細胞外小胞体のカエノールハブディティス・エレガンスの精製と分析

サマリー

この記事では、カエノハブディティス・エレガンス細胞外小胞を生成、精製、定量化する方法について説明します。

要約

小さな膜結合小胞を外部環境に分泌することは、すべての細胞の基本的な生理学的プロセスである。これらの細胞外小胞(EV)は細胞外で機能し、組織間でタンパク質、核酸、代謝産物、脂質を移動させることによって、全球の生理学的プロセスを調節します。EVは、原産細胞の生理学的状態を反映しています。EVは、人間の健康のほぼすべての側面に基本的な役割を果たしていることを意味します。このように、EVタンパク質や遺伝子貨物は、健康や病気のバイオマーカーについて分析を進めています。しかし、EV分野には、EV貨物組成の研究を可能にする難解な無脊椎動物モデルシステムが依然として欠けている。C.エレガンスは、身体外のEVを積極的に外部環境に分泌し、ファシリティの分離を可能にするため、EV研究に適しています。この記事では、非常に多くの年齢同期ワームの集団で定量的に作業する方法、EVの浄化、精製されたサンプル中の無傷のEVの数を直接測定するフローサイトメトリープロトコルなど、これらの環境的に分泌されたC.エレガンスEVを生成、浄化、定量化するために必要なすべての情報を提供します。したがって、C.エレガンス研究に利用可能な遺伝子試薬の大規模なライブラリは、EV貨物組成に対する遺伝的経路および生理学的プロセスの影響を調査するためにタップすることができます。

概要

膜結合細胞外小胞(EV)の分泌は、細胞^間で特定のタンパク質、核酸、代謝産物、および脂質貨物を積極的に輸送することにより、世界の生理学的プロセスを促進する。細胞は、2μm以上から^20nm2の小さなものまで、連続したサイズに及ぶEVを分泌する。小さなEV (<200 nm) は、代謝障害、癌、心血管疾患、および神経変性疾患^{33、4、54,5}を含む病理学的プロセスにおけるその影響のためにますます研究されています。これらの病理はまた、小さなEVのEV貨物のタンパク質および遺伝的組成に影響を与えることを示されている。したがって、LC-MS-MSおよびRNAseq^,66、7、8、9などのEV貨物発見方法によって、病理のバイオマーカーシグネチャがますます明らかになってきて^8,います。^,7

C.エレガンスは、進化的に保存されたEVシグナル伝達経路を同定するための有用な無脊椎動物モデルであった。例えば、C.エレガンスフリッパーゼは、最初にC.エレガンス胚におけるEV生物形成を誘導することが示され、ヒト同族体はヒト細胞^10,11,11におけるEV放出に影響を与えることを示した。C.エレガンスEVは、キューティクルの開発に必要なヘッジホッグ信号を運ぶことが報告されました。ヘッジホッグおよび他のモルフォゲンの送達はEVの主要な発達的役割を果たすることが示され、そして、それはゼブラフィッシュ、マウス、およびヒト^{12、13、14、15,14,15}で保存される。^12,C.エレガンスは、動物と動物のコミュニケーション^16、17で機能する体外のEVを分泌するため^、EV17バイオマーカー発見に適している(図1A)。しかし、線虫の大腸菌源も^EV18を分泌するため、以前の研究を通じて確立された方法論は使用できません。この方法では、サンプルの大部分は大腸菌汚染で構成され、C.エレガンスEV貨物の発見に対するプロテオミクスまたはRNAEqアプローチの力を制限する。ここで説明する方法は、典型的な細胞培養実験の特徴を豊富なレベルで非常に純粋なC.エレガンスEVを生成し、EVバイオマーカー発見のためのオミックスアプローチを促進するために開発された。

貨物分析のために十分な数のEVを生成するには、ワームの集団が多く必要です。そのため、発達的に同期したC.エレガンスの大量集団の定量栽培を行う方法も含まれる。通常、実験に多数のワームが必要な場合、それらは液体培地で培養される。これは、ワームの集団を大量に生成するのに有効であるが、動物の生理学は、線虫増殖培地(NGM)寒天プレート上の標準的な条件下で栽培されたワームとはかなり異なる。液体中で培養された動物は、よりゆっくりと成長し、より薄く、発達的不均一性を示し、そして高い程度のバッチ変動を受ける。そこで、10cm高成長プレートを用いた発達的に同期したC.エレガンスの大量集団の定量栽培に対する簡便かつ有効な方法を提示する。高成長プレートのメディア構成は、通常のNGMプレートよりも多くのペプトンを含み、OP50よりも堅牢に成長する大腸菌株NA22で播種されています。

フローサイトメトリー技術(FACS)の進歩により、個々の^EV20,21の直接分析が可能になり^、21他の方法に固有の制限なしにEVを定量化することが可能になりました。以前の研究では、異なる精製方法論が有意に異なるEV-タンパク質比²²をもたらすため、タンパク質はEVの豊富さにとって有用なプロキシではないことを示している。非常に純粋なEV画分は比較的少ないタンパク質を含み、BCAまたはクマシーゲルでサンプルを定量することは困難です。西洋の分析では、個々のタンパク質の相対的な違いを特定できますが、サンプル内のEVの数を特定することはできません。ナノ粒子追跡解析によるEV数の堅牢な定量は、その狭い信号対雑音範囲、EVと固体凝集体を区別できないこと、および異^{なる仕様を}有する機器間の方法の伝達性の欠如によって妨げられる。したがって、この記事には、EV を識別および定量化するための一般化可能なフロー サイトメトリック手順も含まれています。

プロトコル

1. 準備

1. ゼラチン2gを100mLの_dH2Oに加え、沸騰し始めるまで電子レンジで加熱します。その後、かき混ぜて20分間冷まします。
2. 0.22 μmフィルターを通して溶液を渡し、滅菌チューブに分配します。使用の直前にゼラチンを使用してピペットチップを治療し、ゼラチン溶液を排出します。処理されたヒントは、すぐに使用するか、保存することができます。
3. 無菌キャップフィルターから膜を切り取ります。
4. 5 μmナイロンメッシュ生地の20 cmの正方形を濡らし、滅菌キャップフィルターの上部の周りに置きます。いくつかの厚いゴムバンドでそれを固定します。
   注意: 折り目がないことを確認するために、慎重に生地を調べます。これらは吸引を妨げる空気ギャップを作る。

2. ワームの集団を大量に計算する(図1A)

1. ウォーム懸濁液のボルテックスおよびピペット10μLを、ワーム栽培プレート蓋またはガラススライド上に取り付ける。このプロセスを 3x を繰り返します。各ドロップ内の動物の数を記録します。
2. 1 μLあたり2匹の動物にワームサスペンションを調整します。
3. スライドまたはプレートの蓋に懸濁液とピペット9滴(10μL)を渦。手動で動物の数を数えます。各ドロップ内の動物の数を記録します。
4. 各ワームの母集団に対する割合として、平均値(S.E.M.)の平均誤差と標準誤差を計算します。
5. 各集団の動物の総数を計算するには、平均値を10 μLで割り、μLでワーム懸濁液の総量を掛けます。

図1:C.エレガンスEVの生成、定量、精製のための手順の概要(A) 動物の集団を多く数える略図。(B) EV の収穫のためのワーム生成の概略図。(C) C.エレガンススーパーナテントからのEVを浄化するための回路図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

3. EV精製のためのC.エレガンスの育成

1. 発達的に同期したC.エレガンスの大規模な人口を生成します。これを行うには、次の手順に従います。
   1. 6 cmの正常な成長媒体の版の単一の動物を加える。2世代のインキュベートし、2つの高成長培地プレートに動物を洗浄します。
   2. ワームが食物を使い果たすまでインキュベートする。
   3. ステップ1.4で調製した5 μmナイロンメッシュを用いたフィルターL1ワーム。滅菌ボトルにスクリューキャップを置き、真空を開始し、フィルターの上にワームを注ぎます。フィルタ上のワーム集約上で、同じメディアのボリュームを渡します。
   4. ワームを定量化し、合計数を計算します(手順 2 を参照)。最近、飢えた(<24 h)ワームが高成長プレート上で増殖し、約80,000匹のL1幼虫が生じる。
   5. 遠心分離機L1幼虫は2,000xggで3分間、1mLあたり約10万匹の動物に再中断する。
   6. 高成長プレートあたり〜50,000匹の動物を配置します。彼らはグラビド大人になるまで20°Cで動物を栽培(約72時間)。
   7. 標準的な手段でグラビッド成人を漂白し、胚が2.5 μg/mLコレステロールでS基底溶液の10 mLで孵化することを可能にする。
   8. L1幼虫を定量化し(ステップ2を参照)、各高成長プレートに50,000個のワームを追加します。
   9. 動物が若年成人になるまで20°Cでプレートを栽培する。
2. セプチオム世代のためにC.エレガンスを準備します。
   1. 50 μg/mL カルベニシリンを用いた 15 mL の無菌 M9 を各高成長プレートに加えて、プレートからワームを洗浄します。飽和プレートを5分間座らせます。スロッシングは避けてください。各プレートから別の 50 mL 円錐管にバッファーを注ぎます。洗浄ステップを2倍にして、プレート当たり合計45mLのバッファーを繰り返します。
   2. ワームは15分間落ち着き、上清をデカントし、50 mLの新鮮なM9バッファーをチューブに加えます。合計 4 倍の操作を繰り返します。
   3. 30%ショ糖ステップ勾配の上にワームを浮かべ、S基底溶液²⁴で動物を回復する。
      1. 15 mLの氷冷100mM NaClでワームを一時的に再中断し、15 mLの氷冷60%スクロースを加え、反転して混合します。ガラスピペットを使用すると、スクロース混合物の上部に氷冷100 mM NaClの5 mLを穏やかに重ねます。
      2. 1,500 x gで 5 分間の遠心分離機 は、NaCl とスクロースの間のインターフェイスに集中します。
      3. 新しい50 mL円錐形の管にインターフェイスから動物を静かにピペット。S基底溶液を50 mLに追加します。ワームが5分を落ち着かせる。
      4. 上清をデカントし、S基底溶液の新鮮な50 mLを追加します。これを少なくとも3倍繰り返します。
   4. ステップ 2 で説明したとおりに、ワームの数を定量化します。
   5. コレステロール2.5μg/mLと50μMのカルベニシリンを含む滅菌S基底溶液を用いて、1μL当たり1匹の動物の密度にワームを再懸濁します。
   6. 分泌物の生成のためにサンプルを準備するには、滅菌2 L底バッフルフラスコに懸濁液の最大400 mLを追加します。
   7. 20°Cインキュベーターで200rpmで24時間、円形の回転子にフラスコを置きます。

4. EV精製

1. 収穫と分画
   1. インキュベーターから2Lフラスコを取り出し、動物を50mLの円錐バイアル(500 x g2分間)でペレットします。
   2. 0.22 μm真空フィルターを通して上澄みを注ぎ、粒子状の破片を取り除きます。
      注:この時点で、分泌物と小胞を含む濾過上清は-80°Cで保存することができます。
   3. ステップ2で説明した動物の数を数える。
   4. 細菌の芝生に懸濁されたワームの一滴を置くことによって、ワームの生存率を決定します。15分待ってから、動いたり、麻痺したり、死んだりして動物を得点します。
   5. 再生ニトロセルロース10 kDaフィルタユニットを使用して、0.22 μmの濾過上清を700 μLに濃縮します。150 μL S 基底溶液を加え、フィルターと渦の上にピペットを加えます。2x を繰り返します。
   6. 4°Cで20分間18,000xgで濃縮上 g清を遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。この手順により、取り扱い中に蓄積された可能性のある破片や大きなパーティクルが除去されます。
   7. プロテアーゼ阻害剤カクテル+EDTAをメーカーの指示に従って追加します。
      注:この時点で、分泌液と小胞を含む濃縮上清は-80°Cで保存することができます。
2. サイズ除外クロマトグラフィー
   1. 80~200 μm のアガロース樹脂(球状タンパク質用の孔径分画範囲70,000 ~40,000,000 kDa)を空の重力流カラムカートリッジに注ぎます。フローS基底液は、樹脂のベッドが10 mLの最終容積で詰まるまで。
      注:列カートリッジに樹脂を注ぎ過ぎる場合は、カラムの上部を分散させ、ピペットで余分なものを取り除きます。
   2. 40 mLの無菌濾過S基底溶液をカラムを通して通過させ、重力下で流れさせます。
      注意: 樹脂が乱れていないことを確認してください。
   3. 樹脂の上部が水没しないまでバッファを流し、カラムカートリッジの底部にキャップします。柱の下にコレクション チューブを配置します。
   4. カートリッジに付けたキャップを取り外します。ステップ2.1で得られた濃縮分泌物をカラムベッドの上部に滴下して追加します。ピペット1 mLのS基底溶液ドロップワイズ。カラムの下に新鮮なコレクションチューブを置きます。
   5. 樹脂を乱さないため、上部カラムのリザーバに5 mL S基底液をゆっくりと充填します。溶出液の最初の2 mLを収集し、すぐにチューブを変更し、次の4 mLを収集します。これは、EV 用に付加される分数です。
   6. 再生したニトロセルロース10kDa分子量を遮断した(MWCO)フィルターで溶離液を300μLに濃縮し、低結合マイクロ遠心分離管にリテンテートを移管する。
   7. S基底溶液100 μLでフィルター膜2xを洗浄し、20 sのボルテックスを行い、フィルター全体にバッファーをピペット処理します。最終ボリューム 500 μL の初期サンプルに追加します。
   8. メーカーの指示に従ってプロテアーゼ阻害剤カクテルを追加します。
   9. 下流の実験(RNAseq、LC-MS、GC-MS-MS、ウェスタン、FACSなど)を直ちに行うか、-80°Cで保管してください。

5. EVの豊富さのフローサイトメトリー定量化

1. 染料調製
   1. 新鮮なDMSOを使用してDI-8-ANEPPSの10 mMストックを準備します。10 μL アリコートに配布し、-20 °Cで保管してください。
   2. 90 μLの無菌濾過PBSを10 μLの染料ストックを持つチューブに加えて、1 mMの作業ソリューションを準備します。
2. 実験サンプル調製
   1. 840 μL の S 基底溶液をマイクロ遠心分離チューブに加えます。その後、セクション4.2と渦で生成された精製EVの60μLを加えます。
   2. サンプルのアリコート300 μLを2つの新しいマイクロ遠心チューブに取り込んだ。300 μLの希釈EVを含む3本のチューブの実験セットが、現在あります。チューブにラベルを#1-3.サンプル#2に、#35.1.2で調製したDI-8-ANEPPSストックの7 μLを追加します。その後、1%トリトンX 100の7μLをチューブ#3に加えます。各チューブを渦で混ぜます。
   3. 超音波処理サンプル#3、超音波処理器の先端をサンプルの中央に配置し、20%の電力30%デューティサイクルで10回脈動します。
      注意:発泡器の生成が最小限に抑えられるように、超音波器プローブの先端がサンプルの真ん中にあることを確認してください。フォームは、EV を集約させることによってサンプルを損なう可能性があります。
   4. S基底溶液300μLを2本のマイクロ遠心チューブに加えます。ステップ5.1で調製したDI-8-ANNEPS作動試薬の7μLを第2のチューブに加え、ラベル「染料のみ」にします。他のチューブに「バッファのみ」というラベルを付けます。
      注: 同じ S 基底ソースを使用して、色素のみおよびバッファーのみ制御サンプルと実験サンプルを準備します。
   5. 直接光から離れて、室温で1時間、サンプルをインキュベートします。
3. FACS 実験を実施します。
   1. FACS励起フィルタを488 nm(青)に、エミッションフィルタを605 nm(オレンジ)に設定します。流量を1分あたり1.5μLに設定します。
   2. ナノビーズ FACS キャリブレーション ミックスを実行します (オプションですが推奨)。
   3. FACS マシン上で各サンプルを 3 分 (180 s) 実行します。正確な実行時間を秒単位で書き留めます。
4. FACS データを分析します。
   1. FACS 解析ソフトウェアでファイルを開きます。
   2. [軸] をクリックして Y 軸を488 組織 (エリア)に切り替えます。
   3. SALS レベル 10²から 10⁴ (<300 nm サイズのパーティクル) に及ぶ、プロットの上部から始まる長方形のゲートを設定します。ゲートのイベント全体の 2.5% が含まれるまでゲートを下方まで延長します。ゲートに「DI-8-ANEPPS+」イベントの名前を付けます。
5. サンプルEVの量の定量化
   1. このゲートをコピーして、実験セットの他の 2 つのサンプルと[バッファーのみ]および[仕分けのみ]コントロールに貼り付けます。分析をスプレッドシートにエクスポートします。
   2. 推奨される 3 分 (180 秒) に FACS サンプルを実行しなかった場合は、サンプル内のすべてのイベント カウントを 180 秒あたりのイベントに正規化します。例えば、サンプルが 250 s で実行された場合、DI-8-ANEPPS+ イベント番号は 250 s/180 s でスケールされます。
   3. サンプル#2の DI-8-ANEPPS+ コントロールの DI-8-ANEPPS+ イベント数を減算して、色素バックグラウンド イベントを削除します。
   4. サンプル #1の DI-8-ANEPPS+ イベントの数を減算して、アイソタイプバックグラウンド イベントを削除します。
   5. サンプル#3の DI-8-ANEPPS+ イベントの数を減算して、洗剤に依存しないイベントを除去します。この値は、ボナ・フィデスのEVの数です。
   6. サンプルの1μL内のEVの数を、ステップ5.5.5で計算した値をμLで分析した体積(ステップ5.3で分析した4.5 μL)で割り、希釈係数(ステップ2.5で説明した10倍)で乗算することで計算します。この値に、EV 準備の残りの μL 数を掛けます。これは、ダウンストリーム解析に使用できる EV の数です。

図2:EVの存在量を定量するフローサイトメトリーサンプル調製の概略図。(A)EV製剤は、3つの同一のサンプルに分かれています。サンプル#1は、染料なし陰性対照です。その後、DI-8-ANEPPSをサンプル#2に添加し、#3します。トリトン-X 100は、サンプル#3に追加されます。緑色の矢印は、サンプル#3だけがその後超音波処理されることを示します。フローからのデータは、FACS サンプル内の洗剤に敏感な EV の絶対数を決定し、合計準備で EV の量を計算するのに役立ちます。色素陽性事象を決定するためのゲートは、染料を含みないサンプル#1で設定されます。スプレッドシートデータに赤で書き込むのは、洗剤処理サンプルからの色素陽性事象が色素でサンプルから差し引かれることを示す。(B) FACS で EV を定量化し、サンプル内の EV の総数を計算するための方程式。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

結果

図1に、EV の生成と浄化に必要なプロセスの概略図を示します。各ステップを完了するために必要な典型的な時間は、下に示されています。図2は、DI-8-ANEPPSを用いたFACS解析用サンプルの準備の概略図(図2A)と、サンプル中のEVの総数を推定するのに必要な計算を示しています(図2B)。

10の生物学的複製からの代表的な結果は、図3Aに示されている。反復間の変動性は有意ではなく、母集団サイズの典型的なS.E.M.は10%を少し超えている(図3B)。ワームをフィルタリングし、新鮮な高成長プレート上で栽培することは、漂白剤の同期に適したグラビッド成人の大規模な集団を生成します。この方法で処理された単一の飢えたプレートは、各グラビッド成人が約10個の卵を含むため、1 x 10⁶以上の同期性のある子孫の実験集団を生成することができます。40μmのフィルターを通して卵と幼虫を濾過し、古い動物からEVを得ることで、発達的に同期した集団の集団を大量に維持することが可能です。保持された成人は、1プレートあたり20,000匹の動物の密度で新鮮な高成長プレートに移されます。このプロセスは2日ごとに繰り返した。図3Cは、3つのプレート移動を介して移動されるワーム集団の3つの生物学的複製を示す。プレート間で動物を移動すると、動物の約10%の損失(図3C)が生じ、動物の約20%がスクロース浮揚工程で失われる(図3D)。

図3:EV分析のためのC.エレガンスの大規模な集団の定量化。(A) 最近飢えた単一の高成長プレート(<24時間)から分離されたL1幼虫の数の比較。10個の生物学的複製の各値がプロットされる。10個の反復のすべてのデータポイントの合計は、S.E.M.のバイオリンプロットとバーとしても提示されます。これは、最近飢えたワームの単一プレートが約80,000 L1幼虫段階ワームをもたらすことを示しています。(B) パネルAにおける15種類のプレート母集団測定値のS.E.M.を個別の点としてプロットした。一般的に、S.E.M.は10%よりわずかに大きい。(C) 4時間ごとにプレート間の2回の移動の後に、ワーム集団の3つの生物学的複製が推定された。プレート間の動物のこの移動は、人口規模の有意な減少をもたらさなかった。これは、ここで示すワームの移動方法論が動物の著しい損失をもたらさないことを示している。(D)3つのEV実験複製の過程で採取された集団測定:実験を開始した元のL1幼虫について推定された動物の数、ショ糖フロートから回収された若年成動物の数と24時間の潜伏期間の準備ができて、分泌物の回収時にEV調製から数えられる動物の数。L1幼虫期の最初の集団推定と、後に動物が若年成人である場合の人口規模の減少は小さいが有意ではない。平均L1母集団測定は100%と指定され、他のすべての測定値はこの値との関係によってスケーリングされた。誤差範囲 S.E.M. * = p 値 < 0.05, N.S. = パラメトリックペア t 検定では有意ではありません。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

タンパク質対動物比は、EV製剤を特徴付ける際に有用な指標です。このメトリックは、EV 準備の整合性を迅速に判断する手段を提供します。平均して、1,000匹の野生型の若年成動物が、10kDaを超えるタンパク質を1μg分泌して環境に入れる(図4A)。この分画がサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに分離されると、全タンパク質溶出プロファイルは、2〜6 mLと8 mL後の大きなピークとの間の小さなタンパク質ピークを示す。EV は、カラム溶出部の最初の 5 mL に含まれています (図 4B)。ナノ粒子追跡解析は、カラム溶出物の最初の5mLが、小さい~150nmのEVの単分散集団を含んでいる(図4C)。サイズ排除画の透過電子顕微鏡は、2~6 mLの溶出量に豊富なEVを明らかにしますが、後の溶出量には存在しません。EVはカップ状の形状で知られているため、負の染色条件下で調製すると明るいドットを穿刺して現れる固体粒子を区別しやすくなる(図4D)。

図4:全分泌バイオマスからのC.エレガンスEVの精製(A)10kDaを超える全タンパク質と、10個の生物学的複製の調製物でインキュベートされたワームの数に対する比率をプロットした。ほとんどの調製物は1,000匹の動物につき1μgのタンパク質を含んでいた。(B)10mL樹脂カラムからタンパク質溶出プロファイルを1mLの濃縮分泌物を装填した。Bさらなる解析で統合された分数は、グループにシェーディングされます。(C)連結樹脂溶出画分2~6mLのナノ粒子追跡解析95% 信頼区間はグレーシェーディングされます。(D)連結樹脂溶出画分のTEM分析。出発物質は、小胞様粒子と非ベシクル粒子の両方を持っていた。統合された2〜6 mL溶出分画は、非ベシクル粒子の少ない小胞に富んでいた。7~11 mLの連結画分には、小胞のような粒子はほとんど含まれなかったが、多くの非ベシクル粒子が含まれていた。12~15 mL溶出画分には、非ベシクル粒子のみが含まれていました。すべての顕微鏡写真は同じ倍率で示されます。スケール バー = 200 nm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

C.エレガンスとヒトEVのフローサイトメトリー特性を直接比較するために、この方法でヒトニューロンの細胞培養の条件付き培地からEVを精製しました。フローサイトメトリーは、光散乱に基づいて粒子を分離します。小角光散乱(SALS)は大きさと大きく相関し、長角光散乱(LALS)は膜内部構造と相関します。細胞培養とC.エレガンスの両方のEV製剤からのサンプルイベントの大部分は、10³ SALSと10⁴ LALSを中心としたクラスターにしっかりと焦点を当てています(図5A)。SALSによってソートされたC.エレガンスEVサンプルイベントのヒストグラムは、すべての準備が〜10³でピークに達することを示しています(図5B)。

図5:C.エレガンスEVは、光散乱特性によって明確に定義されています。(A) C. エレガンス EV の 3 つの生物学的複製における SALS イベントのヒストグラム。サンプルイベント全体の80%は、厳密で明確に定義された母集団内に含まれています。ナノ粒子追跡解析と同様に、C.エレガンスEVのサイズ分布が単分散であることを示す。サンプルを希釈するために使用されるS基底バッファーのヒストグラムを比較のために示します。(B) このテキストに記載されている方法で精製されたC.エレガンスとヒト細胞培養EVの屈折特性の比較両方のEVタイプは、一貫して同等の短い光散乱分布(SALSおよびLALS)を提示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

DI-8-ANEPPSはC.エレガンスEVに堅牢なラベルを付け、C.エレガンスと細胞培養由来サンプルの両方でイベント全体の大半を一貫して強調しています。キャリブレーション用のビーズとコントロールは、図 6Aに示されています。個々のFACS散布図は、200,000匹(#1)から調製されたC.エレガンスサンプルと500,000匹の動物から2匹を調製した(図6B)から示されている。細胞培養の100mL(#1)または200mL(#2,3)のいずれかからEVも分析した(図6C)。C.エレガンスおよび細胞培養由来サンプルの両方は、0.05%Triton-X 100と光超音波処理で処理すると消失する豊富な蛍光事象を示した。これは、標識された事象が、洗剤非感受性固体リポタンパク質凝集体ではなく、洗浄剤不安定リン脂質構造(小胞)であることを示している。EVの豊富さは、ディ-8-ANEPPS+ゲートのイベント数と、洗剤なしの分数(-)と洗剤(+)から染料専用制御の事象を差し引いた差の差として計算されます。わかりやすくするために、図 6Bおよび図 6Cに個別に示されているデータは、図 6Dおよび図 6Eの棒グラフとして要約されています。 Figure 6精製されたEVの存在量は、C.エレガンスと細胞培養由来製剤との間で有意に異ならなかった(図6F)。

図6:EVの豊富量を計算するために使用されるフローサイトメトリーデータの例(A) サンプル間でイベント数を直接比較できるようにするには、バッファーのみとバッファーおよび仕分けのみコントロールを、EV サンプルの端数と同じ流量および収集時間で実行する必要があります。DI-8-ANEPPS ゲートにはイベントが非常に少ないです。(B) C.エレガンスのDI-8-ANEPPSおよび洗剤処理プロトコルの代表的な結果。3つの生物学的複製が示される。生物学的複製#1は20万匹の動物から調製され、#2および#3は50万匹の動物から調製された。洗剤処理によるEVの消失は、すべてのケースで明らかです。(C)ヒト細胞培養条件培地を用いたDI-8-ANEPPSおよび洗浄剤処理プロトコルの代表的な結果。生物学的複製#1および#2は、100mLから生物学的複製#3を調製しながら、200mLのコンディションされた培地から調製した。(D) C. エレガンス EV の 3 つの生物学的複製から収集されたデータの棒グラフ。誤差範囲 = S.E.M. 治療間の両側t検定を組み合わせた。= p 値 < 0.001(E)細胞培養由来EVの3つの生物学的複製から収集されたデータの棒グラフ。治療間のペアの両側t検定。= p値 < 0.001 (F) μL当たりの染色標識洗浄剤感受性事象の数を、C.エレガンスおよび細胞培養のすべての生物学的複製について計算した。2 つの EV サンプル ソース間の値は、大きく異なっていません。治療間のペアの両側t検定p値 = 0.685。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表1は、分析した各サンプルタイプの4.5μL全体の生の実験値を示しています。50万匹の動物から精製されたEV画分から収集されたイベントの総数は、バッファだけで収集された粒子の背景数に対して10〜20倍であったのに対し、20万匹の動物から精製された分画にはバッファだけで約2倍のイベントが含まれていました。DI-8-ANEPPS+ ゲート内のイベント数も、各サンプルに示されます。これらのメトリックをスプレッドシートにインポートして、上記のように色素正の洗剤に敏感な EV の数を計算できます。例えば、示された最初のC.エレガンス生物学的複製の1mLのEVの数は、次のように計算されます。

(18,974 – 3,853 - 1,487) x (10/4.5) x 1,000 = 30,297,778.

表1:タブ状フローサイトメトリーデータ。図 6に示すデータは、スプレッドシートとして表示されます。各サンプルについて、合計イベントと DI-8-ANEPPS+ ゲートイベントが表示されます。各生物学的複製は、プロトコル内のサンプル#1-3の順序で配列されます。これらの指標は、50万匹の動物または200mLの細胞培養条件培地から調製されたC.エレガンスサンプルから収集されたイベントの総数が、緩衝液単独で収集された粒子のバックグラウンド数に対して10〜20倍であったのに対し、20万匹の動物から精製された生物学的複製にはバッファの合計イベントの約2倍が含まれていることを明らかにした。DI-8-ANEPPS+ ゲート内のイベント数も、各サンプルに示されます。これらのメトリックをスプレッドシートにエクスポートして、EV の総数を計算できます。こちらの表を表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。

ディスカッション

EV分野の根本的な課題は、EVサブタイプ²の多種多様を分離することです。ここで説明する方法は、濾過、微分遠心分離、およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、〜100nmのEVが以前に外部環境に分泌され、生理学的に関連する通信経路¹⁶において機能することが示されたために、小さなEVの純粋な集団を生成する。サイズ排除クロマトグラフィーを通じて精製されたEVは、これらのEVサブクラスが同様のサイズであるため、エキソソームと小さなマイクロベシクルの混合物であってもよい。脊椎動物のEVサブクラスは、この方法が選択的膜タンパク質マーカーへの結合を通じてEVを分離するので、一般的に免疫沈降によって分離されます。記載された方法は、C.エレガンスEV膜マーカータンパク質の同定を容易にする。したがって、将来的には、類似の免疫沈降法を介して小さなEVサブクラスをさらに分離することが可能になるかもしれない。理論的には、免疫沈降は、大腸菌EVが抗体と相互作用してはならないので、十分に供給されたワームからEVを分離する可能性があります。より大きなEVサブクラス(>200 nm)のタンパク質および遺伝的貨物を同定することに興味を持つ研究者は、0.22 μmのろ過ステップをスキップし、上清ではなくペレットを分析することによってそれを行うことができます。大きなEVのタンパク質と遺伝的貨物の豊富さを明らかにすることは、C.エレガンス分泌物を介して機能する生理学的プロセスのより包括的な理解を確立します。環境に分泌されることに加えて、C.エレガンスEVは組織間で内部的に転送されます。したがって、これらの方法は、C.エレガンスEVのサブセットのみを分離します。しかし、EVとリズドワームを分離する方法がないため、内部EVの貨物発見は不可能です。この外部に分泌されたEVサブセットの貨物分析は、内部EVを標識できる潜在的な一般的なEVタンパク質マーカーを同定する手段を提供する。

EV製剤の規模は実験の要求に依存する。合計50万人の若年成人が、フローサイトメトリー、LC-MS-MS、RNAseq分析を並行して行うのに十分なEVを提供しています。この数値は、実験のニーズに応じてスケールアップまたはスケールダウンできます。スケールアップの最大の実用的な要因は、必要な10cmの高成長プレートの数です。500 μLの20倍の濃縮一晩NA22培養で調製された高成長プレートは、L1幼虫期から成人期の初日まで約50,000人の成人の集団をサポートします。そこで、500,000人の成人を対象に実験を行うためには、L1の集団を生成する1つのプレート、漂白用の成人を生成するプレート2つ、実験動物の成長のための10プレートの13の高成長プレートが必要です。これらの指標は、高成長プレートの播種および細菌増殖条件に依存しています。したがって、すべてのプレートを標準化された方法で作り、既知の量の動物とキャリブレーションすることをお勧めします。

ワームは、栽培プロセス中に2段階でカウントされます:1)プレートにワームを播種する前に、2)条件付けされた培地を生成する前に。動物栽培密度は、行動、発達、およびストレス応答に影響を与えることを示されている¹⁵15、16、17、18、したがって、EV貨物にも影響を与える可能性があります。^,16,17,18したがって、一貫した栽培密度のためには、ワーム集団を正確に推定する必要がある。9滴でのワームの数を定量化することは、人口推定の統計的な信頼を与える。各ドロップを個別に処理し、各ドロップ間の渦を、ピペットを同じ距離にワームサスペンションに挿入することが不可欠です。これらの予防措置を講じて、総人口の5~10%のS.E.M.値が保証されます。ワーム集団のS.E.M.が20%を超える場合、何かが苦しくなりました。

24時間の細菌を含まない培養期間の後、若い野生のC型エレガンスは、細菌の芝生に加えてすぐにクロールします。これは、インキュベーションが彼らの健康に深刻な影響を与えないことを示しています。しかし、このステップは動物の生理学に影響を与えるので、EV貨物の組成に影響を与える可能性があります。したがって、非常に病気の遺伝子型または古い動物を扱う場合、インキュベーションステップ後の生存率を確認することが不可欠である。すべての動物がインキュベーションを生き残っていない場合は、実験集団のサイズを増加させ、インキュベーションの時間を短縮します。大量のコンディションメディアを扱う場合、再生ニトロセルロースでできたフィルターを用いて攪拌細胞濃縮器を使用する方が実用的です。EVは、他のフィルタタイプ¹⁴と同じくらい強くこのフィルタケミストリーに結合しません。

調合された培地から回収された全タンパク質と、調製を行うためにインキュベートされた動物の数に対する全タンパク質の比率は有用な指標である。この比率が予想よりもはるかに高い場合、人口推定がオフであったか、または条件付きメディアで動物が死亡して悪化した可能性があります。この比率が予想よりもはるかに低い場合、濃度プロセス中にフィルタ上でタンパク質が失われた可能性があります。FACS メソッドは準備中に EV を直接定量化しますが、このメトリックは、プロセスの初期段階でサンプル異常を強調表示できるため便利です。EV製剤の品質を検証するもう1つの有用な方法は、図4Dに示すように透過型電子顕微鏡である。透過電子顕微鏡のプロトコルは長さのために本方法の記事に正式に含まれていませんが、標準的な方法で行うことができます。少なくとも最初は、EV製剤の品質を評価するためのFACSへの無償の方法として、この種の分析を行うことをお勧めします。最良の結果のために、新たに排出されたフォームバー炭素グリッドを使用し、ウラニル酢酸の代わりに2%ホスホトゥングジン酸でサンプルを染色します。

DI-8-ANEPPSが選択されたのは、EV膜を定量的に標識することが示されているため、ヒト生検試料およびリポソーム²⁵を有する他の一般的なEV色素を上回る。測定は速く、各サンプルの収集時間の3分だけ取る。洗浄剤に敏感なEVの定量化は、EVと固体リポタンパク質凝集体の基本的な物理的な区別を利用するため、直接的な機能的意義を有する。重要なことに、この方法は、総タンパク質の量や非EV凝集体の数の影響を受けず、異なる精製方法を通じて得られたEVを公平に定量することができます。ここで説明するFACS検証EVメトリックは、精製されたEVの生理学的影響を実証する研究に特に役立ちます。また、絶対的なEVの豊富さを研究間で直接比較できるように、FACSの方法論を普遍的なメトリックとして確立するために、一般的にEV分野に利益をもたらす可能性があります。バイタル染料はC.エレガンスEVのラベルも付けることができますが、Di-8-ANEPPSでラベル付けされたEVほど明るくない。

この精製アプローチは、無傷の生きているワームの体の外にあるEVの積極的な分泌を利用します。これにより、C.エレガンスEVは、細胞培養と同様に同等の純度と豊富量で単離することを可能にする、LC-MS-MSおよびRNAEq分析²⁶を介して何百ものタンパク質およびRNA貨物を同定するのに十分な仕様である。したがって、C.エレガンス研究で入手可能な試薬の大規模なライブラリは、EV貨物組成物に対する遺伝的および生理的摂動の影響を調査するために活用することができる。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22 以上 μ;mフィルターユニット	ジェネシー	25-233	トリ
トンX-100	サーモフィ	ッシャーHFH10	これを0.05%に加えてEVを溶解
10cmの高成長プレート	N/A	N/A	ワームの大規模な集団を培養するため
2 L底バッフルフラスコ	サーモフィッシャー4110-2000PK		EVのサイズ排除分離を行うため
40 μmメッシュ	アマゾン	CMY-0040-C / 5PK-05	これを使用して、幼虫のステージ
。mメッシュ	Amazon	CMN-0005-C	これを使用して、L1を他のワームステージから分離します
6 cmの正常な成長培地 ワーム培養プレート	N/A	N/A	ワームの小さな集団を培養するため
Amicon Ultra-15 遠心フィルター 10 kD mwco	MilliporeSigma	C7715	サイズ排除溶出を濃縮するため
Amicon Ultra-4 遠心フィルター 10 kD mwco	MilliporeSigma	C78144	コンディショニングされた媒体を濃縮するため
Apogee		A50 フローサイトメーター	このフローサイトメーターは、ナノメートルサイズの粒子の分離に特化しています
ApogeeMix	Apogee	1493	の光散乱および蛍光性能の評価
			これを20 uMで追加してEVの使い捨て
クロマトグラフィーカラム	をラベル付けしますBioRad	7321010	EVのサイズ排除分離の実施用
Geletin	MilliporeSigma	G9391-100G	線虫が付着しないようにピペットチップを処理するため
HALTプロテアーゼ阻害剤	ThermoFisher	87785	タンパク質分解を防ぐためにEVサンプルに追加
低タンパク質結合収集チューブ	ThermoFisher	90410	EVサンプルにこれらを使用する
NaCl	シグマ	S7653-1KG	ワームのショ糖浮遊用
S 基礎緩衝器	N/A	/A	WormBookのレシピ
セファロース CL-2B 樹脂	ミリポアシグマ	CL2B300-100ML	EVのサイズ排除分離を行うため
小型オービタルシェーカー	ABCサイエンティフィック	83211301	ワームSに使用 基礎インキュベーション
ショ糖	シグマ	S8501-5KG	ワームのショ糖浮遊用