遺伝子発現プロファイリングのための修飾法による穀物種子からの高品質なトランスクリプトームデータの取得

サマリー

穀物の転写物プロファイリングの方法を提示する。マイクロアレイベースの遺伝子発現プロファイリングは、高品質の全RNAを穀物から分離することから始まり、cDNAの生成を続けています。cRNAラベリングとマイクロアレイのハイブリダイゼーションの後、シグナル検出と品質管理のための推奨事項が与えられます。

要約

遺伝子発現の特性はRNAの品質に依存します。発芽、開発、成熟した穀物種子では、高品質のRNAの抽出は、しばしば高デンプンおよび糖度によって妨げられる。これらの化合物は、抽出された全RNAの収率および品質の両方を低減することができる。総RNAの量と質の低下は、その後、下流のトランスクリプトミック分析に大きな影響を与える可能性があり、検査対象のサンプルの遺伝子発現プロファイルの空間的および/または時間的変動を正確に反映していない可能性があります。本プロトコルでは、穀物の全トランスクリプトーム分析に使用するのに十分な量と質を持つ全RNAの抽出に最適化された方法を説明する。記載された方法は、発生、発芽、および成熟した穀物種子の転写プロファイリングに使用されるいくつかの下流用途に適している。マイクロアレイプラットフォームを用いた転写法のプロファイリング方法を示す。この方法は、特に記載されたゲノム配列を有する穀物の遺伝子発現プロファイリング用に設計されている。マイクロアレイ処理から最終品質管理までの詳細な手順について説明します。これには、cDNA合成、cRNAラベリング、マイクロアレイハイブリダイゼーション、スライドスキャン、特徴抽出、データ品質検証が含まれます。この方法で生成されたデータは、発芽中、穀物の発達の様々な段階で、または異なる生物的または生理学的ストレス状態で穀物のトランスクリプトームを特徴付けるために使用することができる。ここで示す結果は、微分発現遺伝子(DEG)の決定、遺伝子調節ネットワークの特徴化、トランスクリプトーム全体の関連研究(TWAS)の実施など、下流のバイオインフォマティクス分析に適した高品質のトランスクリプトームデータを例示しています。

概要

トランスクリプトームは、特定の時点で、特に環境および成長条件において、生物のゲノムによって発現されるリボ核酸(RNA)転写物の完全なセットを表す。各細胞は、その現在の生理学的および代謝状態を反映する個々のトランスクリプトームを有する。一般的な転写研究では、類似した組織や器官に由来する細胞の集合が用いられるが、単一細胞および空間的に分解されたトランスクリプトミクスは人気^{を集めている。}トランスクリプトーム解析は、特定の時点で、定義された成長条件で、選択した組織からRNA全体を抽出することから始まります。この目的のために、我々は、穀物種子²のような澱粉または糖度の高いサンプルから総RNAを抽出するための新しく開発された方法の使用をお勧めします。異なるサンプル間でトランスクリプトを比較すると、異なる存在量のRNA分子の同定が得られます。これらのRNA分子は、遺伝子(DEG)を差し出して発現していると考えられる。特定のマーカー遺伝子に由来するトランスクリプトの豊富さは、発達状態を推定したり、環境変動に対する生物の応答を決定するために使用することができます。研究中の発達時のポイント全体で転写産物の豊富さが検出可能な変化を有しない遺伝子は、しばしば基準遺伝子またはハウスキーピング遺伝子として使用される。

RNAは通常、ノーザンブロッティングや定量的な逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)などの様々な方法で検出および定量化されますが、現在のハイスループットトランスクリプト法は、マイクロアレイ技術とRNAシーケンシング(RNA-Seq)を使用した核酸ハイブリダイゼーションに大きく依存しています。RNA-Seq は、他の場所でレビューされた高スループットのトランスクリプトアプリケーションに対していくつかの利点を提供するため、現在では非常に人気^{があります3,,}4 .古い技術ではあるが、マイクロアレイチップを用いた遺伝子発現プロファイリングは、バイオインフォマティクスのバックグラウンドを必要とするより確立された技術であるため、依然として広く使用されている。RNA-Seqと比較して、マイクロアレイ実験から生成されたデータセットは小さく、分析が容易です。また、特にサンプル数が多い場合は、コスト効率が高くなります。当研究室では、マイクロアレイ技術を用いたトランスクリプト分析を日常的に用い、穀物^,,,,65,6,7,8,9の成長・発達・代謝に関与する分子ネットワークや経路を支配する中央制御ハブ⁵の役割を決定しています。⁷⁸⁹また、ゲノム全体の遺伝子発現プロファイリング研究を行い、非生物的ストレス¹⁰に対する穀物の反応の機械学的理解を得るとともに、穀物の品質^{と栄養を,}担う遺伝子を同定するためのトランスクリプトームワイドアソシエーション(TWAS)およびリンケージマッピング研究の実施に使用^{しています。}他の^,グループはまた、大麦^{13、米14、15、16、ソルガム17、および小麦18}での開発特異的遺伝子発現アトラスを¹⁷提供する際にマイクロ¹⁸アレイ技術を使用している。^14,1516

本稿の目的は、Agilentマイクロアレイプラットフォームを用いた穀物の転写プロファイリングのために現在研究室で採用している方法の簡潔な説明と詳細な視覚的説明を提供することです。他のマイクロアレイプラットフォームは利用できますが、この方法ではカバーされません。我々は、穀類種子の開発または発芽からのRNA抽出の詳細な説明を提示することによってプロトコルを開始する。当社の経験に基づいて、下流のトランスクリプトーム分析に適した高品質で大量のトランスクリプトームを得ることは、穀物種子組織を使用する際のボトルネックであることが多い。我々はいくつかの市販のRNA抽出キットを試しましたが、満足のいく結果を提供するものはありません。そこで、市販のキットを用いてカラム精製を行う粗RNA抽出液を得るための化学抽出プロトコルを開発しました。この方法を用いて、我々は、トランスクリプトームプロファイルを生成するために異なる下流アプリケーションに使用することができる高品質のRNA²⁽図1)を日常的かつ再現的に得る。

プロトコル

1. トータルRNA抽出と精製

注:この方法は有害な揮発性有機溶剤の使用を含むので、常にヒュームフードの下で動作します。実験を開始する前に、50°Cのヒートブロックでヌクレアーゼフリー水のミクロフュージチューブを事前に温めます。このヌクレアーゼを含まない水は、ステップ1.8のスピンカラムからRNAの総量を溶出するために使用されます。

1. 別々にサンプルを粉砕し、それぞれに少なくとも3つの生物学的複製を有し、液体窒素中で予冷された殺菌モルタルおよび害虫を用いて微粉末にする。
   1. 液体窒素に浸した小さな金属ヘラを使用して粉末サンプルをすくい、2.0 mLヌクレアーゼフリーマイクロフュージチューブに粉末サンプルを入れ、液体窒素にもあらかじめ浸します。バッチRNA抽出(STOP POINT)に割り当てられた日まで、すぐに超低温冷凍庫(-80°C)にサンプルを保管してください。
      注:種子サンプルは、脱フスキングの有無にかかわらず、細かい粉末に粉砕することができます。米では、huskには粉砕プロセス中に役立つシリカが含まれているため、デフスキングなしでサンプルを日常的に粉砕しています。
      注意:このステップは、厳しく極低温条件下で迅速に行う必要があります。自動化のための1つの選択肢は、RNAの劣化と品質劣化を最小限に抑えるために極低温ボールミルを使用してサンプルを粉砕することです。
2. 元の粉末サンプルの約200mgを用いて粗RNA抽出物を得る。750 μLのRNA抽出バッファー(100 mMトリ、pH 8.0、150 mM LiCl、50 mM EDTA、1.5% SDS、1.5%2-メルカプトエタノール)、および500 μLのフェノール:クロオホルム:24を含むヌクレアーゼフリーマイクロフュージチューブに各サンプルを個別に加えます。
   1. 高速に設定されたマルチチューブボルテックスミキサーを使用して、室温で5分間、すべてのサンプルを同時に混合します。すぐに2分間氷の上にすべてのチューブを保ちます。
      注意:特にフェノール、クロロホルム、その他の有機溶剤を含むすべてのステップのために、常にヒュームフードの内側で動作します。理想的には、1つのベンチトップ遠心分離機、渦ミキサー、マルチチューブ渦ミキサー、およびマルチチューブロータリーミキサーを収容できる広いヒュームフードを使用してください。
3. 粗RNA抽出物を14,000xgで遠心分離して10分間、破片gから分離します。このセクションで同じ設定で、すべての遠心処理手順を実行します。
   1. 上清の約800 μLを、400 μLの1.2 M NaClと700 μLのイソプロパノールを含む新しい2.0 mLマイクロフュージチューブに移します。反転5倍で溶液をやさしく混ぜます。
   2. 通常の(-20°C)または超低温冷凍庫(-80°C)で、少なくとも1時間(または一晩)にインキュベートすることによってRNAを沈殿させる。
      停止または一時停止ポイント:ちょうど数時間一時停止するために、通常の-20°C冷凍庫にサンプルを保ちます。夜間またはより長い停止点については、極低温冷凍庫(-80°C)にサンプルを保管してください。
4. 18,800 x gで15分間遠心分離により粗RNAペレットを得る。上清を捨て後、ミニキット(材料表)を用いてカラム精製により粗RNAペレットを精製する。
   1. ペレットを RLT バッファーの 450 μL を新たに調製した 450 μL に溶解します(使用前に、RLT バッファーの 100 mL あたり β-メルカプトエタノール 100 μL を加え、新鮮な毎日を調製します)。少なくとも5分間のマルチチューブ渦ミキサーで室温で全てのチューブを混合することにより、すべてのペレットの溶解を高めます。
5. 2 mLのコレクションチューブで紫色のミニスピンカラムを通過させることにより、溶存RNAペレットを精製します。9,000 x gで1分間室温で遠心分離し、紫色のミニスピンカラムを捨てます。
   1. 2 mLの回収チューブで、クリアしたライセートに0.5ボリュームの絶対エタノール(約225μL)を加えます。同じプラスチックチップを使用して、溶液を数回上下にピペットで混ぜます。
6. 2 mLのコレクションチューブを用いて溶液をピンクのミニスピンカラムにすぐに移すことで、精製したRNAを回収します。ピンクミンスピンカラムのシリカ膜にRNAを集めるために15sの9,000 x gの遠心分離機。流れを廃棄し、15 sの9,000 x gで遠心分離により350 μLのバッファーRW1でRNAを洗浄します。
7. 80 μLの希釈DNase 1(DNaseセットを使用して凍結DNaseストック50 μL + 350 μLのRDD)を膜に直接加えて、汚染ゲノムDNAを除去し、少なくとも15分間室温でインキュベートして消化します(ポーズポイント)。
   1. 350 μLのRW1を加えてDNase 1を洗い流し、9,000 x gで15秒回転します。新しい2 mLコレクションチューブに移し、9,000 x gで回転して2分間乾燥させます。
8. 乾燥したスピンカラムを新しい1.5 mLヌクレアーゼフリーコレクションチューブに移します。50 μLのヌクレアーゼフリー水(50°Cで前温め)を加え、50°Cのヒートブロックで3分間インキュベートすることにより、精製されたRNA抽出物の溶出プロセスを開始します。
   1. インキュベーション後、9,000 x gで遠心分離して全RNA抽出物を1分間溶出し、すべてのサンプルを氷の上に置きます。
9. それぞれのメーカープロトコルを使用して、ナノドロップとBioAnalyzerで適切な希釈液(通常は1:10)を実行することで、RNA抽出物全体の量と品質を決定します。RNA抽出物は、少なくともRIN値が8.0で、濃度が50ng/μLである必要があります。
   ストップポイント: 使用するまで-80 °Cでサンプルを保管してください。

2. cDNA合成に続いてcRNA転写と標識

注: このステップは24サンプルを同時に処理するのに適しています。ステップ全体が1日で連続して行われるのが推奨されますが、オプションの停止ポイントと一時停止ポイントが特定されます。以下のステップを開始する前に、80°C、65°C、および37°Cで3マイクロフュージチューブヒートブロックを事前に温めておくようにしてください。これらの温度設定は、以下の手順で説明したように変更されます。たとえば、37 °C のヒートブロックは、スパイク ミックスの準備後 (または既に準備されている場合) 40 °C に設定されます。メーカーの指示に基づいて、低入力クイックアンプ遺伝子発現ラベリングキット(表を参照)を使用して、1色のスパイクミックス、T7プロモーターミックス、cDNAマスターミックスを準備します。この調製物は、開始RNA抽出物の量に依存し、これは通常、全RNAの場合は10〜200 ng、ポリARNAの場合は5ngの範囲である。マイクロアレイハイブリダイゼーション²の出発物質として、また以下に説明する方法については、50ngの全RNAを日常的に使用しています。24サンプルのマスターミックスを準備する際に、ピペッティングバリエーションを考慮して2つの余分な反応を追加します。このステップでは、ヌクレアーゼを含まないマイクロフュージチューブとヌクレアーゼを含まない水を常に使用してください。

1. 高収率のため、通常、50〜100 ngの範囲内に収まるようにRNA抽出物を100倍希釈する。ステップ1.9のRNA定量結果に基づいて、精製されたRNA抽出物を1.5 mLマイクロフュージチューブ内のヌクレアーゼフリー水に1μL加えて1:100希釈します。ナノドロップを使用して、この希釈の実際の濃度を決定します。
   1. 1.5 mLマイクロフュージチューブ内の各RNAサンプルを2回目に希釈して、最終体積1.5μLの合計RNAの50ngを作ります。
2. メーカーの指示に基づいてスパイクミックスを準備します。このステップは、2019^年のプフフェルトらにも要約されている。37 °Cのヒートブロックを使用します。1色のスパイクミックスの1番目と2番目の希釈を超低温冷凍庫(-80°C)に入れ、8回の凍結/解凍サイクルを繰り返すだけです。
   1. 新鮮な新鮮な3番目と4番目の希釈を毎日準備します。使用前に氷の上にスパイクミックスの3番目と4番目の希釈を解凍して保存してください。
      注:スパイクミックスが準備されていた(または以前に準備された場合)37°Cヒートブロックの温度を40°Cに変換してください。
3. T7プロモーターミックスを準備し、使用する前に氷の上に保存します。24 サンプルでは、次の方法で十分です。
   T7プロモータープライマーの20.8 μL
   + 26.0 μL のヌクレアーゼフリー水
   = 総容積T7プロモーターミックスの46.8 μL
4. ステップ2.1から1.5 μLの50 ng RNAサンプルを含むマイクロフュージチューブにT7プロモータープライマーミックス(ステップ2.3)を1.8 μL加えます。ピペットで適切に混合します。65°Cのヒートブロックで10分間インキュベートしてRNAテンプレートプライマーミックスを変性させ、次のステップに備えてマイクロフュージチューブを氷の上に置きます。
5. テンプレートプライマーミックス(ステップ2.4)を変性しながら、メーカーの指示に基づいて、80°Cで5xファーストストランドバッファを少なくとも4分間事前に温めます。 Table of Materials以下は24の反応のために十分です:
   52.0 μL のプレウォームド 5x ファーストストランドバッファ(ステップ 2.5)
   + 26.0 μL 0.1M DTT
   + 10 mM dNTP ミックスの 13.0 μL
   RNase ブロックミックスの + 31.2 μL
   = 122.2 μLの全容cDNA合成マスターミックス
   1. 氷の上の各成分を解凍します。各成分を穏やかなピペットで混ぜます。マスターミックスは使用前に室温で保管してください。
      注意:RNaseブロックミックスは、使用後すぐに-20°Cの冷凍庫に戻す必要があります。
6. 氷上のRNAテンプレートプライマーミックス(ステップ2.4)と遠心分離機を室温で短時間取り除き、すべての内容物をマイクロフュージチューブの底まで回転させます。各チューブにcDNAマスターミックス(ステップ2.5)の4.7 μLを分配し、上下にピペットを入れて慎重に混合します。すべてのコンポーネントが追加されたときの総容量は8.0 μLである必要があります。
   1. 40°CのヒートブロックでcDNAを2時間合成します。2時間のインキュベーション中に、65°Cのヒートブロックの温度を、不活性化に備えて70°Cに移します(ステップ2.7)。
      オプションのポーズポイント:サンプルを-80 °Cで一晩保管します。実験は、熱不活性化の翌日に継続することができる(ステップ2.7)。
7. 各チューブを70°Cのヒートブロックで15分間インキュベートし、RNaseブロックミックスを加熱不活性化します。すぐに氷の上にチューブを移し、少なくとも5分間インキュベートします。
8. サンプルが5分間氷上にある間(ステップ2.7)、すぐに転写マスターミックスを準備します。すべてのコンポーネントは室温で組み合わせることができますが、氷上のコンポーネントを解凍することができます。24 サンプルでは、次の方法で十分です。
   ヌクレアーゼフリー水 19.5 μL
   + 83.2 μL 5x転写バッファー
   + 0.1M DTTの15.6 μL
   + 26.0 μL の NTP ミックス
   + 5.5 μL の T7 RNA ポリメラーゼ ブレンド
   + 6.2 μL の シアニン 3-CTP (Cy3)
   = 総容積の156.0 μL の転写マスターミックス
   注意:T7 RNAポリメラーゼブレンドは-20°Cのフリーザーに保管し、使用後すぐに戻す必要があります。また、Cy3は光に敏感である。したがって、混合(ステップ2.9)と分配(ステップ2.10)は、低照度条件で行う必要があります。このために、我々は通常、ラボベンチの真上の任意の光をオフにします。
9. チューブを急激な加熱および冷却(ステップ2.7)に供した場合、マイクロ遠心分離機を用いて各サンプルの内容物を簡単にスピンダウンし、各マイクロフュージチューブの底面にある液体をすべて回収します。6 μLの転写マスターミックス(ステップ2.8)を加え、上下に軽くピペットを加えます。この反応の総体積は、この段階で16μLでなければなりません。40°Cで2時間インキュベートし、Cy3標識cRNAを生成します。
   任意停止点:管は転写後-80 °Cで貯えることができる。
10. cRNAを発生させながら(ステップ2.9)、ヒートブロックの温度を55°Cに設定します。ヒートブロックにヌクレアーゼを含まない水のマイクロフュージチューブを少なくとも1つ加えます。このヌクレアーゼを含まない水は、精製されたcRNAの溶出に使用されます。
11. cRNA転写および標識後、RNeasyミニキットを使用して標識されたcRNAをステップ3で詳述したとおりに精製します。

3. cRNA精製

1. RNeasy ミニキットを使用してラベル付き cRNA を精製します (材料表を参照)。製造元の指示に基づいてバッファを準備します。例えば、バッファー RPE は、濃縮された形でキットに供給されます。使用前に、分子生物学グレードの絶対エタノール(96-100%)を4巻加えます。
2. 各サンプルに84μLのヌクレアーゼフリー水を加えて、総体積を100μLに調整します。その後、各チューブに350 μLのバッファRLTと250 μLの絶対エタノールを加えます。ピペットで十分に混ぜます。
3. 各混合物の700 μLを2 mLのコレクションチューブが付いているミニスピンカラムに移します。標識されたcRNAを膜上に集め、4°Cで7,534 x gで30sの遠心分離を行います。フロースルー液体を廃棄します。
4. 各サンプルを500 μLのバッファRPEで洗浄します。前の手順と同様に、遠心分離機と廃棄フロースルー。この手順を 1 回繰り返してから、次の手順に進みます。
5. ミニスピンカラムを新しいコレクションチューブに移します。ステップ3.3のように遠心分離でサンプルを乾燥させます。
6. キットに付属のヌクレアーゼフリー1.5 mLマイクロフュージチューブにミニスピンカラムを移します。30 μLのヌクレアーゼフリー水(55°Cで事前に温める)を膜フィルターに直接加えて、各標識cRNAサンプルを直接膜フィルターに加えます。55°Cのヒートブロックで60sのインキュベートを行い溶出を強化します。
7. 7,535 x gで30 sの室温で遠心分離によって標識されたcRNAを収集する。スピンカラムを捨てて、各マイクロフュージチューブを閉じます。すぐに各チューブを氷の上に置きます。
   任意停止点:サンプルは溶出後-80 °Cで貯えることができる。
8. マイクロアレイ機能を使用してナノドロップでcRNAを定量化します。サンプルをRNA-40にセットします。以下の値を取得し、スプレッドシートに記録: シアニン 3 色素濃度 (pmol/μL),RNA 吸光度比 (260 nm/280 nm), および cRNA濃度 (ng/μL).
   ストップポイント:読み取り後、cRNAサンプルを-80°Cですぐに保存します。
9. pRNA収率と特定活性を、プフフェルトら 2019^2.に詳述されているように計算する。

4. マイクロアレイのハイブリダイゼーションとスキャン

注:このステップは3-4時間しかかからず、昼食後に24サンプルのハイブリダイゼーションを開始することができます。1人のオペレータは4枚までのスライド(32サンプル)まで快適に走ることができる。翌日の朝はマイクロアレイスライドの洗浄とスキャンに割り当てられます。その後、2日目の午後に追加の実行を実行できます。このステップは、すべてのサンプルがハイブリダイズされ、スキャンされるまで繰り返されます。サンプルがマイクロアレイ分析を妨げる色付きの顔料で汚染されないように、スライドの処理と処理に無色のパウダーフリーラテックス手袋を使用することを強くお勧めします。市販のマイクロアレイとは別に、 以下のカスタム配列は、当社のグループによって設計されており、Agilentから注文可能です: 大麦のための注文コード 028827 (Hordeumvulgare), 054269 米のための (TriticumaestivumOryzasativa潜水艦ジャポニカ), 054270 米のための (Oryzasativaサブスインチカ) と 048923

1. 遺伝子発現ハイブリダイゼーションキットを使用してマイクロアレイハイブリダイゼーションを実行します(材料表を参照)。メーカーの仕様²に従って10倍のブロッキングエージェントを準備します。アリコート200 μLの部分に10xブロッキング剤を、使用するまで-20°Cで保存します。各アリコートは最大40のハイブリダイゼーションに十分であり、2ヶ月まで安定しています。
2. マイクロアレイハイブリダイゼーションに割り当てられた日に、氷上の10xブロッキング剤の200μLアリコートを解凍します。また、ハイブリダイゼーションオーブンを65°Cに予温し、cRNA断片化時に使用するためにヒートブロックを60°Cに予め温めます。
3. 製造元²の説明に従って、各サンプルに対してフラグメンテーション ミックスを準備します。私たちの研究室では、8パックマイクロアレイでのハイブリダイゼーションに600ngの線形増幅Cy3標識cRNAを日常的に使用しています。この場合、以下のリストは、サンプルごとのフラグメンテーション ミックスのコンポーネントをまとめたものです。
   600 ngの直線的に増幅されたcRNA、シアニン3標識
   + 5 μLの10xブロッキング剤
   ヌクレアーゼを含まない水で24μLに音量を調整
   + 25x フラグメンテーション バッファの 1 μL
   = 総ボリュームフラグメンテーションミックスの25 μL
   1. 渦ミキサーを使用してサンプルを穏やかに混ぜます。マイクロ遠心分離機を使用して、すべてのサンプルを簡単に回転させます。
4. 60°Cヒートブロック内のすべてのサンプルを正確に30分間インキュベートし、氷上の各チューブを1分間すぐに冷却してから、すぐに次のステップに進みます。
5. 断片化反応を完全に停止するには、各チューブに2倍のGExハイブリダイゼーションバッファHI-RPMを追加します。上下にピペットを入れて軽く混ぜ、混合中に泡を導入しないように細心の注意を払ってください。我々は、8パックマイクロアレイフォーマットの断片化反応を止めるために、25μLのハイブリダイゼーションバッファを日常的に使用しています。
6. 遠心分離機周囲室温で15,750 x gで1分間すべてのチューブ。すべてのチューブを素早く氷の上に置き、各サンプルをできるだけ速くロードします。
7. 17時間の夜間インキュベーションのためにラボを出る前に、ビデオに詳述されているようにハイブリダイゼーションアセンブリ²を準備する。
   1. クリティカルステップ:各ハイブリダイゼーションミックスを移し、各ガスケットの中央でゆっくりと分配し、分配中に気泡を導入しないように細心の注意を払って観察します。8パックマイクロアレイ形式では、44 μLのハイブリダイゼーションミックスを日常的に使用しています。また、未使用のウェルに44 μLの1xハイブリダイゼーションバッファを配置します。
   2. ガスケットスライドの上に正しい方向のマイクロアレイスライドを直ちに置きます。これは、液体をこぼさないために非常に慎重に行う必要があります。ハイブリダイゼーションアセンブリをしっかりと閉じ、回転させて、永久気泡が導入されていないかどうかを確認します。すべての気泡はガスケットスライド内で移動する必要があります。
8. ハイブリダイゼーションチャンバーアセンブリをハイブリダイゼーションオーブン回転器に入れます。2x GExハイブリダイゼーションバッファを使用する場合は、回転速度を10rpmに設定し、65°Cでハイブリダイズして17時間をとってください。
9. 遺伝子発現洗浄バッファーキットを使用してハイブリダイズされたマイクロアレイを洗浄します(材料表を参照)。メーカーの指示に基づいて遺伝子発現洗浄バッファー1と2を準備^{します 2}.20% Triton X-102 の 2 mL を両方のバッファーに追加します (純粋に任意ですが、マイクロアレイの洗浄アーティファクトの発生率を減らすために強く推奨)².
10. 前の出版物²で詳述したように3つの洗浄室アセンブリを準備する。各洗浄室の詳細は以下に表に記載されている(表1)。
11. 1L試薬ボトル内の洗浄緩衝液1のアリコート500mLを、周囲室温で放置する。1個のL試薬ボトルを追加準備し、最初のチャンバーから洗浄バッファーを保存するために「洗浄バッファー1再利用」とラベルを付けます。さらに、試薬ボトル内の洗浄緩衝液2のアリコート500mLを、一晩37°Cの水浴中にインキュベートする。
    注: 手順 4.9 ~ 4.11 を準備せずにラボを終了しないでください。彼らは、次の日に洗浄ステップのために必要です。
12. 翌日、表2に詳述されているように洗浄バッファを準備する。各皿を対応するバッファの4分の3に充填します。各洗浄バッファーは4-5スライドまで良いです。
13. ちょうど17時間のハイブリダイゼーションの後、1つのハイブリダイゼーションチャンバーを取得し、前の出版物²で詳述したように、糸くずのない紙が並ぶラボベンチで分解する。
    1. クリティカルステップ:マイクロアレイサンドイッチをディッシュ1に移します。マイクロアレイバーコードが傾斜した位置で上向きになっていることを確認し、スライド全体をバッファーに入れないようにします。各マイクロアレイスライドを両端から取り扱い、スライドのアクティブな側面に触れないようにします。
    2. 鉗子2を使用して2つのガラススライドを^{分離します。}ガスケットをディッシュ1の底にそっと落とすと同時に、マイクロアレイスライドが次のステップに向けてしっかりと保持されるようにします。
14. クリティカルステップ:マイクロアレイスライドを横にゆっくりと持ち上げ、前の出版物²で詳述したように、皿2のマイクロアレイラックにすぐに移します。マイクロアレイスライドが空気にさらされることは非常に重要です。
    1. 8 つのスライドがラックに入るまで、ステップ 4.13 と 4.14 を繰り返します。マイクロアレイスライドをラックに沿って均等に分散します。このステップは、最大4枚のスライドに対して、1人のオペレータが無援助で行うことができます。ラックホルダーを取り付け、ディッシュ2のセットアップ全体を最初の磁気攪拌機に移します。1分間ゆっくりかき混ぜます。
15. 1分間攪拌しながら(ステップ4.14)、ミニ37°Cインキュベーターからディッシュ3を移し、2番目の磁気攪拌機の上に置きます。洗浄バッファー 2 (37 °C の水浴から) を皿 3 にそっと置きます。注ぎ込み中は泡の形成を避けてください。
    1. 1分撹拌が完了した後(ステップ4.14)、スライドラックをディッシュ2からゆっくりとゆっくりと持ち上げ、ディッシュ3に移します。ラックホルダーを取り外し、1分間かき混ぜます。
16. スライドラックを皿3からゆっくりとそっと持ち上げます。バッファー液滴の形成を避けるようにしてください².糸くずのない紙にそっと触れて、各スライドの側面を乾かします。各ブロット乾燥スライドをスライドボックスに入れ、すべてのマイクロアレイスライドがスライドボックスに入るまでステップ4.16を繰り返します。約15分間乾燥します。
    オプションの停止点
17. 各マイクロアレイスライドをスライドホルダーに配置し、バーコードが上向きであることを確認します。
    メモ:マイクロアレイ室内のオゾンレベルは50 ppb(100 μg/m³⁾以下にする必要があります。これは純粋に任意ですが、強くお勧めします:オゾンバリアスライドカバーを使用して、シアニン染料のオゾンによる劣化を避けてください。
18. 組み立てたスライドホルダーをスキャンカルーセルに入れる。バーコード番号に基づいてサンプルを順番にロードします。前の資料²で詳しく説明したように、マイクロアレイ スキャナ (資料表を参照) を使用して、スライドを直ちにスキャンします。
19. 実行後、前の文書²で詳しく説明したように、データを特徴抽出と QC 検証の対象にします。

結果

この方法は、汚染デンプンまたは糖の大量を含む穀物種子サンプルを抽出するために最適化されています。1日24種のサンプルから総RNAを抽出するように設計されています。1 日で連続的に実施する必要がありますが、オプションの停止ポイントと一時停止ポイントはプロトコル全体で識別されます。あるいは、読者は、好みのRNA抽出キットまたは手動の化学的抽出方法を使用することができます。しかし、当社のこれまでの経験に基づいて、市販の植物RNA抽出キットは、大量のデンプン、タンパク質、糖および/または脂質汚染のために種子に適していません。記載された方法では、粗RNAの化学的抽出は、市販のRNA抽出キットを用いたカラム精製を続けた。これは通常、より高い品質と収率を持つRNAを提供します。図 1は、ここで説明する方法を使用して RNA 抽出の品質をテストする BioAnalyzer の実行結果を示しています。結果は、大麦葉(サンプル1および2は低デンプン含有量サンプルを表す)と大麦の種子(サンプル3および4は高デンプン含有量サンプルを表す)に対して提示される。すべてのサンプルの RNA 完全性 (RIN) 値は 10 です。

図1は、バイオアナライザを用いて品質を試験した精製RNA抽出物の代表的なゲルを示しています。サンプル1および2は、葉っぱ葉のような低デンプン含有量サンプルの典型的な結果であり、葉芽細胞からの追加のrRNAバンドが明らかである。サンプル3および4は、大麦種子などの高デンプン含有量サンプルの代表的な結果であり、18Sおよび28S rRNAを示す。葉緑体rRNAによる葉試料などの緑色の植物組織に対して、自動RIN値を計算することはできません。しかし、完全性と高品質は、一般的に低分子スミアとして見える任意の分解産物の不在によって視覚的に確認することができます。大麦種子などの高デンプン種子サンプルのRIN値は、通常、この論文に記載されているプロトコルを使用して10である。

また、麦芽の品質¹⁹の分析に用いられる2つのエリート大麦近交系(ソフィアラとビクトリアナ)のタイムコース実験の代表的なデータもここで提示する。麦芽の過程で、でんぷんは砂糖に変換されます。したがって、サンプルはデンプンと糖分の様々な割合を有する組織を表す。工業用麦芽工程は発芽過程と類似しているので、麦芽の品質が異なる2つの大麦ラインの転写法を分析した。RNAは、生物学的トリクレート中のインビビションの後、2、24、48、72、120、144および196時間で発芽種子から抽出された。カスタマイズした大麦マイクロアレイチップに対するRNA調製およびハイブリダイゼーションを、上述のように行った。図2は、品質管理(QC)レポート(図3)と検出信号のヒストグラムプロットで示されているマイクロアレイハイブリダイゼーションから読み出された正規化されたグリッドを示しています。グリッドは、キャリブレーションに使用されるバックグラウンドとスパイクイン読み出しドットを含む、チップの各コーナーからの誘導信号の例を示します。ヒストグラムは、検出可能なドットの偏差とそれぞれの信号強度を示します。ハイブリダイゼーションが成功すると、図に示すように、わずかな外れ値のみで広いガウス状の曲線が得られます。失敗したハイブリダイゼーションは、片側(「緑のモンスター」)に向かって強いシフトをもたらす可能性があります。

最後に、許容値の代表的な結果を図 3の 4 列目に示します。実施された実験の信頼性を示すために、結果はGeneSpringソフトウェアを用いてさらに評価される。収集されたデータは、主成分分析 (PCA) として表示されます。PCA は、選択したドット (遺伝子) の値をベクターとして統合します。使用される評価されたドットの数は、数百からチップ全体に変化することができ、使用するソフトウェアに依存します。各チップ(サンプル)は、分析されたドットの一体化された信号強度から生じる1つの値(ベクトル)をもたらします。したがって、グラフ(PCA)における相対位置は、サンプル同士の類似性を示す。サンプルが近いほど、類似しています。技術的な複製は生物学的複製よりも近くなければ、異なる時点、組織または条件からのサンプルよりも、サンプルの生物学的複製が一緒に集まるべきです。

図1:バイオアナライザでRNAの品質を確認した後に得られた電気泳動ファイルの実行の概要。試料1および2は、葉緑体からの追加のリボソームバンドによって示されるように大麦葉組織である。サンプル3および4は、18Sおよび28S rRNAバンドを有する大麦種子組織を示す。RINファクターは、葉などの緑色組織について必ずしも計算されるわけではありませんが、ゲルによれば、RNAの品質は非常に良好です。サンプル 3 および 4 の RIN 値は 10 です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:成功した大麦マイクロアレイハイブリダイゼーションからのQCレポート。+ は、チップの全角からグリッド上で検出された信号を示します。ヒストグラムは、バックグラウンド減算後の対数としてシグナル強度(蛍光)に従って分類されたシグナルの数を示しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ハイブリダイゼーションとスキャン後の品質管理(QC)の概要ハイブリダイズされたスライドの値は列 2 (値) に、許容値の範囲は 4 桁目に示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

洗浄チャンバーアセンブリ	コンテンツとラベル	目的
ディッシュ1	空、翌日までラボベンチに置いておく	マイクロアレイスライドを分解するために使用される、翌日のウォッシュバッファ1で埋める
ディッシュ2	マイクロアレイスライドラック1個と小さな磁気攪拌棒を追加します。ラベルは「ウォッシュバッファ1」で、翌日までラボベンチに置いておく	翌日のウォッシュバッファ1でマイクロアレイスライドを洗浄するために使用
ディッシュ3	小さな磁気攪拌棒を1つ追加し、「ウォッシュバッファ2」とラベルを付け、37°Cミニインキュベーターに入れます。	37°Cミニインキュベーター内で、翌日のウォッシュバッファ2でマイクロアレイスライドを洗浄するために使用

表1:洗浄室アセンブリの調製。

手順	料理	洗浄バッファー	温度	時間
分解	1	1	周囲	できるだけ速く
(ステップ4.13)
最初の洗浄	2	1	周囲	1分
(ステップ 4.14)
セカンドウォッシュ	3	2	37°C	1分
(ステップ4.15)

表2:洗浄室アセンブリのインキュベーション温度と時間。

ディスカッション

上記の方法は、高収量および高品質のRNA抽出物に対して非常に再現性の高い結果を提供する(図1)。当社の経験に基づいて、1つの遺伝子型、ステージまたは分析の条件に対して3つの生物学的複製をお勧めします。統計的に有意な差を検出できるようにするには、mRNAの一般的な存在を考慮する必要があります。ただし、RNA抽出工程では、トリプライズに200mgの組織サンプルの開始量が必要であることに注意してください。したがって、遺伝子組み換え植物材料のような限られた量のサンプルを有する実験では、この方法は適切でない場合がある。

マイクロアレイハイブリダイゼーションの際には、(1)ガスケットスライドにサンプルをロードする(ステップ4.7)と(2)ハイブリダイゼーション後にアレイを洗浄する(ステップ4.13および4.14)のステップが最も重要です。サンプルの負荷は、気泡の形成と液体のこぼれを避けるために非常に慎重に行う必要があります。マイクロアレイスライドをロードされたサンプルを含むガスケットスライドに置く場合は注意が必要です:DNA側(斑点のあるプローブを使用)は、ハイブリダイゼーションを可能にするために下向きにする必要があります。マイクロアレイを洗浄する場合、第2の洗浄工程は特に重要である:ここでは、洗浄バッファー2からスライドを取り除くことは、データ取得および分析を妨げる可能性のあるスライド上の緩衝物を避けるために、非常にゆっくりと(10秒)実行する必要がある。

ダウンストリームバイオインフォマティクス解析の対象となるハイブリダイゼーション実験の結果を受け取るには、いくつかの重要な基準に従う必要があります。上記のプロトコルのパフォーマンスの後に生成される QC レポートは、何を改善すべきか、どのデータが使用できる状態にあるかを示します (図3)。最初に受信した情報は、視覚化されたグリッドです (図 2)。ここで、蛍光読み出しのための全領域が適切に整列されているかどうかを直接見ることができる。視覚的に検出可能なシフトがある場合、これは他のすべての値(背景、信号強度など)に影響を与え、このチップの読み出しは使用できません。概要(すべての外れ値の空間分布)では、結果に影響を与えた汚染(例えば、ほこりや髪)を簡単に見つけることができます。チップを柔らかく吹き付け、再スキャンすることで汚れを取り除くことができます。上記のような信号プロットのヒストグラムは、わずかな外れ値だけで、ガウス形の曲線を広くするはずです(図2)。分析した組織(図1)によって、この曲線は異なって見え、2つのピーク、または肩を持つ1つの主要なピークを有するように見えることがある。これはデータの品質に影響を与えない。強いシフトピーク、またはエッジ上の高い信号だけが、洗浄では除去できず、チップメーカーに報告する必要がある「緑色のモンスター」(蛍光強度が高すぎる)などの問題を示しています。また、「中央値シグナルの空間分布グラフ」は、共通の値を中心に変化する必要があります。これは、分析されたチップの一般的な強度読み出しに応じて、40と100の間の範囲でなければなりません。もう一つの重要な品質管理は、データのスパイクの評価です:信号のスパイクのロググラフは、線形および規則的な線をもたらすはずです。最後に、「評価指標」の表は、受信した結果の良好で信頼性の高いビューを示します。ここでは、メーカーは、優れた、良いと評価として分類することができる値の範囲を提供します (図 3).私たちの経験によると、値の一部は常にすべてのチップに適用されるとは限りません。米カスタムチップの場合、「非制御値」は、多くの場合、範囲外であったが、それ以上のデータ処理に大きな影響を与えません。さらに、<80にチップの組織、生物および一般的な出力に基づいて、「NegControl」の範囲を拡張することができる。値 E1 med CV の評価範囲は、当社の経験に従って <8 ではなく 、<9 に拡張される可能性があります。これに続いて、すべてのチップ読み出しデータの適切な評価が可能です。一般に、独立した生物学的複製は常に最も信頼性の高い結果を与える点に留意すべきである。

この手法の利点は、他の方法と比較して、転写プロファイリングのための費用対効果の高い高スループットの方法を表す点にあります。さらに、ダウンストリームデータ分析パイプラインがより簡単で、より確立されています。利点にもかかわらず、解析できる遺伝子の数など、この技術には一定の制限があります。マイクロアレイは、アレイ上で以前に発見されたプローブの分析を容易にするだけです。したがって、この技術は、配列配列されたゲノムおよび完全にアポイントトされた遺伝子を有する植物種にのみ適用可能である。マイクロアレイベースのトランスクリプトミクスは、遺伝子発現プロファイリングだけでなく、遺伝子調節ネットワーク分析やトランスクリプトーム全体の関連研究などの他の下流バイオインフォマティクスパイプラインにも非常に有用で関連性が高いと考えています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ß-メルカプトエタノール	Roth	4227.3	使用直前に 20 mL に 300 ul の RNA 抽出バッファーを追加
バイオアナライザー 2100	Agilent Technologies		RNA抽出物の品質と量を決定するには
砕氷機	さまざまなブランド		サンプル処理中にサンプルを氷上に保持するには
デュワーフラスコ	さまざまなブランド		液体窒素容器として使用
エタノール、絶対	ロス	9065.1
遺伝子発現ハイブリダイゼーションキット	Agilent Technologies	5188-5242	キット コンポーネント: 2X Hi-RPM ハイブリダイゼーションバッファー 25X Fragmentation Buffer 10X Gene Expression Blocking Agent
遺伝子発現洗浄バッファーキット	Agilent Technologies	5188-5325	キットコンポーネント: 遺伝子発現洗浄バッファー1 遺伝子発現洗浄バッファー2 Triton X-102
ブロック	さまざまなブランド		1.5mlチューブ用のヒートブロックと2.0mlチューブ用のヒートブロックを少なくとも1つ用意することをお勧めします
ハイブリダイゼーションオーブン	Agilent	G2545A	マイクロアレイハイブリダイゼーション用に設計されたステンレス製オーブン シェルドン・マニュファクチャリングから、マイクロアレイ内のサンプルを一晩でハイブリダイズするために使用されます。
ハイブリダイゼーションガスケットスライドキット	Agilent	G2534-60014
iQAirエアクリーナー			実験が低オゾン領域で行われるようにするため
イソプロパノール	ロス	9866.5
リントフリーペーパー、キムワイプ	キンバリークラークプロフェッショナル	KC34155
低入力クイックアンプラベリングキット	アジレントテクノロジー	ズ5190-2305	キットコンポーネント: T7 Primer 5x First Strand Buffer 0.1M DTT 10 mM dNTP Mix AffinityScript RNAse Block Mix 5x Transcription Buffer NTP Mix T7 RNA Polymerase Blend Nuclease-free water Cyanine 3-CTP
Metal spatula, small			金属製のヘラがマイクロフュージチューブに収まるようにして、サンプルを簡単にすくい取れるようにします。
マイクロアレイスキャナー	Agilent Technologies		Agilent SureScanまたはAgilent Cマイクロアレイスキャナーが推奨されます
マイクロフュージチューブ、ヌクレアーゼフリー	様々なブランド		2.0mLおよび1.5mL
マイクロ遠心分離機	Eppendorf	5810 R	1.5mlと2.0mlのマイクロフュージチューブをそれぞれ24本ずつ保持できるローターを備えた周囲温度および低温のマイクロフュージを少なくとも1つ用意することをお勧めします
ミニインキュベータ	ーLabnet	I5110-230V	は、どんな小さなインキュベーターでも大丈夫です。
乳鉢と乳棒			液体窒素を使用した極低温粉砕に耐えることができる小さなセラミックまたは大理石の乳鉢と乳棒。
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Nanodrop 1000	Peqlab / Thermofisher
Nuclease-free water	Biozym	351900302
One-Color RNA Spike-In Kit	Agilent	5188-5282	キット コンポーネント: 1色RNA Spike-Mix Dilution Buffer
Ozone barrier slide cover kit	Agilent	G2505-60550	オプションだが強く推奨される
PCRチューブ、0.2 mL、RNaseフリー	Stratagene	Z376426
フェノール:クロロホルム:イソアミル混合物 (25:24:1)	Roth	A156.2
ピペットチップ、ヌクレアーゼフリー、フィルターチップ	様々なブランド		2、20、20、100、200、1000 ulの容量に対応するため
ピペッターセット	様々なブランド		2、20、20、100、200、1000 ul の容量の場合
RNA 抽出バッファー	10 mM Tri-HCl pH 8.0 150 mM LiCl 50 mM EDTA 1.5% EDTA 15 ul/mL β-メルカプトエタノール		私たちは日常的にロスまたはシグマの化学物質を使用しています。β-メルカプトエタノール新鮮な毎日
RNase フリー DNase セット	Qiagen	79254
RNeasy ミニキット	Qiagen	74104	キット コンポーネント: RNeasy ミニスピンカラム (ピンク) 1.5 ml コレクションチューブ 2 ml コレクションチューブ バッファー RLT バッファー RW バッファー RPE ヌクレアーゼフリー水
RNeasy プラントミニキット	Qiagen	74904	キットコンポーネント: RNeasyミニスピンカラム(ピンク) QIAshredderスピンカラム(紫) 1.5 mlコレクションチューブ 2 mlコレクションチューブ バッファーRLT バッファーRLC バッファーRW1 バッファーRPE ヌクレアーゼフリーウォーターDNA
マイクロアレイスキャナー用スライドホルダー	Agilent	G2505-60525
取り外し可能なラック付きスライド染色皿	DWKライフサイエンス 900200	フィッシャーサイエンティフィック 08-812	DWKライフサイエンス ウィートン&トレードをお勧めします。取り外し可能なラック付きガラス20スライド染色皿(皿、カバー、ガラススライドラック付き)
塩化ナトリウム	ロス	P029.1
超低温冷凍庫	さまざまなブランド		80°Cでサンプルを保存できます。C
ボルテックスミキサー	さまざまなブランド		少なくとも 1 つはシングル チューブ ボルテックス ミキサー用で、もう 1 つは複数のチューブをボルテックス混合できます