CPIP)モデルはCRPS-Iを模倣するために確立された。CPIPモデルは、CRPS-Iのメカニズムを研究するためのよく知られる動物モデルとなっています。このプロトコルは、麻酔を含むCPIPのラットモデルの確立に関連する詳細な手順を記述し、続いて後肢の虚血/再灌流を記述する。ラットCPIPモデルの特性は、後肢の機械的および熱過敏症ならびに急性カプサイシン注射に対する陰性応答を測定することによってさらに評価される。ラットCPIPモデルは、確立後の初期段階で後肢浮腫および充血を含むいくつかのCRPS-I様症状を示し、持続的な熱および機械的過敏症、および急性カプサイシン注射に対する陰性応答の増加を示す。これらの特性は、CRPS-Iに関与するメカニズムのさらなる調査のための適切な動物モデルをレンダリングします。

概要

複雑な局所疼痛症候群(CRPS)は、骨折、外傷、外科手術、虚血または神経損傷に起因する複雑および慢性疼痛症状を非難する1、2、3である。CRPS は、CRPS タイプ I とタイプ II (CRPS-I および CRPS-II)4の 2 つのサブカテゴリに分類されます。疫学的研究は、CRPSの有病率が約1:20005であることを明らかにしました.明らかな神経損傷を示さないCRPS-Iは、慢性的な痛みを引き起こし、患者の生活の質に劇的に影響を与える可能性があります。現在利用可能な治療法は、不十分な治療効果を示す。したがって、CRPS-Iは依然として対処が必要な重要かつ困難な臨床問題であり続ける。

CRPS-Iを模倣する前臨床動物モデルを確立することは、CRPS-Iの根底にあるメカニズムを探求するために重要である。この問題に対処するために、Coderre et al. は、CRPS-I6を再現するために、長引く虚血と後肢への再灌流を適用してラット モデルを設計しました。虚血/再灌流傷害はCRPS-I7の主な原因の一つであることが知られている。ラットCPIPモデルは、モデル確立後の初期段階で後肢浮腫および充血を含む多くのCRPS-I様症状を示し、その後、持続的な熱および機械的過敏症6を示す。このモデルからの援助により、中枢疼痛感作、末梢TRPA1チャネル活性化および活性酸素種生成等がCRPS-I8、9、10に寄与することが提案されている。我々は最近、CPIPラットモデルを確立し、影響を受けた後足11を内因とする後根神経節(DRGs)のRNAシーケンシングを行った。CRPS-I11の疼痛過敏症の媒使用に関与している可能性のあるいくつかの潜在的なメカニズムを発見した。我々はさらに、CRPS-I12の機械的および熱過敏症に対する重要な寄与点としてDRGニューロンにおける一過性受容体電位バニロイド1(TRPV1)チャネルを同定した。

本研究では、CPIPのラットモデルの確立に関わる詳細な手順について述べた。さらに、機械的および熱的過敏症と急性カプサイシンチャレンジに対する応答性を測定することにより、ラットCPIPモデルを評価しました。我々は、ラットCPIPモデルがCRPS-Iに関与するメカニズムのさらなる調査のための信頼性の高い動物モデルであることができることを提案する。

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プロトコル

動物のプロトコルは浙江省医科大学動物倫理委員会によって承認されました。

1. 動物

  1. 上海実験動物センターから雄のスプレイグ・ドーリー(SD)ラット(280~320g、8~10週齢)を入手してください。浙江省中国医科大学研究所動物センターに動物を収容する。繁殖条件は、12時間/2時間の光/暗いサイクルを含め、温度を24°Cに保つ必要があることに注意してください。水と食べ物の広告リビタムを提供します。この研究では、合計48匹のラットが使用されることに注意してください。1 つの注意点として、このモデルでは、プロセス全体の間に痛みの応答を観察する必要があります。鎮痛薬が適用されている場合、痛みのモデルを正常に確立することはできません。実験の後、ラットは犠牲にされる。

2. CPIPモデルの確立

  1. フェノバルビタールナトリウム(50mg/kg、腹腔内注射[i.p.])ですべてのラット(シャムおよびCPIPモデル群を含む)を麻酔する。必要に応じて、最大 20 mg/kg/h フェノバルビタール [i.p.] で麻酔を維持します。鉗子を使用して後足または尾先をつまむことによって、各動物の反射神経を確認します。モデルの確立前にラットが反応しないことを確認します。処置の間に乾燥を避けるために目に獣医軟膏を置く。麻酔ラットを37°Cに維持した加熱パッドの上に置き、以下の手順を行う。
  2. 後足の虚血と再灌流
    1. ラットが麻酔されたら、右後足と足首をグリセロールで潤滑します。
    2. ニトリル70デュロメーターOリングを7/32インチ(5.5mm)の内径で1.5 mLエッペンドルフチューブの大きな側面にスライドさせます(使用前にスナップキャップを切断します)。下に達するまで、後足を中空のエッペンドルフチューブに慎重に挿入します。
    3. チューブから右後肢に徐々にOリングをスライドさせ、3時間の間、ラットのシャムグループに同じ治療を適用しますが、壊れたOリングは切断され、虚血を誘発してはならないが、足首の周りに置く必要があります。
    4. 虚血ステップの後、Oリング3時間を切り落とします。それは胸骨の残り不調を維持するのに十分な意識が回復するまで、慎重にラットを見てください。麻酔を受けたラットは、完全に回復するまで他のラットの会社に戻してはならないことに注意してください。

3. 網膜行動検査

  1. メッシュの床に座っている透明なプレキシグラスチャンバーにラットを置きます。行動テストの前に0.5時間ラットを習慣化する。
  2. メカニカルアロディニア
    1. テストにはフォン・フレイフィラメント(0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0、26.0 gフィラメント)を使用します。中央フィラメント(4.0 g)から試験を開始します。後足の中央足底面にフィラメントを垂直に塗布します。わずかに5 sまでフィラメントを曲げるために適切な力を適用します。刺激に応答して後足の突然の引き込みは、ノシフェンシブな行動と考えられています。-3、-2、-1、および13日目まで1日おきに機械的アロディニア試験を実施します。
    2. アップダウン テスト方法を適用して、しきい値をテストします。50%の足引き出し閾値(PWT)13、14、15を計算するためのDixon法を適用します。
  3. 熱性過痛症
    1. ハーグリーブス法を使用して熱性過痛を調べる。電球(50 W)から後足に放出される光線を直接目指して、足の引き出し遅延(PWL)を測定します。20 s をカットオフしきい値として設定し、加熱による過度の損傷を避けます。
    2. 各後足ごとに、各テスト 3x を 5 分間隔で繰り返します。各ラット16のPWLとしてこれらの3つのテストの平均を取る.-3、-2、-1、および13日目まで1日おきに熱過痛試験を実施します。
  4. カプサイシン誘発性急性病巣行動
    1. ジメチルスルホキシド(DMSO)を用いてカプサイシン原液(200mM)を調製し、さらに1:1000に希釈し、後足注入のために滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を希釈する。PBSの最終的なDMSO濃度は0.1%です(車両はPBSのみで0.1%DMSOを含んでいます)。カプサイシンまたは車両を、1 mLシリンジに取り付けた30G針を使用して、50μLの体積で後足(足内注射)に注入します。
    2. 注射直後の10分間ビデオカメラを用いて、陰気な挙動(すなわち、注射された足の舐め、噛み付き、ひるみ)を記録し、その後17、18、19に従って定量する。
  5. 後足浮腫評価:足径の増加を測定して後足浮腫を評価する。デジタルキャリパーで測定し、異なる時点で観測された基底値と検定値の差を計算します。モデルの確立後、15分、24時間、48時間、72時間で足の厚さの変化を評価します。

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結果

足首にOリングを置いた後、イプシラテラル後足皮膚はチアノーゼ、組織低酸素症の徴候を示した(図1A)。Oリングを切断した後、イプシラテラル後足は血液で満たされ始め、強い腫脹を示し、高血症の強烈な徴候を示した(図1A)。足の腫脹は徐々に減少し、虚血/再灌流手順の後に正常な48時間に戻った(シダックポストホック試験を伴う双方向ANOVA、図1B)。これらの兆候はすべて、以前の研究6、12と一致しています。

次いで、機械的アロディニアをフォンフレイ毛髪試験を用いて測定した。CPIP群のイプシラテラル後足は、シャム群と比較してモデル設立の1日後に明らかな機械的アロディニアを示した。イプシラテラル後足...

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ディスカッション

このプロトコルは、ラットの後肢に虚血/再灌流を適用することによってラットCPIPモデルを確立するための詳細な方法を記述する。これは、カプサイシン注射に応答して、後肢の外観、浮腫、機械的/熱過敏症、および急性のノシフェンシブ挙動の評価を含む。

四肢虚血/再灌流は、ヒト患者12におけるCRPS-Iに寄与する一般的な因子である。このプロトコルは、ヒトCRPS-I6を再現するために一般的に使用される動物モデルであるラットCPIPモデルを確立する方法を記述する。虚血は、麻酔下で3時間足首に適用されたタイトなOリングでラットの後肢に誘発された。Oリングを取り除き、再灌流が起こった。モデルの確立後、CPIPモデルラットは、後肢に早期充血と浮腫を発症した。このモデルには、持続的な機械的/熱過敏症を含む神経因性疼痛の挙動も表示されます。これらの症状はすべて、ヒトCRPS-I 21の典型的な特徴を模倣する。

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開示事項

著者らは、この作品に対する利益相反を宣言しない。

謝辞

このプロジェクトは、中国国立自然科学財団(81873365および81603676)、浙江省自然科学優れた若手学者のための基金(LR17H270001)、浙江中国医科大学の研究資金によって後援されました。Q2019J01, 2018ZY37, 2018ZY19)

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 ml エッペンドルフ チューブエッペンドルフ22431021
DMSOシグマ アルドリッチD1435
カプサイシンAPEXBIOA3278
デジタル ノギスMeinaiteNA
O リングO リング ウエストニトリル 70 デュロメーター7/32 in.
内径
足底試験装置UGOバジーレ、イタリア37370
フォン フレイ フィラメントUGO バジーレ、イタリアNC12775

参考文献

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